對(duì)藥物胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)體外模型探究

1、.對(duì)藥物胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)體外模型探究BeWo細(xì)胞模型概述來源于人類惡性絨毛膜癌的3種滋養(yǎng)層細(xì)胞系BeWo,Jar和JEG表達(dá)了侵襲子宮的滋養(yǎng)層細(xì)胞的很多生物化學(xué)和形態(tài)學(xué)特征,因此這些細(xì)胞系被用來作為模擬胎盤屏障的模型6。其中,BeWo細(xì)胞系是最早建立的滋養(yǎng)層細(xì)胞系,已經(jīng)被證明是研究藥物和營養(yǎng)物質(zhì)通過滋養(yǎng)層跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)最有意義的模型,因?yàn)槠淠茉谙鄬?duì)較短的時(shí)間內(nèi)通過傳代維持并生長(zhǎng)為與胎盤滋養(yǎng)層相似的交融的細(xì)胞單層,可以表達(dá)與典型的滋養(yǎng)層一樣的激素分泌特性以及表達(dá)妊娠晚期滋養(yǎng)層的很多特性7,還與胎盤屏障存在相似的轉(zhuǎn)運(yùn)體,在頂側(cè)和基底側(cè)存在ATP-結(jié)合盒ATP-bindingcassette,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和可溶

2、性載體solutecarrier,SLC兩大家族中多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)8。模型的制作方法及鑒定BeWo細(xì)胞多用含胎牛血清FBS,10%、L-谷氨酸鹽1%、青霉素1×104U/mL、鏈霉素100mg/L的DMEM/F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)37、5%CO2,傳代后將其接種于Transwell小室TranswellInsert或Millicell小室MillicellInsert,孔徑0.4m的碳酸酯膜上,待細(xì)胞生長(zhǎng)為具有屏障性質(zhì)的交融層即可使用?？鏐eWo細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)一般在Transwell小室或程度擴(kuò)散池side-by-sidediffusioncell中進(jìn)展。在細(xì)胞層的頂側(cè)參加含有待測(cè)藥物

3、的Hanks平衡鹽溶液,在基底側(cè)參加空白Hanks平衡鹽溶液或相反操作,培養(yǎng)過程中定時(shí)從基底側(cè)或頂側(cè)取樣,測(cè)定兩側(cè)藥物含量,計(jì)算出藥物的表觀通透系數(shù)Papp9。BeWo細(xì)胞單層的完好性和功能性可通過以下指標(biāo)評(píng)價(jià)7,10:細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。電子顯微鏡或透射電鏡觀察單層細(xì)胞交融性和細(xì)胞間嚴(yán)密連接,在細(xì)胞培育46d時(shí),切除碳酸酯膜,透射電鏡觀察橫縱切面,可見細(xì)胞呈現(xiàn)連續(xù)單層,此時(shí)的細(xì)胞單層即可進(jìn)展跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。BeWo細(xì)胞單層的跨膜電阻transepithelialelectricalresistance,TEER。在細(xì)胞培育46d,TEER約達(dá)60?cm2時(shí),細(xì)胞單層即可進(jìn)展跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。漏出標(biāo)記物

4、被動(dòng)擴(kuò)散的跨膜通量。通常用甘露醇、葡聚糖T70、熒光素等熒光或放射性標(biāo)記物,考察一定時(shí)間內(nèi)BeWo細(xì)胞單層對(duì)低分子和高分子漏出標(biāo)記物的透過情況。模型的應(yīng)用及評(píng)價(jià)到目前為止,BeWo細(xì)胞系已經(jīng)成功用于研究多種營養(yǎng)物質(zhì)和化合物的不對(duì)稱的跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn),包括氨基酸、葡萄糖、膽固醇、葉酸、脂肪酸、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血清素、膽堿和免疫球蛋白等。近年來,利用該模型研究了多種營養(yǎng)物質(zhì)、藥物、有毒物質(zhì)等的跨胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)11-13。BeWo細(xì)胞是目前研究滋養(yǎng)層轉(zhuǎn)運(yùn)和藥物代謝的有效模型,缺乏之處在于BeWo細(xì)胞不能自發(fā)分化為合體滋養(yǎng)層,不能模擬人胎盤屏障構(gòu)造在妊娠期呈現(xiàn)的動(dòng)態(tài)變化過程。而且體外培養(yǎng)胎盤合體滋養(yǎng)層細(xì)胞需要的費(fèi)用較高

