生物技術(shù)專業(yè)復(fù)習(xí)資料(西南民大版)-酶工程

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上 酶工程復(fù)習(xí)1.生物酶工程：在化學(xué)酶工程基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，以酶學(xué)理論和以DNA重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，又稱為高級酶工程2、化學(xué)酶工程、研究的主要內(nèi)容：又為初級酶工程，是酶學(xué)理論與化學(xué)工程技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。主要研究內(nèi)容：酶的工藝制備、酶和細(xì)胞的固定化技術(shù)、酶分子化學(xué)修飾、人工酶的合成、酶反應(yīng)器和酶傳感器、酶的應(yīng)用等。3如何控制發(fā)酵產(chǎn)酶工藝條件：a. pH調(diào)節(jié)辦法：改變培養(yǎng)基組成或其比例；使用緩沖劑；添加適宜的酸堿溶液以調(diào)節(jié)pH值。b.溫度調(diào)控的方法：一般采用熱水升溫、冷水降溫；在發(fā)酵罐中，均設(shè)計(jì)有足夠熱傳面積的熱交換裝置，如排管、蛇管。c.溶氧量調(diào)

2、控的方法：調(diào)節(jié)通氣量、調(diào)節(jié)氧的分壓、調(diào)節(jié)氣液接觸時(shí)間、調(diào)節(jié)氣液接觸面積、培養(yǎng)液的特性對溶氧速率有明顯影響，若培養(yǎng)物粘度大，則不利于溶氧。4酶生物合成模式包括哪些類型？各類型有何特點(diǎn)？如何提高各種模式下酶產(chǎn)量？各產(chǎn)酶模式的一般產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程是怎樣的？a.同步和成型：又稱生長偶聯(lián)型，酶的合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，酶大量產(chǎn)生，細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶合成隨即停止。其方程為：dE/dt=X 特點(diǎn)：此類型生產(chǎn)的酶，其生物合成可以誘導(dǎo)，但不受分解代謝物阻遏和反應(yīng)產(chǎn)物阻遏。這類酶相應(yīng)的mRNA是很不穩(wěn)定的。提高酶產(chǎn)量：增加細(xì)胞生長速率，提高mRNA穩(wěn)定性，降低發(fā)酵溫度。b.延續(xù)合成型：部

3、分生長偶聯(lián)型，酶的合成伴隨細(xì)胞生長開始，但在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成較長的一段時(shí)間。其方程：dE/dt=X+X 特點(diǎn)：延續(xù)合成型的酶可受誘導(dǎo)但不受分解代謝物阻遏和產(chǎn)物阻遏，其對應(yīng)的mRNA很穩(wěn)定。提高酶產(chǎn)量：最理想模式，添加誘導(dǎo)物。c.中期合成型：酶的合成在細(xì)胞生長一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶的合成也隨即停止。其方程：dE/dt=X 特點(diǎn)：此類型合成的酶，受反應(yīng)產(chǎn)物反饋?zhàn)瓒?，其對?yīng)的mRNA是不穩(wěn)定的。提高酶產(chǎn)量：增加細(xì)胞生長速率，提高mRNA穩(wěn)定性，解除阻遏。d.滯后合成型：當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶才開始大量合成。其方程：dE/dt=X 特點(diǎn)：此類型合成的

4、酶，受分解代謝物阻遏，故在對數(shù)生長期不合成，但其mRNA穩(wěn)定性強(qiáng)，當(dāng)細(xì)胞停止生長，分解代謝物阻遏解除，才開始利用積累的mRNA進(jìn)行翻譯合成。提高酶產(chǎn)量：減少阻遏物濃度，盡量降解產(chǎn)生的阻遏物。5.提高酶產(chǎn)量的方法有哪些？A.要選育或選擇使用優(yōu)良的產(chǎn)酶細(xì)胞。B.打破調(diào)控機(jī)制。C添加表面活性劑、酶促進(jìn)劑、誘導(dǎo)物。6在發(fā)酵產(chǎn)酶中，溶氧速率受哪些因素的影響？a.通氣量：當(dāng)通氣量增大時(shí)可提高溶氧速率，反之使溶氧速率降低。b.氧的分壓：增加空氣壓力，或提高空氣中氧的含量都能提高氧的分壓，從而提高溶氧速率。反之則使溶氧速率降低c.氣液接觸時(shí)間：氣液兩相接觸時(shí)間延長，可使更多的氧溶解，從而提高溶氧速率；反之則使

