微生物限度檢驗操作規(guī)程(2015年版)

1、1 目的規(guī)范微生物限度檢驗操作，確保檢驗結果準確、可靠。2 依據(jù)中國藥典 2015 版。3 范圍本標準適用于微生物限度檢驗。4 責任中心化驗室負責人：對本規(guī)程的實施負責。 中心化驗室檢驗人員：嚴格按照本規(guī)程執(zhí)行檢驗操作。5 程序5.1 執(zhí)行標準 ：中國藥典 2015 版。5.2 抽樣 ：照取樣標準操作規(guī)程進行。6 內容6.1 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)計數(shù)方法包括平皿法、薄膜過濾法和最可能數(shù)法（MPN法）。檢查時，按已驗證的計數(shù)方法進行供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定。6.1.1 設備、儀器及用具6.1.1.1 設備微生物限度檢測室、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（3035C）、生化培

2、養(yǎng)箱（2025C）、 電熱恒溫水浴鍋、烘箱、脈動真空滅菌柜、紫外燈等。6.1.1.2 儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、移液槍及吸頭、薄 膜過濾器等。6.1.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.1.2 試液6.1.2.1 消毒液A 0.1% 新潔爾滅溶液B. 75聽醇溶液6.1.2.2 稀釋液、試劑及配制A. pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液：取磷酸二氫鉀 3.56g、無水磷酸氫二鈉5.77g、氯化鈉4.3g、蛋白胨1.0g，加純化水1000

3、ml,微溫溶解，濾清，分裝，121C滅菌15分鐘。B. 聚山梨酯80C. 無菌十四烷酸異丙酯D. pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液6.1.3 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基6.1.4 操作方法6.1.4.1 試驗前準備6.1.4.1.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、試管、移液槍吸頭（1ml、 10ml）、量筒、稀釋液、 培養(yǎng)基等移至傳遞窗內。 每次試驗所用物品必須事先計劃， 準備足夠用量， 避免操作中出入操作間。6.1.4.1.2 開啟微生物檢測室紫外燈和空調凈化系統(tǒng)，并使其工作不低于 30min。6.1.4.1.3 操作人員進入一更，用洗手液或肥皂

4、洗手，烘干。進入二更，用 0.1% 新潔爾滅 溶液洗手，穿戴潔凈無菌服、口罩、手套。6.1.4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周 圍，待干后用滅菌的手術鑷或剪將供試品啟封。6.1.4.2 供試液的制備 根據(jù)供試品的理化特征與生物學特性，采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需 加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過 45C。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基，不得超 過 1 小時。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經確認均不適用，應建立其他 適宜的方法。6.1.4.2.1 水溶性供試試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨

5、液體培養(yǎng)基溶解或稀釋 制成1: 10供試液。若需要，調節(jié)供試液pH值至6&必要時，用同一稀釋液將供試液進 一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。6.1.4.2.2 水不溶性非油脂類供試品取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1: 10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯 80，使供試品分散均勻。若需要，調節(jié)供試液 pH 值至 68。必要時，用同一稀釋液 將供試液進一步 10 倍系列稀釋。6.1.4.2.3 油脂類供試品 取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品

6、乳化的無菌聚 山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過40C（特殊情況下，最多不超過45C），小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的 稀釋液使成 1： 10供試液，保溫，混合，并在最短時間內形成乳狀液。6.1.4.2.4 腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液，置45C水浴中，振搖，使溶解，制成 1：10 的供試液。6.1.4.3 供試液的稀釋取1:10均勻供試液1ml,加入裝有9mlpH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的試管中混勻， 即為1:100供試液。以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1:1000、1:10000

7、等適宜稀釋級。每遞增 1稀釋劑，必須另換一支吸管。6.1.4.4 檢查法6.1.4.4.1 檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（ g、ml、cm2）。一般應隨機抽取不少于 2 個最小包裝的供試品，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10g或10ml;膜劑為100cm2;貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。檢驗時，應從 2 個以上最小包裝單位中抽取供試品。6.1.4.4.2 平皿法6.1 .4.4.2.1 取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗確認的方法進行供試液的制備和菌數(shù)測 定，每稀釋級每種培養(yǎng)至少制備 2 個平板。6.1.4.4.2.2 陰性對照以稀釋液代替供試

8、液進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。 如果陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。6.1.4.4.2.3 傾注培養(yǎng)基將預先配制好的培養(yǎng)基（需氧菌總數(shù)計數(shù)用胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)用沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）熔化，置 45。C水浴中，備用。將45。C左右的瓊脂傾注上 述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速轉動平皿（勿使培養(yǎng)基溢出）使供試液與 培養(yǎng)基混勻，放置，待凝。6.1.4.4.2.4 培養(yǎng)和計數(shù)需氧菌總數(shù)計數(shù)平板倒置于 3035C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35天。霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù) 平板倒置于2025C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，必要時可延長至7天。觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌

9、落數(shù)，計數(shù)并報告。菌落蔓延生長成片的平板不宜計數(shù)。點計菌落 數(shù)后，計算各稀釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。若同稀釋級兩個平 板的菌落平均數(shù)不小于 15，則兩個平板的菌落數(shù)不能相差 1 倍或以上。6.1 .4.4.2.5 菌數(shù)報告規(guī)則需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選 取平均菌數(shù)小于 100cfu 的稀釋級，作為菌數(shù)報告的依據(jù)。以最高的平均菌落數(shù)，計算1g、1ml或10cm2供試品中所含的微生物，取兩位有效數(shù)字報告。如各稀釋級的平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以v1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌

10、數(shù)。6.1.4.4.3 薄膜過濾法6.14431薄膜過濾法所采用濾膜孔徑應不大于0.45卩m直徑約為50mm若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生 物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾 前后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其 濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液 及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每 次沖洗量為100ml。總沖洗量不得超過1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。

11、6.1.4.4.3.2 取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪 大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。濾膜 貼于平板上是不得有空隙或氣泡，否則影響微生物的生長。6.1.4.4.3.3陰性對照取試驗用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性 對照不得有菌生長。6.1.4.4.3.4 培養(yǎng)和計數(shù)培養(yǎng)條件和計數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應不超過100

12、cfu 。6.1.4.4.3.5菌數(shù)報告規(guī)則以相當于1g或 1ml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌落生 長，以1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾1g或1ml供試品），或1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌 數(shù)。6.1.4.4.4 MP 法MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜 計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用霉菌計數(shù)。取供試液至少3個連續(xù)稀級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有910ml胰 酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。必要時可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035C培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。 如果由于供試品的原因 使得結果難以判斷，可將該

13、管培養(yǎng)物轉種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng) 基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。根據(jù)微生物生長的管數(shù)從表1查被測供試品每1g或1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表1微生物最可能數(shù)檢索表生長管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g 或 ml下限上限0.10.010.001000 103+一102v N v 103+一一10v N v 102一一一N v 10注：（1）+代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長；一代表紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上無菌落生長。（2）若供試品量減少 10倍（O.OIg 或0.01ml , 0.001g 或0.001ml，0.0

14、001g 或0.0001ml），則每 1g （或 1ml） 供試品中可能的菌數(shù)（N）應相應增加10倍。6.4沙門菌641設備、儀器及用具6.4.1.1 設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30-35C）、 電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.4.1.2儀器及器皿顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.4.1.3 用具大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅 菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.4.2試液、指示液

15、PH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.4.3培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧酸鹽瓊脂培養(yǎng) 基、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基等。6.4.4操作方法6.4.4.1供試液制備和增菌培養(yǎng)取10g或10ml供試品直接或處理后接種至適宜體積（經方 法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035C培養(yǎng)1824小時。644.2選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基中，3035C培養(yǎng)2448小時。取少量RV沙門增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽 瓊脂培 養(yǎng)基 平板上，3035E培養(yǎng)1848小時。沙

16、門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上生長良好，菌落為淡紅色或無色、 透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選疑似菌落于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上 進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng) 1848 小時，或采用基他適宜方法進一步鑒定。6.4.4.3 結果判斷若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上有疑似菌落生長， 且三糖鐵 瓊脂培養(yǎng)基的斜面為紅色、底層為黃色，或斜面黃色、底層黃色或黑色，應進一步進行適 宜的鑒定試驗， 確證是否為沙門菌。 如果平板上沒有菌落生長， 或雖有菌落生長但鑒定結 果為陰性，或三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基的斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層未見 黃色或黑色，判供試品未檢出沙門菌。

17、6.5銅綠假單胞菌6.5.1 設備、儀器及用具6.5.1.1 設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30-35C）、電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.5.1.2 儀器及器皿 顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.5.1.3 用具 大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.5.2 試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.5.3 培養(yǎng)基胰

18、酪大豆胨液體培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基等。6.5.4 操作方法6.5.4.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“ 6.1.4.2”制成 1：10 供試液。取相當于 1g 或 1ml 供試液，接種至適宜體積（經方法適用性試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 混勻，在3035T培養(yǎng)1824小時。6.5.4.2 選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035C培養(yǎng)1872小時。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其他適宜方法進一步鑒定。6.5.4.3 氧化酶試驗取潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于 濾紙片上，滴加新配制的 1

19、%二鹽酸 N， N 二-甲基對苯二胺試液，在 30 秒內若培養(yǎng)物呈 粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。6.5.4.4 結果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽 性，應進一步進行適宜的鑒定試驗， 確證是否為銅綠假單胞菌。 如果平板上沒有菌落生長， 或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。6.6 金黃色葡萄球菌6.6.1 設備、儀器及用具6.6.1.1 設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、生化培養(yǎng)箱（30-35C）、 電熱恒溫水浴鍋、烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.6.1.2 儀器及器皿 顯微

20、鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試管及塞、吸管、注射器、注 射針頭、載玻片、蓋玻片、薄膜過濾器等。6.6.1.3 用具 大、小橡皮乳頭，潔凈工作服、口罩、醫(yī)用手套、接種環(huán)、酒精燈、酒精棉球、滅菌剪刀、滅菌鑷子、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、薄膜過濾膜等。6.6.2 試液、指示液PH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、PH6.8無菌磷酸鹽緩沖溶液等。6.6.3 培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基等。6.6.4 操作方法6.6.4.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品，照“ 6.1.4.2”制成 1：10供試液。取相當于 1g 或 1ml 供試液，接種至適宜體積（經方法適用性

21、試驗確定）的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻。在3035T培養(yǎng)1824小時。6.6.4.2 選擇和分離培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化納瓊脂培養(yǎng)基平板上， 3035T培養(yǎng)1872小時。6.6.4.3 結果判斷若甘露醇氯化納瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰 性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。6.7 白色念珠菌6.7.1 設備、儀器及用具6.7.1.1 設備微生物限度檢測室、陽性菌檢測室、生物安全柜、凈化工作臺、電熱恒溫水浴鍋、 烘箱、滅菌柜、紫外燈等。6.7.1.2 儀器及器皿 顯微鏡、托盤天平、錐形瓶、研缽、培養(yǎng)皿、量筒、試