酶工程復(fù)習(xí)材料

1、1. 酶生物合成的模式有哪些？哪一種模式較為適合生產(chǎn)的需要？對(duì)于其他的合成模式，應(yīng)如何調(diào)節(jié)發(fā)酵的條件以使其更為趨近于最佳的模式？酶生物合成的模式·同步合成型·延續(xù)合成型·中期合成型·滯后合成型同步合成型概念：酶的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，酶大量產(chǎn)生，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶的合成隨之停止。特點(diǎn)：屬于這種類型的酶，其生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏作用。延續(xù)合成型概念：酶的合成伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)而開(kāi)始，但在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡之后，酶還可以延續(xù)合成較長(zhǎng)的一段時(shí)間。特點(diǎn)：這種類型的酶可受誘導(dǎo)但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏，其對(duì)應(yīng)

2、的mRNA是相當(dāng)穩(wěn)定的。中期合成型概念：酶的合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后開(kāi)始，而在細(xì)胞進(jìn)入平衡期后，酶的合成也隨著停止。特點(diǎn)：酶的合成受到反饋?zhàn)瓒簦移渌鶎?duì)應(yīng)的mRNA 是不穩(wěn)定的。滯后合成型概念：只有當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶才開(kāi)始合成并大量積累。特點(diǎn)：酶的合成受到分解代謝物阻遏作用。 在酶工程生產(chǎn)中為了提高酶的生產(chǎn)率，延長(zhǎng)酶的發(fā)酵生產(chǎn)周期，酶最理想的生物合成模式應(yīng)為部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型（延續(xù)合成型），因?yàn)檫@類酶在發(fā)酵過(guò)程中沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)期和產(chǎn)酶區(qū)的區(qū)別，隨細(xì)胞生長(zhǎng)即有酶的產(chǎn)生，直到細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期之后酶還可以合成。對(duì)于其他型的酶，要提高酶產(chǎn)率，可以再細(xì)胞選育上，工藝條件等方面加以條件控制。對(duì)于

3、同步合成型的酶，可以采用適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝，如降低發(fā)酵溫度以盡量提高其對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性；對(duì)于滯后合成型的酶，在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)設(shè)法盡量減少甚至借出分解代謝物阻遏，使酶的合成提早開(kāi)始, 控制葡萄糖等易利用碳源, 添加一定量的cAMP；對(duì)于中期合成型的酶，則要在提高mRNA穩(wěn)定性和解除阻遏兩方面進(jìn)行。控制末端產(chǎn)物濃度,添加末端產(chǎn)物類似物2. 試以基因調(diào)節(jié)控制理論說(shuō)明酶生物合成的分解代謝物阻遏作用、誘導(dǎo)作用及反饋?zhàn)瓒糇饔玫脑怼?基因調(diào)節(jié)控制理論-操縱子學(xué)說(shuō)分解代謝物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶（主要是誘導(dǎo)酶）生物合成的現(xiàn)象酶生物合成的誘導(dǎo)作用是指加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶的生物合成開(kāi)始或加速進(jìn)行的過(guò)

4、程酶合成的反饋?zhàn)瓒糇饔檬侵该复呋饔玫漠a(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的合成受阻的過(guò)程3. 何為酶電極、酶標(biāo)免疫測(cè)定？酶標(biāo)免疫測(cè)定是指在放射免疫測(cè)定的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，它是將酶作為標(biāo)記物質(zhì)，使之和抗原（或抗體）結(jié)合形成酶與抗原（或抗體）復(fù)合物，然后再根據(jù)待測(cè)抗體（或抗原）與復(fù)合物專一且定量的結(jié)合關(guān)系，通過(guò)測(cè)定與待測(cè)抗體（或抗原）結(jié)合的酶的活力，從而計(jì)算出待測(cè)抗體（或抗原）的量。酶電極是最早問(wèn)世的生物傳感器，它是把測(cè)定無(wú)機(jī)離子或低分子量氣體的電化學(xué)器體（如離子選擇性電極或氣敏電極）與酶固定化技術(shù)相結(jié)合而產(chǎn)生的傳感器，使原來(lái)僅有測(cè)量物理量功能的電極具備了測(cè)量生物化學(xué)量的功能，它在生物試樣

