生物技術(shù)專業(yè)復(fù)習(xí)資料(西南民大版)-蛋白質(zhì)檢測技術(shù)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 蛋白質(zhì)檢測技術(shù)復(fù)習(xí)1、 蛋白質(zhì)濃度檢測有哪些常用方法，簡要說明他們的優(yōu)缺點(diǎn)。a. 克氏定氮法：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)典、結(jié)果比較準(zhǔn)確、可以測量固液態(tài)樣品、目前已經(jīng)可儀器化。缺點(diǎn)：繁瑣（消化、蒸餾、滴定）、費(fèi)時（有非蛋白氮干擾）b. 紫外吸收法：優(yōu)點(diǎn)：簡單、快速、靈敏度高、微量、適合蛋白質(zhì)純化時檢測蛋白濃度。缺點(diǎn)：不太準(zhǔn)確、只用于測定液體、要求雜質(zhì)少c. Folin-酚法：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)典、靈敏性和準(zhǔn)確性高、方便、成本低。缺點(diǎn)：易受還原物質(zhì)干擾、去污劑有干擾、費(fèi)時、專一性差d. 二奎琳甲酸法：優(yōu)點(diǎn)：經(jīng)典、方便、有試劑盒供應(yīng)。缺點(diǎn)：不耐受還原劑e. 染料結(jié)合法：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡單、干

2、擾因素較少、應(yīng)用廣泛。缺點(diǎn)：SDS干擾、不同蛋白顯色不同、染料干擾。2、 特定蛋白組分含量的測定a. 放射免疫分析：高靈敏度、試劑盒；結(jié)果是免疫活性，而不是實(shí)際含量；有放射性危害。b. Elisa:無放射性危害，操作簡便，加樣方便，便于自動化，試劑盒c. Hplc:可同時對多種蛋白進(jìn)行定量，準(zhǔn)確度較高；每次只能測定一個樣品，需要昂貴的高效液相色譜儀。d. 電泳：不同蛋白有染色方面的誤差3、 解釋下列名詞1、 蛋白組學(xué)技術(shù)：大規(guī)模研究細(xì)胞、有機(jī)體或生物體中的蛋白質(zhì)的學(xué)科2、 固相pH梯度等電聚焦電泳：一種新型等點(diǎn)聚焦電泳法，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵聚

3、合至丙烯酰胺骨架中而形成的pH梯度，十分穩(wěn)定。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF，分離達(dá)到真正的平衡。3、 親和層析：利用蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的專一性可逆結(jié)合，將蛋白質(zhì)分子分離的技術(shù)。4、 氨基酸原位分析：采用SDS-PAGE分離的蛋白很難從凝膠上洗脫下來，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后在膜上直接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱原位分析。5、 電泳：指帶電荷的顆粒在電場作用下向著與其電性相反的電極運(yùn)動的現(xiàn)象。6、 肽譜：指蛋白質(zhì)被酶解或化學(xué)裂解后肽段的分離分析。7、 肽指紋圖譜：蛋白質(zhì)酶切位點(diǎn)被專一的蛋白酶水解后得到的肽片段的質(zhì)量圖譜。8、 指紋譜：由

4、于每種蛋白質(zhì)的氨基酸序列都不同，蛋白質(zhì)被水解后，殘生的肽片段序列也不相同，其肽混合物質(zhì)量數(shù)亦具有特異性，所以稱為指紋譜。9、 質(zhì)譜：是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比的大小順序排列的圖譜。10、 質(zhì)譜儀：一類能使物質(zhì)粒子高化成離子并通過電場、磁場將他們按空間位置。時間先后或軌道穩(wěn)定是否實(shí)現(xiàn)質(zhì)荷比分離，并檢測強(qiáng)度后，進(jìn)行物質(zhì)分析的儀器。11、 蛋白質(zhì)印跡：把電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上并進(jìn)行檢測的過程。12、 雙向電泳：蛋白組學(xué)研究的核心技術(shù)，先進(jìn)行IEF,再進(jìn)行SDS-PAGE分離。3、 如何檢測蛋白質(zhì)純度？需要注意什么？可根據(jù)蛋白質(zhì)的分子大小、形狀、電荷等進(jìn)行分析，至少利用兩種不同的原理進(jìn)

