單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)(Molecular Devices)

1、單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)1986年,美國FDA批準(zhǔn)了第一個單克隆抗體藥物上市,距今已快30年。目前,全世界共有超過40個治療用抗體藥物被批準(zhǔn)上市,每年實現(xiàn)超過600億美元的銷售額。在國際及國內(nèi)形成了抗體藥物開發(fā)熱潮。巨大的市場前景和現(xiàn)存的技術(shù)問題及壁壘并存的現(xiàn)實不可避免地引發(fā)抗體藥物新一輪技術(shù)革命。而其結(jié)果又將毫無疑問地改變抗體藥物的市場格局。但是,抗體不管是作為檢測試劑,還是作為具有巨大市場前景的治療藥物。首先,我們都需要通過篩選找到單克隆抗體。傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法主要是雜交瘤技術(shù)。這是目前比較成熟,技術(shù)難度比較低,大多數(shù)實驗室仍然在使用的方法。在單克隆抗體制備過程中,有兩次篩選過程

2、,第一次是使用選擇性培養(yǎng)基選出雜交瘤細(xì)胞;第二次就是進(jìn)一步選出能產(chǎn)生我們需要的抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的基本原理是根據(jù)以下三個原則:1、一種淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生一種抗體;2、細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性;3、利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選出雜交瘤細(xì)胞,并進(jìn)行克隆化,然后大量培養(yǎng)增殖, 制備所需的單克隆抗體。第一次篩選的原理和方法:細(xì)胞融合后,雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其依據(jù)是細(xì)胞中DNA的合成有兩條途徑:一條途徑是生物合成途徑(D途徑,

3、即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中,葉酸作為重要的輔酶參與這一過程,而HAT培養(yǎng)液中氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗劑,可以阻斷DNA合成的“D途徑”。另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑(S途徑,它是利用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT和胸腺嘧啶核苷激酶(TK催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸,兩種酶缺一不可。因此,在HAT培養(yǎng)液中,未融合的B細(xì)胞及兩個B細(xì)胞的融合產(chǎn)物的D途徑被氨基蝶呤阻斷,雖S途徑正常,但因缺乏在體外培養(yǎng)液中的增殖能力,一般在10天左右會死亡。對于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言,由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤-鳥嘌呤

4、磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT缺陷細(xì)胞,因此自身沒有S途徑,且D途徑又被氨基蝶呤阻斷,所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞相互融合的雜交瘤細(xì)胞,既具有B細(xì)胞的S途徑,又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性,因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來,并不斷增殖。第二次篩選的原理和方法:在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中,由于B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的,經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體存在多樣性,必須對雜交瘤細(xì)胞群進(jìn)行第二次篩選,才能選出針對目標(biāo)抗原具有特異性的雜交瘤細(xì)胞。二次篩選通常采用有限稀釋法,將雜交瘤細(xì)胞多陪稀釋,接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,使每孔不超過一個細(xì)胞

5、,通過培養(yǎng)讓其增值。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體的特異性(常用ELISA方法,上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞,需要繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋,一般重復(fù)3-4次,直至確信每個孔中增值的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。第二次篩選也是鑒定特異性親和力的過程。有限稀釋法對于篩選雜交瘤來說,是最普通的方法,在許多實驗室中都在使用。但是,作為相對舊的技術(shù),已經(jīng)不能滿足當(dāng)今的需求。方法自身具有許多缺點:1、人工操作,操作及重復(fù)的步驟太多,不可避免容易出錯。2、速度慢,效率低。只能保證30-40%的孔有細(xì)胞生長。對于高通量篩選來說,不能滿足要求。3、不能保證單克隆,需要亞克隆3-4

6、次,所以,人工和耗時都較多。4、有限稀釋在ELISA檢測前,并不知道哪一個克隆滿足抗原特異性的要求。所以,需要對所有克隆,都要最少做一次ELISA鑒定。除了有限稀釋方法,現(xiàn)在相對先進(jìn)的細(xì)胞分選技術(shù)也得到普遍應(yīng)用。一般就是細(xì)胞分選儀或者流失細(xì)胞技術(shù)對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。其原理是先將細(xì)胞分散開,沒有細(xì)胞結(jié)團(tuán)。通過在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記熒光信號。當(dāng)單個細(xì)胞在壓力作用下單個通過玻璃毛細(xì)管的時候,儀器可以自動檢測單個細(xì)胞的熒光信號強(qiáng)度。熒光信號強(qiáng)度反應(yīng)這個細(xì)胞的相應(yīng)抗體表達(dá)水平。最后,將高熒光信號強(qiáng)度的細(xì)胞收集,再通過有限稀釋得到高水平表達(dá)的單克隆;或者也可以使用單細(xì)胞收集器收集高水平表達(dá)的單個雜交瘤細(xì)

