雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊研制

1、雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊研制 摘要：目的制備長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊，以期提高口服時的存活率和常溫下的保存期。方法根據(jù)微膠囊在人工胃液中的耐酸性和在人工腸液中的崩解性，確定空氣懸浮法制備微膠囊的最佳工藝條件。掃描電鏡觀察微膠囊形態(tài)與大小。根據(jù)恒溫37、相對濕度6065條件下貯存3個月后菌體存活率，考察其貯存穩(wěn)定性。結(jié)果制備的微膠囊具有良好的耐酸性和腸溶性。微膠囊包囊產(chǎn)率56.49，包囊效率87.45。微膠囊表面覆蓋著一層光滑平整的囊膜，粒徑大小基本在400500m。加保護劑的微膠囊菌體存活率高于10，且遠遠高于凍干菌粉和無保護劑微膠囊組。結(jié)論確定了空氣懸浮法制備長雙歧桿菌

2、和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊的最佳工藝條件，微膠囊化有利于提高活菌的穩(wěn)定性。 關(guān)鍵詞：雙歧桿菌；嗜酸乳桿菌；微膠囊 中圖分類號：R944.9文獻標識碼：A文章編號： 1672979X(2009)07001106 目前多數(shù)微生態(tài)活菌制劑存在以下兩個亟待解決的問題：制劑經(jīng)口服時，活菌因不耐胃酸、膽汁和消化酶等的作用而極易失活；雙歧桿菌等厭氧菌易受外界環(huán)境因素(如氧氣、溫度)的影響2，常溫下貨架壽命短，要求在低溫下保存銷售，因而影響了此類產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售和應(yīng)用。目前微膠囊技術(shù)是保護菌體活力最有效和實用的方法，該技術(shù)是利用天然或合成的高分子材料，將固體、液體甚至是氣體的微小顆粒包裹在直徑從小于1m至50

3、00m的半透性或密封囊膜的微型膠囊內(nèi)1。由于微膠囊內(nèi)的物質(zhì)與外界隔離，可免受外界不利環(huán)境的影響，若采用腸溶性囊材，還可避免口服時胃液的破壞3。 空氣懸浮法(又稱流化床法)制備微膠囊，是將固體囊心物懸浮于由流化床產(chǎn)生的承載氣流中，呈沸騰狀。囊液由噴嘴噴出，霧化形成微液滴，在囊室與懸浮的囊心物相遇，液滴在囊心物表面鋪展并相互結(jié)合。由于氣體的不斷流動，溶解囊材的有機溶劑迅速揮發(fā)，聚合物在囊心物表面形成囊衣。被包囊的顆粒隨氣流在囊室循環(huán)，完成包囊與固化過程4。 本研究將空氣懸浮微膠囊技術(shù)應(yīng)用于微生態(tài)制劑，將長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、保護劑和雙歧因子包封于腸溶囊膜內(nèi)，制成長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌制劑

4、，以期提高口服時的菌體存活率和常溫下的保存期。 1材料 1.1菌種 長雙歧桿菌(Bifitdobacteriumlongum，簡稱BL，CICC6068)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，簡稱LA，CICC6005)：購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。 1.2培養(yǎng)基 長雙歧桿菌：大豆蛋白胨0.5g，胰蛋白胨0.5g，酵母粉1.0g，葡萄糖1.0g，低聚木糖0.5g，無機鹽溶液4mL，蒸餾水100mL，鹽酸半胱氨酸0.05g(培養(yǎng)基熱沸后加入)，調(diào)pH7.0，121滅菌15min。固體斜面加瓊脂1.52.0g。上述無機鹽溶液：CaCl20.2g，MgSO47H2O0.

5、48g，K2HPO41.0g，KH2PO41.0g，NaHCO310g，NaCl2g?；旌螩aCl2和MgSO4在300mL蒸餾水中溶解，加蒸餾水500mL，邊攪拌邊緩慢加入其它鹽類至溶解，加蒸餾水200mL混勻。 嗜酸乳桿菌：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，吐溫801mL，CH3COONa3H2O5g，K2HPO43H2O2g，MgSO47H2O0.58g，MnSO4H2O0.25g，蒸餾水1000mL，調(diào)pH6.26.4，121滅菌15min。固體斜面加瓊脂1518g。 1.3試劑 海藻糖：純度>99(日本林原商事)；透明質(zhì)酸(HA)：Mr=2