5、行分析常用方法：電泳、色譜、CE、MS、其他；4、 質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)分析中由什么作用？a. 蛋白質(zhì)序列的測定：用3-4種不同蛋白酶對蛋白質(zhì)水解，然后把各種酶解片段用HPLC分析得到純肽或簡單的混合肽，最后用MS分析各種組分順序，從不同蛋白酶片段找到重疊序列，得到蛋白質(zhì)全部序列。b. 蛋白質(zhì)、多肽純度分析：只要有質(zhì)量差異的雜質(zhì)都可以檢測出來。c. 蛋白質(zhì)的鑒定：將雙向凝膠電泳顯色的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下來，用蛋白酶水解，獲得肽的混合物，再用質(zhì)譜分析的到肽片段的質(zhì)量圖譜，通過PMF專業(yè)蛋白數(shù)據(jù)庫檢索，進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定d. 蛋白質(zhì)的分子量測定。5、 簡單介紹western blot 技術(shù)的主要過程，該技術(shù)有何用

6、途？a. 凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上：電泳轉(zhuǎn)移或直接點(diǎn)樣 b.封閉：用非特異性的分子封閉膜上未吸附蛋白的區(qū)域。c.用探針檢測膜上特異的或感興趣的蛋白。用途：檢測生物樣品中特異蛋白質(zhì)的定性方法，也可以用于同一蛋白質(zhì)在不同細(xì)胞或不同條件下的半定量分析。6、 生物工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制主要包括哪些方面？含量、純度、分子量、PI、氨基酸定量分析、肽譜、質(zhì)譜、N-末端序列分析、C-末端序列分析、二硫鍵分析、突變點(diǎn)分析、添加劑問題。7、 蛋白質(zhì)分離純化的基本思路是什么？A.選擇目的蛋白：含量豐富、穩(wěn)定的材料。B.建立靈敏、特異的檢測方法，分步檢測含量、純度、活性等。C.抽提：細(xì)胞破碎后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到抽提液中。

7、D.確定分離純化的方法，根據(jù)要求純化。E.防止蛋白質(zhì)的變性。F.將昂貴、復(fù)雜的分離過程放最后。8、 介紹對蛋白質(zhì)定性分析的主要方法及其原理。序列分析：edman酶降解，序列分析儀肽質(zhì)量酶譜：將蛋白水解成片段，再用質(zhì)譜、色譜、電泳分離、比對Western blot ：利用抗原-抗體反應(yīng)9、 蛋白質(zhì)檢測分析需要哪些設(shè)備？-射線計數(shù)器、離心機(jī)、蛋白質(zhì)序列儀、層析柱、質(zhì)譜儀10、 蛋白組學(xué)研究的基本過程包括哪些？樣品制備-雙向電泳-斑點(diǎn)檢測-圖像分析-切去斑點(diǎn)-斑點(diǎn)溶解，質(zhì)譜分析-生物信息學(xué)分析11、 簡單介紹生物樣品中氨基酸組成分析的思路，包括哪些技術(shù)環(huán)節(jié)？把蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸，再用色譜進(jìn)行分離

8、定量。主要技術(shù)環(huán)節(jié)：鹽酸真空條件下水解、用HPLC分離定量。12、 介紹蛋白質(zhì)相互作用研究中的一些方法。Western blot 、生物傳感器、免疫共沉淀、其他13、 SDS-PAGE的主要原理是什么？介紹其基本流程。在PAGE體系中加入陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS），把蛋白質(zhì)樣品和含還原劑的樣品緩沖液混合，在100度條件下加熱3-5分鐘，使蛋白質(zhì)完全解離為亞基并與SDS結(jié)合。肽鏈結(jié)合大量SDS，所有蛋白質(zhì)具有相同的核質(zhì)比。此時蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物電泳的遷移率與蛋白質(zhì)所帶電荷無關(guān)，只與蛋白質(zhì)分子的大小有關(guān)。從而將不同分子量的蛋白質(zhì)分離。操作流程：A.樣品處理：a.分析蛋白質(zhì)溶液濃度，根據(jù)凝膠厚度和加樣孔大小、染色方法等，調(diào)整蛋白質(zhì)溶液濃度。b.與樣品緩沖液混合，在100度條件下加熱3-5分鐘，使蛋白質(zhì)完全解離為亞基并與SDS結(jié)合。c.處理好的樣品冰箱冷藏可短期保存。B.凝膠制備：準(zhǔn)備凝膠玻璃板，先配置分離膠，灌膠后輕輕加入一層薄水，待分離膠凝固后，準(zhǔn)備濃縮膠，迅速灌膠，并馬上插梳子。C.加樣：