7、胞。細(xì)胞分選或者流失細(xì)胞技術(shù)的篩選原理如下圖所示:Fluorescnec這種技術(shù)也在很多實驗室中使用,但是根據(jù)其篩選原理,有一些不可避免的缺陷。1、由于必須要對細(xì)胞表面或內(nèi)部使用熒光標(biāo)記,所以,一般主要使用于胞內(nèi)表達(dá)的蛋白或者膜表達(dá)蛋白。對于分泌表達(dá)的雜交瘤細(xì)胞來說,使用具有局限性。2、具體檢測的是單個細(xì)胞在某個時間點的熒光強(qiáng)度。所以,檢測結(jié)果容易受細(xì)胞周期的影響。而且,單個細(xì)胞的表達(dá)水平也不能很好反應(yīng)后期生產(chǎn)階段細(xì)胞群體的表達(dá)水平。3、流失篩選技術(shù)只是對熒光信號強(qiáng)的所有細(xì)胞作出劃分,后期需要復(fù)篩的細(xì)胞數(shù)目仍然很多,下游工作量仍然比較大。4、由于對單個細(xì)胞使用壓力操作,剪切力會降低細(xì)胞存活率。

8、所以,低成活率也成為這個技術(shù)的一個主要缺陷。5、流失篩選需要對管路系統(tǒng)充分清洗消毒才能確保細(xì)胞不會污染,污染的風(fēng)險較高。隨著技術(shù)進(jìn)步,我們也迫切需要一種更先進(jìn)的篩選技術(shù)。能夠滿足高通量,自動化,高效率的要求?，F(xiàn)在,一種新的雜交瘤篩選技術(shù)平臺Clonepix2技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn),并且在世界范圍內(nèi)得到廣泛使用,實踐證明其能夠大大加快雜交瘤篩選速度,并且提高效價,降低成本。其篩選原理如下:1、使用半固體培養(yǎng)的方法,使細(xì)胞在培養(yǎng)基上生長成單個獨立分散的單克隆;半固體培養(yǎng)基可以阻止克隆移動,保證篩選到的克隆是單克隆。 2、在半固體培養(yǎng)基中加入熒光標(biāo)記克隆檢測試劑?？寺z測試劑、營養(yǎng)因子以及克隆表達(dá)的蛋白分子都

9、可以自由在半固體培養(yǎng)基中擴(kuò)散。當(dāng)熒光標(biāo)記檢測試劑捕獲目標(biāo)蛋白分子后,形成分子復(fù)合體。復(fù)合體大分子聚集在克隆的周圍。而且,隨著克隆生長時間延長,聚集更多熒光蛋白復(fù)合體。 3、軟件在白光下識別細(xì)胞克隆,在熒光下對克隆的熒光水平進(jìn)行定量。并且,機(jī)械臂及挑頭可以自動化挑取熒光水平高的細(xì)胞克隆到96孔微孔板。 最為最新一代技術(shù),Clonepix2技術(shù)在篩選雜交瘤方面具有許多優(yōu)點:1、第一次將克隆的篩選自動化,可以更少時間,篩選更多克隆。2、篩選雜交瘤效率高。由于篩選過程以及挑克隆的自動化,可以在短時間內(nèi)篩選大量克隆,所以大大提高找到稀少的高產(chǎn)克隆的概率。3、高效率也大大減少人力,增加雜交瘤篩選的通量,同一時間可以運作更多項目。4、由于快速篩選更高水平克隆用于下游生產(chǎn),同時盡可能早的丟棄掉低產(chǎn)的克隆,將目標(biāo)專注于稀少的高產(chǎn)克隆,也避免了有限稀釋,大大減少下游生產(chǎn)成本;同時節(jié)省耗材。作為雜交瘤篩選的最新技術(shù),也存在一些缺點。比如,首先雜交瘤要能在半固體培養(yǎng)基上生長良好,所以,合適的培養(yǎng)基就尤為重要。其次,克隆的大小和密度對于自動化挑取克隆的精確性有很大影響?？寺√?會影響識別和挑取?？寺√?容易影響挑到克隆的單克隆性。最后,機(jī)械臂對于挑選精度要求比較高,所以,設(shè)備的日常維護(hù)就非常重要