5、化學(xué)成分的檢測(cè)方面具有良好的選擇性和較強(qiáng)的特異性。4. 試以米氏方程說(shuō)明酶法分析、酶活測(cè)定的原理。 酶活力測(cè)定（Enzyme Assay）分析對(duì)象 酶一般常測(cè)定酶促反應(yīng)的初速度以確定酶活力。酶單位：1961 年，國(guó)際生化聯(lián)合會(huì)酶委員會(huì)建議，一個(gè)酶單位為在確定的最適反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 ml分子底物變化所需要的酶量。測(cè)定原理:酶法分析（Enzyme Analysis ）分析工具 酶（酶免分析、酶電極）原理：米氏方程：當(dāng)s << km 時(shí)，即反應(yīng)體系中底物濃度較低，酶量足或過(guò)量時(shí)，v vm/km.s ，即測(cè)定的酶活（反應(yīng)速度）與體系中的底物濃度成正比，具有線性的比例關(guān)系。6. 何為

6、酶工程、抗體酶、半抗原、酶的專一性，酶的分類.Ø 酶工程即利用酶的催化作用，在一定的生物反應(yīng)器中，將相應(yīng)的原料轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)品。酶工程是現(xiàn)代酶學(xué)理論與化工技術(shù)的交叉技術(shù)，它的應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域。Ø 抗體酶通過(guò)改變抗體中與抗原結(jié)合的微環(huán)境，并在適當(dāng)部位插入催化基團(tuán)，所產(chǎn)生的具有催化活性的抗體。Ø 半抗原有些小分子化合物（如藥物）因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，本身不是抗原，不能免疫動(dòng)物，但是當(dāng)它和蛋白質(zhì)載體結(jié)合后就可以成為抗原，免疫動(dòng)物因之產(chǎn)生的抗體可以與小分子化合物本身起抗原抗體反應(yīng)，這種小分子化合物一般稱之為半抗原。Ø 酶的專一性是指酶對(duì)催化

7、反應(yīng)和反應(yīng)物有嚴(yán)格的選擇性。被作用的反應(yīng)物通常叫做底物，酶往往只能催化一種或一類反應(yīng)，作用于一種或一類物質(zhì)，一般催化劑沒(méi)有這樣的選擇性。酶作用專一性的類型1. 立體異構(gòu)專一性a) 立體異構(gòu)專一性(L/D)b) 幾何異構(gòu)專一性(順/反)2. 非立體化學(xué)專一性a)絕對(duì)專一性:A Bb)相對(duì)專一性 1) 鍵專一性:A B2) 基團(tuán)專一性:A -B,A- B酶作用專一性的機(jī)制：誘導(dǎo)契合學(xué)說(shuō)該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶表面并沒(méi)有一種與底物互補(bǔ)的固定形狀，而只是由于底物的誘導(dǎo)才形成了互補(bǔ)形狀。（酶的化學(xué)本質(zhì)：蛋白質(zhì)、 RNA、DNA、抗體酶）Ø 酶的分類1. 氧化還原酶類Oxidoreductases2. 轉(zhuǎn)移

8、酶類 Transgerases3. 水解酶類 Hydrolases4. 裂合酶類 Lyases5. 異構(gòu)酶類 Isomerases6. 合成酶類 SynthetasesSynthases7.簡(jiǎn)述酶蛋白的結(jié)構(gòu)特征、酶高效催化作用的原理或機(jī)制。Ø 酶蛋白的結(jié)構(gòu)特征：·結(jié)合部位Binding site酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。結(jié)合部位決定酶的專一性·催化部位 Catalytic site酶分子中促使底物發(fā)生化學(xué)變化的部位稱為催化部位。通常將酶的結(jié)合部位和催化部位總稱為酶的活性部位或活性中心。催化部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。·調(diào)控部位 Re

9、gulatory site酶分子中存在著一些可以與其他分子發(fā)生某種程度的結(jié)合的部位，從而引起酶分子空間構(gòu)象的變化，對(duì)酶起激活或抑制作用。酶活性中心的必需基團(tuán)主要包括：親核性基團(tuán)：絲氨酸的羥基，半胱氨酸的巰基和組氨酸的咪唑基。酸堿性基團(tuán)：門冬氨酸和谷氨酸的羧基，賴氨酸的氨基，酪氨酸的酚羥基，組氨酸的咪唑基和半胱氨酸的巰基等。Ø 酶作用高效率的機(jī)制:一、中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)在酶催化的反應(yīng)中，第一步是酶與底物形成酶底物中間復(fù)合物。當(dāng)?shù)孜锓肿釉诿缸饔孟掳l(fā)生化學(xué)變化后，中間復(fù)合物再分解成產(chǎn)物和酶。E + S = E-S P + E許多實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明了ES復(fù)合物的存在。ES復(fù)合物形成的速率與酶和底物的性質(zhì)