6、.0×106，批號20040516(山東福瑞達生物化工)；脫脂乳粉(黑龍江完達山乳業(yè))；聚丙烯酸樹脂(泰安明天化工)。 1.4儀器 YQXII厭氧培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械公司)；FreeZone6L冷凍干燥機(美國Labconco公司)；CR20B2高速冷凍離心機(日本HITACHI公司)；流化床包衣機(沈陽藥科大學(xué)提供)；SPX150恒溫培養(yǎng)箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；S520掃描電子顯微鏡(日本HITACHI公司)。 2方法 2.1凍干菌粉的制備 長雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌菌種分別活化，接種，37培養(yǎng)20h，于4、5000r/min離心10min收集菌體，濕菌體與保護劑和雙歧桿菌增

7、生促進劑低聚木糖溶液混和均勻，得菌懸液，冷凍干燥得凍干菌粉。凍干菌粉磨碎、篩分，將長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌2種菌粉等量混合，備用。保護劑的配方及其與菌泥的比例為：10海藻糖、0.6HA和20脫脂乳粉(長雙歧桿菌)或10海藻糖、0.2HA和10脫脂奶粉(嗜酸乳桿菌)分別以111的體積比復(fù)配后，再與菌泥以31的比例混合。低聚木糖的最后濃度為0.5，無保護劑組用磷酸鹽緩沖液代替保護劑。 2.2菌落計數(shù) 樣品經(jīng)適當稀釋后涂布于固體培養(yǎng)基上，每個稀釋度做4個重復(fù)，37厭氧培養(yǎng)20h后菌落計數(shù)。 2.3囊材液的配制 稱取適量聚丙烯酸樹脂，緩慢加入不斷攪拌的95乙醇溶液中，避免結(jié)塊，繼續(xù)攪拌至完全溶解，加入適

8、量輔料，混勻備用。 2.4空氣懸浮法制備微膠囊 稱取一次處理量的菌粉置于流化床上，調(diào)節(jié)適當?shù)目諝饬髁?，使菌粉呈沸騰狀；調(diào)節(jié)溫度、流速和霧化壓力，使囊液呈細小的液滴噴出。噴出的囊液與呈沸騰狀的菌粉相遇，制得微膠囊。 2.5人工胃液和人工腸液的配制 人工胃液：取稀鹽酸16.4mL，加水約800mL及胃蛋白酶10g，攪勻后加水定容至1000mL即得。 人工腸液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水500mL。用0.4氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8；另取胰酶10g，加水適量使溶解。將兩液混合后，加水定容至1000mL即得。 人工胃液和人工腸液均采用0.2m無菌微孔濾膜過濾除菌。 2.6微膠囊在人工胃液中的溶出測定

9、方法 取微膠囊1g，置于盛有50mL人工胃液(pH1.2)的三角瓶中，再置于(37±0.5)恒溫、轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上，分別于0，20，40，60，80，100，120min時取樣，測定其在600nm的透光率。另將經(jīng)上述處理的微膠囊離心取沉淀，用人工腸液解囊，適當稀釋后活菌計數(shù)，根據(jù)透光率和微膠囊內(nèi)活菌數(shù)變化分析人工胃液中微膠囊的溶出情況。 2.7微膠囊在人工腸液中的崩解測定方法 取微膠囊1g，置于盛有50mL人工腸液(pH6.8)的三角瓶中，再置于(37±0.5)恒溫、轉(zhuǎn)速為150r/min的搖床上，分別于0，10，20，30，40，50min時取樣，測定其在6

10、00nm的透光率。另將經(jīng)上述處理的微膠囊，適當稀釋后活菌計數(shù)，根據(jù)透光率和微膠囊內(nèi)活菌數(shù)變化分析人工腸液中微膠囊的崩解情況。 2.8微膠囊包衣處方的設(shè)計 以微囊增重、增塑劑鄰苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate，DEP)用量和潤滑劑硬酯酸鎂用量為試驗因素，以微膠囊在人工腸液中的崩解時間為主要指標，以微膠囊耐酸性(以在人工胃液中處理2h后菌存活率表示)為參考指標。正交試驗因素水平見表1。 表1正交試驗因素水平表 2.9微膠囊包囊產(chǎn)率和包囊效率的測定 產(chǎn)品中活菌數(shù)的測定：取微膠囊1g左右，置于50mL人工腸液中，按2.7所述方法處理45min，適當稀釋后活菌計數(shù)。 加入的活菌數(shù)測定：根