5、溶氧速率降低。d.氣液接觸時(shí)間：增加氣流接觸界面的面積，有利于提高溶氧率。e.培養(yǎng)物的特性：培養(yǎng)液的粘度大，產(chǎn)生氣泡多，則不利于氧的溶解。通過改變培養(yǎng)液的組分或濃度，可有效地降低培養(yǎng)液粘度7影響酶提取的主要因素有哪些？a.溫度：通常抽提溫度應(yīng)控制在0-10，對某些耐溫的酶，如胃蛋白酶等，可以適當(dāng)提高抽提溫度。b.pH值：抽提液的pH值應(yīng)遠(yuǎn)離酶的等電點(diǎn)，不宜過高或過低。c.提取液體積：增加提取液用量，可提高提取率。d.添加保護(hù)劑：為了提高酶穩(wěn)定性，防止酶變性、失活等常加入一些保護(hù)劑。8常用的細(xì)胞破碎的方法主要有哪些？a.機(jī)械破碎法：通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)所產(chǎn)生的剪切力作用，使細(xì)胞破碎的方法，稱為機(jī)械破碎法

6、。包括：機(jī)械搗碎法、研磨法、勻漿法。b.物理破碎法：通過溫度、壓力、聲波等各種物理因素作用，使組織細(xì)胞破碎的辦法，包括：溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法。c.化學(xué)破碎法：利用各種化學(xué)試劑與細(xì)胞膜的作用，使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變而破碎的方法。包括：有機(jī)試劑、表面活性劑。d.酶學(xué)破碎法：在一定條件下，通過外加的酶或細(xì)胞自身存在的酶的作用，包括：外加酶處理、自溶法。9、利用沉淀技術(shù)分離制備酶有哪些方法？沉淀分離是通過改變某些條件，使溶液中某種溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出，與其他溶質(zhì)分離。方法：a.鹽析沉淀法：根據(jù)球蛋白在低鹽濃度的溶液中，溶解度隨鹽離子升高而增加，表現(xiàn)為鹽溶，而隨著鹽濃度繼

7、續(xù)升高，并超出某一上限時(shí)，其溶解度又會(huì)以不同速度下降，表現(xiàn)為鹽析。由于酶和雜蛋白在高鹽濃度的溶液中，其溶解度存在差別而建立的一種純化方法。最常用的鹽析鹽為（NH4)2SO4 b.等電點(diǎn)沉淀法：兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最低，而不同的兩性電解質(zhì)使不同等電點(diǎn)，由此可將酶純化。c.有機(jī)溶劑沉淀法：利用不同蛋白質(zhì)在有機(jī)溶劑中溶解度不同而使之分離的方法。d.復(fù)合沉淀法（選擇性沉淀法）：在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀，再用適當(dāng)方法把酶從復(fù)合物中重新析出。e.選擇性變性沉淀法：選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀而不影響所在的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離。10 利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同可以

8、選擇哪些技術(shù)將蛋白質(zhì)分離？等電聚焦，等電點(diǎn)結(jié)晶，等電點(diǎn)沉淀，層析聚焦11、什么是分子篩凝膠層析？又稱凝膠過濾、分子排阻層析，是以多孔凝膠為固定相利用溶液中酶與其他雜質(zhì)分子大小不同而進(jìn)行的分離技術(shù)。12什么是膜分離技術(shù)？借助一定口徑的各種高分子薄膜，將不同大小、不同性狀、不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿臃蛛x的技術(shù)，統(tǒng)稱為膜分離技術(shù)。13. 什么是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳？其原理及用途是什么？指在聚丙烯酰胺凝膠制備時(shí)，加入12%的十二烷基硫酸鈉（SDS），制成SDS-聚丙烯胺凝膠進(jìn)行電泳。原理：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液中加入SDS和硫基乙醇（一種還原劑）以后，硫基乙醇使蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原，SDS使蛋白質(zhì)的共價(jià)鍵破