10、有關(guān)。二、活化能降低酶催化作用的本質(zhì)是酶的活性中心與底物分子通過(guò)短程非共價(jià)力(如氫鍵,離子鍵和疏水鍵等)的作用，形成E-S反應(yīng)中間物，其結(jié)果使底物的價(jià)鍵狀態(tài)發(fā)生形變或極化，起到激活底物分子和降低過(guò)渡態(tài)活化能作用。1.趨近和定向效應(yīng)趨近效應(yīng): 在酶促反應(yīng)中，底物分子結(jié)合到酶的活性中心，一方面底物在酶活性中心的有效濃度大大增加，有利于提高反應(yīng)速度；定向效應(yīng):另一方面，由于活性中心的立體結(jié)構(gòu)和相關(guān)基團(tuán)的誘導(dǎo)和定向作用，使底物分子中參與反應(yīng)的基團(tuán)相互接近，并被嚴(yán)格定向定位，使酶促反應(yīng)具有高效率和專一性特點(diǎn)。2.底物變形與張力學(xué)說(shuō)酶(E)與底物(S)結(jié)合后,使底物的某些敏感鍵發(fā)生變形,從而使底物分子接近

11、于過(guò)度態(tài),降低反應(yīng)的活化能;同時(shí),由于底物的誘導(dǎo),酶分子的構(gòu)象發(fā)生表化，并對(duì)底物產(chǎn)生張力作用(多為酶中金屬離子引起)使底物扭曲,促進(jìn)ES進(jìn)入過(guò)度態(tài)。3. 共價(jià)催化催化劑通過(guò)與底物形成反應(yīng)活性很高的共價(jià)過(guò)渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過(guò)程，稱為共價(jià)催化。·酶中參與共價(jià)催化的基團(tuán)主要包括His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羥基等。·某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價(jià)催化作用。4. 酸堿催化酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸堿催化方式。廣義酸堿催化是指通過(guò)質(zhì)子酸提供部分

12、質(zhì)子,或是通過(guò)質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達(dá)到降低反應(yīng)活化能的過(guò)程。廣義酸基團(tuán)（質(zhì)子供體）廣義堿基團(tuán)（質(zhì)子受體）His 是酶的酸堿催化作用中最活潑的一個(gè)催化功能團(tuán)。8.過(guò)濾、脫鹽及濃縮的主要方法.過(guò)濾過(guò)濾是借助于過(guò)濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)。其中以各種高分子膜為過(guò)濾介質(zhì)的過(guò)濾稱為膜分離技術(shù)。過(guò)濾技術(shù)：1粗濾：顆粒直徑>2m微濾：顆粒直徑0.2 m 2 m 分離細(xì)菌、灰塵2膜分離技術(shù)：超濾：顆粒直徑20 Å 0.2 m 分離不同分子量的物質(zhì)反滲透：顆粒直徑<20 Å 分離各種離子與小分子物質(zhì)粗濾可分為常壓過(guò)濾、加壓過(guò)濾、減壓過(guò)濾。為了加快過(guò)濾速度，提

13、高分離效果，經(jīng)常需要添加助濾劑。常用的有硅藻土、活性炭、紙粕等。膜分離：加壓膜分離；電場(chǎng)膜分離（電滲析、離子交換膜電滲析）；擴(kuò)散膜分離（透析）：用于酶、蛋白質(zhì)等大分子的濃縮與脫鹽。脫鹽可以超濾、透析（擴(kuò)散膜分離）以及層析法進(jìn)行脫鹽。濃縮酶的濃縮有五種方式：蒸發(fā)濃縮、膠過(guò)濾濃縮、超濾濃縮、反復(fù)凍融濃縮、聚乙二醇濃縮法9.層析的主要方法，簡(jiǎn)述疏水作用層析、離子交換層析等各種層析方法分離酶蛋白的原理。層析是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小、形狀、分子極性、吸附力、分子親和力和分配系數(shù)等）的不同，使各組分在層析的固定相和流動(dòng)相之間的分布程度不同而得到分離，又稱為色譜分離。·凝膠層

14、析概念：又稱“分子篩、體積排阻色譜”，是根據(jù)溶質(zhì)分子量的大小不同而進(jìn)行分離的一種相色譜技術(shù)。·離子交換層析概念：是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對(duì)各種離子的親和力不同，而使不同的蛋白質(zhì)組分得以分離的方法。原理：離子交換層析是利用電荷間相互作用使不同蛋白質(zhì)得以分離·疏水層析·吸附層析概念：是利用吸附劑對(duì)不同酶蛋白的吸附力不同，而使混和液中的各種蛋白質(zhì)得以分離的方法。原理：表面積較大的吸附劑，在低PH、低離子強(qiáng)度下吸附，在提高PH、增加離子強(qiáng)度的條件下解吸。·親和層析概念：是利用生物分子對(duì)之間所具有的專一而又可逆的親和力而使生物分子分離純化的技術(shù)。酶與底物，酶