11、據(jù)微膠囊較菌粉增重計算，取與1g微膠囊相當?shù)木郏m當稀釋后活菌計數(shù)。 微膠囊中的活菌數(shù)=產(chǎn)品中的活菌數(shù)微膠囊表面的活菌數(shù) 微膠囊表面的活菌數(shù)測定：取微膠囊1g左右，置于50mL、pH5.0的磷酸鹽緩沖液中，按2.6所述方法處理45min，適當稀釋后活菌計數(shù)。 包囊產(chǎn)率=微膠囊中的活菌數(shù)/加入的活菌數(shù)×100 包囊效率=微膠囊中的活菌數(shù)/產(chǎn)品中的活菌數(shù)×100 2.10微膠囊穩(wěn)定性實驗 樣品裝在無菌敞口小瓶內(nèi)，小瓶置于干燥器中，用飽和亞硝酸鈉溶液調(diào)節(jié)干燥器內(nèi)相對濕度為6065，干燥器于37恒溫培養(yǎng)箱中貯存3個月，每月測定剩余活菌數(shù)，同時以凍干菌粉作對比實驗。 3結(jié)果與分析

12、3.1微膠囊化操作條件的確定 影響空氣懸浮微膠囊化效果的因素主要有：霧化壓力、噴液速度、空氣流量、進風溫度和物料處理量等。 包衣時噴霧液滴的直徑應(yīng)小于被包囊心，噴霧液滴的大小是噴液速度和霧化壓力綜合作用的結(jié)果。在恒定的霧化壓力下，加大噴液速度使液滴變大；在恒定的噴液速度下，加大霧化壓力液滴變小。不論何種原因引起的液滴粒徑變大都會增加粒子粘連的趨勢5。包衣前首先要進行噴霧測試，檢查噴霧狀態(tài)是否連續(xù)均勻。包囊微粒時，因包衣增重大，在不發(fā)生粘連的前提下，應(yīng)盡量加大噴液速度，以縮短包衣時間。 溫度對膜結(jié)構(gòu)的影響與成膜材料、溶劑、增塑劑種類及包囊物的理化性質(zhì)有關(guān)。進風溫度的選擇是以有機溶劑盡快揮發(fā)又不至

13、于使菌體失活為原則。一般用有機溶劑的囊液操作溫度應(yīng)低于水分散體的系統(tǒng)。溫度過高造成菌體失活，且衣膜干燥過速，易產(chǎn)生氣泡，表面粗糙；溫度過低，溶劑蒸發(fā)太慢，會引起包囊物粘結(jié)。 空氣流量的大小決定物料通過包衣區(qū)的速度和物料的流化狀態(tài)，因而該參數(shù)影響干燥效率和包衣均勻性。若氣流太高，會使菌粉流化時劇烈沸騰，不利于囊心物與囊液液滴充分地接觸；氣流過低，菌粉不能達到沸騰狀態(tài)，使循環(huán)包衣失敗。要通過實驗確定合適的空氣流量，既防止物料過多地吸附于柱筒壁上，又保證物料充分流化。 物料處理量是保證微囊化時批次間重現(xiàn)性的重要參數(shù)。當物料量增加時，為達到理想的流化效果，需要增加進風量，同時噴液速度及霧化壓力都要進行

14、相應(yīng)的調(diào)整，即物料處理量與其它微囊化操作條件是相對應(yīng)的。因此為得到穩(wěn)定的產(chǎn)品，每次的物料處理量應(yīng)一致。 綜合考慮上述因素，經(jīng)過反復(fù)實驗，確定流化床微膠囊化操作條件為：霧化壓力0.2MPa；空氣流量1012m3/min；流化床進氣溫度3545；囊液流速1mL/min；物料處理量510g。 3.2囊液濃度的確定 囊液濃度對噴霧性能產(chǎn)生重要影響。以95乙醇為溶劑，比較6，8，103種濃度的聚丙烯酸樹脂，發(fā)現(xiàn)6囊液黏度小，噴射時呈霧區(qū)高，單位體積囊材少，溶劑蒸發(fā)較慢；10囊液黏度過大，不容易被分散，液滴大且易阻塞噴嘴，增大氣流量時破壞囊心物的流化；而8囊液黏度適中，成膜效果好，溶劑蒸發(fā)速度適當，粘結(jié)現(xiàn)

15、象少。因此本研究所用囊液為以95乙醇為溶劑的8聚丙烯酸樹脂。 3.3微膠囊包衣處方優(yōu)化結(jié)果 制備微膠囊時，囊液的用量與囊心物的表面積有密切的關(guān)系。囊心物越細小，其比表面積越大，則囊材用量也越大。由于本研究采用的囊心物為凍干菌粉，形狀不規(guī)則，無法將其近似為球體來計算表面積，故可由最后產(chǎn)品增重來確定囊液的用量。 高聚物作為囊材，單獨應(yīng)用形成的薄膜在溫度降低后，物理性質(zhì)發(fā)生變化，囊膜變得硬而脆，容易破裂。為改進囊膜質(zhì)量，常在囊液處方中添加增塑劑。潤滑劑的作用是有助于粒子充分流化，減少粒子間粘連。增塑劑和潤滑劑的用量通過正交試驗確定，結(jié)果如表2、3。 正交試驗3個因素對微膠囊在人工腸液中崩解性的影響順