9、壞，使多亞基的蛋白質(zhì)解離成各個(gè)亞基，在一定條件下1.4g SDS與1g蛋白質(zhì)或亞基結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。由于SDS陰離子帶負(fù)電荷，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物上就結(jié)合了大量陰離子，掩蓋了蛋白質(zhì)之間原來的電荷的差別。而SDS與蛋白質(zhì)結(jié)合后，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，在水溶液中都變成長橢圓形，為此，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在凝膠電泳中遷移率不再受到其原有電荷和分子形狀影響，而只決定于蛋白質(zhì)的分子量。用途：SDS-凝膠電泳主要用于測定蛋白質(zhì)的分子量。14. 親和層析技術(shù)的原理是什么？親和層析是利用生物分子之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化的技術(shù)。原理：酶與底物（包括輔助因子）、底物類似物或

10、其競爭性抑制劑之間都具有較高的生物親和力，能專一而可逆地形成酶-配基絡(luò)合物。因此，將這類配基偶聯(lián)固定于載體作為固定相時(shí)，含有待純化酶的溶液流經(jīng)該固定相，該酶就能迅速而有選擇性地與相應(yīng)配基結(jié)合，而其他雜質(zhì)流出固定相，從而達(dá)到純化該酶的目的。15.何謂酶分子修飾？通過各種方法使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的過程，稱為酶分子修飾。16酶分子修飾有哪些方法？分別有哪些修飾劑？a.金屬離子置換修飾：通過改變酶分子中所含的金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法稱為金屬離子置換修飾。通常都是二價(jià)金屬離子，如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。金屬離

11、子置換修飾只適用于本來結(jié)構(gòu)中含有金屬離子的酶。b.大分子結(jié)合修飾：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)改變，從而改變酶的特性與功能的方法，常用修飾劑：右旋糖酐，聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。修飾劑在使用前一般需經(jīng)活化。c.有限水解修飾：肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱為肽鏈有限水解，利用肽鏈有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的特性和功能的方法，常用修飾劑：各種專一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶d.酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾：酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾是指用各種小分子化合物對酶蛋白的AA殘基上的側(cè)鏈功能基團(tuán)進(jìn)行修飾，使這些基團(tuán)發(fā)生改變，從而引起次級鍵的變化，使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)

12、生變化，導(dǎo)致酶的功能與特性的改變。常用修飾劑：氨基修飾劑、羧基修飾劑、胍基修飾劑、巰基修飾劑e.氨基酸置換修飾：酶蛋白多肽鏈特定位置上的各種AA，是酶化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，若將肽鏈上某AA換成另外的AA，則會(huì)引起酶蛋白空間構(gòu)象某些改變f.物理修飾：通過各種物理方法，使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。17什么是固定化酶和固定化細(xì)胞？固定化酶：固定在載體上，并在一定空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。固定化細(xì)胞：固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。18常用的酶和菌體固定化的方法有哪些？A.吸附法：通過載體表面和酶分子表面之間的氫鍵、疏水鍵和-電子親和力等物理作

13、用力，將酶固定于不溶性載體的方法，稱為物理吸附法，簡稱吸附法。b.包埋法：將酶或含酶菌體包埋于各種多孔載體中，使酶固定化的方法，稱為包埋法。c.結(jié)合法:選擇適宜的載體，使之通過共價(jià)鍵或離子鍵，與酶結(jié)合在一起的固定化方法，稱為結(jié)合法。d.交聯(lián)法：利用雙功能試劑或多功能試劑在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，以共價(jià)鍵制備固定化酶的方法。e.熱處理法將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。19、酶固定化后其性質(zhì)都有哪些變化？為什么？酶分子經(jīng)固相化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)。酶分子處在一個(gè)與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會(huì)影響

14、酶原有的性質(zhì)。如微環(huán)境的化學(xué)組成，與酶相結(jié)合的表面結(jié)構(gòu)，底物進(jìn)入與底物排出微環(huán)境的速度，微環(huán)境的局部pH等。穩(wěn)定性：固相酶的穩(wěn)定性比游離酶高。熱穩(wěn)定性；對蛋白酶水解作用穩(wěn)定性； 對變性試劑作用的穩(wěn)定性；保藏穩(wěn)定性；最適溫度：固相酶的最適溫度一般比天然酶高，個(gè)別會(huì)有所降低；同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。最適pH：a.載體性質(zhì)對最適pH影響：用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH高；用帶正電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH低；用不帶電荷載體制備的固定化酶，最適pH一般不改變。b.產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH影響；若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶

15、最適pH比游離酶的最適pH要高。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶最適pH比游離酶的最適PH要低。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為中性時(shí)，固定化酶最適pH不變。底物特異性：固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經(jīng)固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經(jīng)固定化后專一性會(huì)發(fā)生變化。20什么是酶傳感器？是由固定化酶與能量轉(zhuǎn)換器密切結(jié)合而成的傳感器裝置，是生物傳感器的一種，已廣泛用于臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵、環(huán)境監(jiān)測等。21. 用交聯(lián)法如何制備固定化酶？利用戊二醛兩個(gè)醛基都可與酶蛋白分子的游離氨基反應(yīng)，形成Schiff堿，從而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶

16、或固定化菌體。將酶吸附于載體上，或者包埋于膠內(nèi)或微囊內(nèi)，然后再交聯(lián)制成固定化酶“網(wǎng)”膜或“網(wǎng)”顆粒。這種方法又稱為雙重固定化法。22分離制備堿性磷酸酶采用何種方法？分離的原理及主要的操作流程是什么？本實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑沉淀法從肝勻漿中分離純化堿性磷酸酶（AKP）。先用醋酸鈉（低滲破膜作用）制備肝勻漿。醋酸鎂則有保護(hù)和穩(wěn)定AKP的作用。勻漿中加入正丁醇可使部分雜蛋白變性，釋出膜中酶，過濾后以出去雜蛋白。含有AKP的濾液用冷丙酮和冷乙酸進(jìn)行反復(fù)分離純化。根據(jù)AKP在33%的丙酮或30%的乙醇中溶解，而在50%的丙酮或60%的乙酸中不溶解的性質(zhì)，用冷丙酮和冷乙酸重復(fù)分離提取，可從含有AKP的濾液中獲得

17、較為純凈的堿性磷酸酶。23. 如何測定酶作用的最適溫度,最適pH以及其可逆抑制劑對酶抑制作用的類型?一般的試驗(yàn)方法是在一定條件下先將酶在不同的溫度下處理一段時(shí)間，迅速降溫，然后再在一定溫度條件下測定酶活力。以處理溫度為橫座標(biāo)，酶反應(yīng)速度為縱座標(biāo)作圖?？傻玫矫傅臒岱€(wěn)定曲線，根據(jù)這條曲線即可求出酶的熱穩(wěn)定范圍一般的試驗(yàn)方法是將酶液分成若干份，分別置于一系列不同的pH的溶液中保溫處理一定時(shí)間，然后再調(diào)至某一標(biāo)準(zhǔn)的pH或直接在最適pH條件下進(jìn)行活力測定。以處理的pH值為橫座標(biāo)、反應(yīng)速度為縱座標(biāo)作圖?？傻玫矫傅乃釅A穩(wěn)定性曲線，由此即可求出酶的酸堿穩(wěn)定范圍。添加抑制劑，以反應(yīng)速度倒數(shù)1/V 或1/A510

18、作縱座標(biāo)，以底物濃度倒數(shù)1/S為橫座標(biāo)，作圖，觀察直線在縱軸和橫軸上的交點(diǎn)位置并計(jì)算其Km值，與未加抑制時(shí)的Km值比較。說明該抑制劑屬于何種類型。競爭抑制km增大，vm不變,非競爭抑制是km不變，vm減小。反競爭是兩者都發(fā)生了變化24. 用固定化L-氨基酸?；缚缮a(chǎn)什么產(chǎn)品？生成L-氨基酸。將化學(xué)合成的N-?；?DL-氨基酸經(jīng)L-氨基酸?；高M(jìn)行不對稱水解，L?；被岜凰馍蒐-氨基酸，余下的N-?；?D-氨基酸經(jīng)化學(xué)消旋再生成DL-?；被?，重新進(jìn)行不對稱水解。反復(fù)進(jìn)行，可將DL-?；被釒缀醵甲兂蒐-氨基酸。工業(yè)上已用固定化L-氨基?；高B續(xù)生產(chǎn)L-苯丙氨酸和L-色氨酸。25.酶在食品、