15、與競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，酶與輔酶之間即是具有專一而又可逆的親和力的分子對(duì)·反相色譜和疏水作用色譜10.純化表的計(jì)算及純化工藝優(yōu)劣的評(píng)價(jià)。11.酶的固定化：概念、方法及固定化工藝優(yōu)劣的評(píng)價(jià)。通過(guò)化學(xué)或物理的手段將酶或游離細(xì)胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復(fù)利用的技術(shù)。固定化酶(immobilized enzyme)固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化細(xì)胞（immobilized cell）固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)（生長(zhǎng)、繁殖、新陳代謝）的細(xì)胞。1.吸附法依據(jù)帶電的酶或細(xì)胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的表面或離子交換劑上。1）物理吸附法

16、（physical adsortion）作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素等。2）離子結(jié)合法（ion binding）作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素優(yōu)點(diǎn)：條件溫和，操作簡(jiǎn)便，酶活力損失少。缺點(diǎn)：結(jié)合力弱，易解吸附。2.共價(jià)偶聯(lián)法借助共價(jià)鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團(tuán)和載體的功能基團(tuán)進(jìn)行偶聯(lián)。優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件較激烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性3.交聯(lián)法（crosslinking）借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑：常用

17、的是戊二醛,戊二醛有兩個(gè)醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反應(yīng),使酶蛋白交聯(lián)。此法與共價(jià)偶聯(lián)法利用的均是共價(jià)鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。交聯(lián)反應(yīng)既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。 酶濃度低時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。 酶濃度高時(shí)，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。優(yōu)點(diǎn)：酶與載體結(jié)合牢固，不易輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點(diǎn)：(1)反應(yīng)條件激烈，酶分子的多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來(lái)不便4. 包埋法（entrapment）將酶用物理的方法包埋在各種載體（高聚物）內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。與網(wǎng)

18、格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點(diǎn)：1）固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。2）半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進(jìn)入，注入體內(nèi)既可避免引起免疫過(guò)敏反應(yīng)，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。缺點(diǎn)：反應(yīng)條件要求高,制備成本也較高。包埋法是目前應(yīng)用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點(diǎn)：不與酶蛋白氨基酸殘基反應(yīng)，很少改變酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點(diǎn)：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。112.何為鹽析沉淀、酶的分子修飾、等電聚焦電泳。鹽析沉淀鹽析沉淀是利用在弄一濃度鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)和酶的溶解度各不相同的原理，對(duì)酶蛋白進(jìn)行分離的方法。原理：對(duì)于含有多種蛋白質(zhì)或酶的混合液

19、，可以采用分段鹽析的方法進(jìn)行分離純化。因?yàn)樵谀骋粷舛鹊柠}溶液中，不同的蛋白質(zhì)和酶的溶解度各不相同，故可達(dá)到彼此分離的目的。酶的分子修飾通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱為酶分子修飾。即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)（物質(zhì)），特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等電聚焦電泳概念：在電泳系統(tǒng)中加入兩性電解質(zhì)載體，通以直流電后，兩性電解質(zhì)即在電場(chǎng)中形成一個(gè)由陽(yáng)極到陰極連續(xù)增高的PH梯度。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)、多肽或酶進(jìn)入這個(gè)體系時(shí)，不同的蛋白質(zhì)即移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)得以分離。良好的載體兩性

20、電解質(zhì)必備的條件13.對(duì)于未知蛋白的分離，如何選擇恰當(dāng)?shù)碾x子交換層析的介質(zhì)？14.酶的分子修飾的方法有哪些？如何運(yùn)用蛋白質(zhì)工程的方法來(lái)改造天然的酶分子？分子修飾通過(guò)各種方法使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變了酶的某些特性和方法，以提高酶的活力，增加酶的穩(wěn)定性，消除或降低酶的抗原性等的過(guò)程，稱之。蛋白質(zhì)工程§蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)§利用分子生物學(xué)技術(shù)方法改造酶蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu),進(jìn)而改造其高級(jí)結(jié)構(gòu)酶分子的修飾方法·金屬離子置換修飾,·大分子結(jié)合修飾(共價(jià)/非共價(jià))·側(cè)鏈基團(tuán)修飾·肽鏈有限水解修飾·氨基酸置換修飾·酶分子的物理修飾利用基因工程技術(shù)定向改造酶蛋白的結(jié)構(gòu)基因定點(diǎn)誘變（ Site-directed mutagenesi s）PCR 誘變（PCR mutagene