16、序是：微囊增重>硬酯酸鎂用量>DEP用量，最佳組合為：A1B1C3或A2B1C3。根據(jù)菌體在人工胃液中的存活率，最終選擇A2B1C3，即微膠囊較菌粉增重20，DEP用量10，硬酯酸鎂用量1.5。 表2L9(33)正交試驗方案與結(jié)果(n=5) 表3正交試驗極差分析結(jié)果 3.4微膠囊在人工胃液中的耐酸性 將凍干菌粉和微膠囊分別置于人工胃液中處理，于2h后取樣，用無菌水將膠囊顆粒清洗2次，再放入人工腸液中進行崩解，測經(jīng)人工胃液處理2h后囊中的活菌數(shù)。菌粉和微膠囊中的活菌數(shù)及存活率比較見表4。 表4菌粉與微膠囊在人工胃液中的存活率(n=5) 微囊化菌粉在人工胃液中處理2h后，存活率達到54

17、.08，而凍干粉的存活率僅為十萬分之一，表明直接服用凍干菌粉不能保證足夠量的活菌進入腸道，制備成腸溶性微膠囊后，其耐酸性顯著提高。 微膠囊經(jīng)人工胃液處理40min后，發(fā)生渾濁，透光率降低，表明有部分微膠囊因包囊不完全而發(fā)生滲漏，見圖1。40min后繼續(xù)處理至2h，透光率基本穩(wěn)定，表明微膠囊在人工胃液中基本不發(fā)生泄漏，耐酸性良好。 圖1微膠囊在人工胃液中的溶出情況(n=5) 3.5微膠囊在人工腸液中的崩解性 見表5。 微膠囊在人工腸液中逐漸溶解，處理至30min時，透光率降至最低值，且人工腸液中未見固體顆粒，30min后透光率和釋放率基本穩(wěn)定，表明微膠囊已完全崩解，見圖2。由此判斷，該法制備的微

18、膠囊具有良好的腸溶性。 3.6微膠囊包囊產(chǎn)率和包囊效率 測得微膠囊產(chǎn)品中的活菌數(shù)為9.56×109CFU/g，微膠囊表面的活菌數(shù)為1.2×109CFU/g，則微膠囊中的活菌數(shù)=9.56×1091.2×109=8.36×109(CFU/g)。根據(jù)微膠囊較菌粉增重20計算，每1g微囊含菌粉0.83g，因此加入的活菌數(shù)為1.48×1010CFU/g微囊。 3.7微膠囊貯存穩(wěn)定性實驗 將添加保護劑與未加保護劑的凍干菌粉分別制成微膠囊，再與凍干菌粉進行比較，活菌變化結(jié)果如表6。 微膠囊和菌粉在恒溫37、相對濕度6065條件下貯存3個月后，發(fā)現(xiàn)菌

19、粉吸水，粘連成團，顏色變深；微膠囊形態(tài)、顏色均無變化。貯存期間活菌數(shù)均逐步降低，菌粉微囊化后存活率顯著提高，加保護劑的微囊在貯存期間菌的存活率明顯高于未加保護劑的微囊。隨著保存時間的延長，這種差別更加明顯。加保護劑的微膠囊貯存3個月后，菌體存活率高于10，相當于室溫下貯存1年以上6。因此利用凍干保護劑結(jié)合微膠囊技術(shù)，能夠較好地解決微生態(tài)活菌制劑貯存穩(wěn)定性問題。 3.8微膠囊形態(tài)與大小 見圖3。菌粉為不規(guī)則狀固體，微膠囊表面覆蓋著一層光滑平整的囊膜，膜上均勻地鑲嵌著囊液中添加的增塑劑，微膠囊粒徑大小基本在400500m之間。 4結(jié)論 空氣懸浮法制備長雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌二聯(lián)活菌微膠囊的最佳工藝條件為霧化壓力：0.2MPa；空氣流量：1012m3/h；流化床進氣溫度：3545；囊液流速：1mL/min；物料處理量510g；囊液組成：8聚丙烯酸樹脂、10DEP、1.5硬酯酸鎂，溶劑為95乙醇；微膠囊較菌粉增重20。 微膠囊在人工胃液中處理2h后菌的存活率顯著高于凍干菌粉，在人工腸液中30min完全崩解，因此微膠囊具有良好的耐