5、,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng),對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和條件要求也較高。胎盤組織模型概述胎盤組織培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便、快捷,對(duì)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和條件要求不高,易于開展,且妊娠各期胎盤組織均可獲得并進(jìn)展培養(yǎng)。體外培養(yǎng)的胎盤組織可以用來研究母體胎兒許多方面的互相關(guān)系,如轉(zhuǎn)運(yùn)、酶功能、營養(yǎng)物質(zhì)和異生物質(zhì)代謝14。目前可用于研究藥物胎盤代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)的胎盤組織模型有絨毛模型和質(zhì)膜囊泡模型兩種。模型的制作方法及鑒定胎盤絨毛組織從胎盤別離后被剪切為2mm大小的碎片,于含有藥物或營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中孵化通常進(jìn)展放射性標(biāo)記,以進(jìn)展這些藥物胎盤攝取的評(píng)價(jià)。培養(yǎng)一段時(shí)間后,組織碎片在蒸餾水中移除、洗滌和裂解,以釋放放射性底物,使用閃爍計(jì)數(shù)法分析結(jié)果。胎盤絨

6、毛模型可在體外維持組織構(gòu)造完好性至少達(dá)3h,通過檢測(cè)微絨毛邊緣膜、合胞體和質(zhì)膜的完好性,胎盤催乳素和雌二醇的分泌率,以及乳酸脫氫酶的釋放程度來評(píng)價(jià)絨毛的完好性和功能性15-17。模型的應(yīng)用及評(píng)價(jià)合體滋養(yǎng)層細(xì)胞形成了胎盤絨毛的最外層,因此,胎盤絨毛常用于藥物或營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)體功能研究。例如,研究氨基酸和葡萄糖的攝取,胎盤的葡萄糖和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的激素調(diào)節(jié),檢測(cè)P-糖蛋白P-gp的表達(dá)和活性15-16,18。近年來,胎盤絨毛模型常被用來研究胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)體功能的表達(dá)19-20。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞與滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)相比,其優(yōu)勢(shì)在于轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)在整個(gè)研究過程不易改變,且極性和細(xì)胞間的連接與體內(nèi)更加相似,優(yōu)

7、于培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞系或離體的細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞。胎盤絨毛模型已經(jīng)成功應(yīng)用于妊娠早期及足月胎盤的氨基酸的攝取研究,提示該模型可應(yīng)用于整個(gè)妊娠過程中胎盤攝取的相關(guān)研究17。胎盤絨毛模型可用于物質(zhì)在合體滋養(yǎng)層攝取的研究,但不能用于跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的研究。而且絨毛碎片由多種細(xì)胞組成,運(yùn)用該模型得到的結(jié)果不能完全反映滋養(yǎng)層細(xì)胞的攝取。模型的制作方法及鑒定質(zhì)膜囊泡來源于人足月胎盤上從合體滋養(yǎng)層細(xì)胞剝脫的外表微絨毛,將臍帶、胎膜和蛻膜從胎盤去除,于母體面切取組織,攪動(dòng)切碎物使微絨毛膜疏松,用兩層棉制紗布過濾,濾液通過差速離心、洗滌進(jìn)一步純化獲得微絨毛備用。通過監(jiān)測(cè)標(biāo)志性酶的活性來鑒別膜完好性和方向性:以具有活性的標(biāo)志性

8、酶含量代表頂膜囊泡的特性,如堿性磷酸酶和-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶;在洗滌劑存在與否的條件下,通過檢測(cè)核苷酸焦磷酸酶的活性判斷囊泡的方向性或兩面性21。模型的應(yīng)用及評(píng)價(jià)質(zhì)膜囊泡可以從滋養(yǎng)層的刷狀緣膜和基底面別離,可以分別研究其功能,進(jìn)而研究各自不同的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。例如,Ushigome等22研究P-gp的生理表達(dá)功能,證明了使用P-gp抑制劑、維拉帕米、環(huán)孢素A、孕激素或C129抗P-gp的單克隆抗體可以抑制胎盤膜囊對(duì)地高辛和長(zhǎng)春堿的吸收。近年來,胎盤微絨毛膜多被用來研究P-gp的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運(yùn)、陽離子化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、藥物與營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的互相作用,以及病理?xiàng)l件的胎盤上氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的差異23-24。質(zhì)膜囊泡制備是另一

9、種研究胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)的可行的體外模型,這一模型對(duì)于研究藥物或化學(xué)物質(zhì)透過質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制是很有意義的,但是其主要缺點(diǎn)是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的研究需要在不存在調(diào)節(jié)因子的條件下完成,因此不能完全反映在體情況25。結(jié)語綜上所述,人類胎盤灌流模型作為唯一完全保存胎盤構(gòu)造的模型,是研究藥物胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)最有價(jià)值的模型。BeWo細(xì)胞系也是研究藥物和營養(yǎng)物質(zhì)跨滋養(yǎng)層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)最有意義的模型,而且BeWo細(xì)胞模型與胎盤灌流模型預(yù)測(cè)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)果具有一致性26。但是這兩種方法都有其局限性,人類胎盤灌流模型制備過程比較復(fù)雜,并且不能用于研究妊娠早期的藥物胎盤轉(zhuǎn)運(yùn);BeWo細(xì)胞模型不能摸擬人胎盤屏障構(gòu)造在妊娠期呈現(xiàn)的動(dòng)態(tài)變化過程。因此,在實(shí)際研究過程中,需要權(quán)衡各種方法的利弊,結(jié)合多