豆角中血細(xì)胞凝集素的分離提純及分子量測(cè)定

1、豆角中血細(xì)胞凝集素的分離提純及分子量測(cè)定參賽者資料：南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 06級(jí)臨床醫(yī)學(xué)五年制專業(yè)摘 要目的：分離提純豆角中血細(xì)胞凝集素及測(cè)定分子量方法：凝膠層析法，SDS-PAGE電泳關(guān)鍵詞：豆角 血細(xì)胞凝集素 凝膠層析 SDS-PAGE電泳1 前言近年來，豆角中毒事件屢次發(fā)生，受到了各界廣泛的關(guān)注。據(jù)一些研究表明其毒性物質(zhì)為豆角血細(xì)胞凝集素。它是廣泛存在于各種植物中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，在高溫中可被分解破壞，但在菜肴烹飪中如不注意火候溫度，便容易使人誤食未經(jīng)高溫滅活的血細(xì)胞凝集素而導(dǎo)致凝集素中毒。凝集素中毒潛伏期可長可短，一般在2-4小時(shí)。中毒者會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛腹瀉、頭疼、頭暈、心慌胸

2、悶、出冷汗、手腳發(fā)冷、四肢麻木、畏寒等癥狀。血細(xì)胞凝集素是動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞都能夠合成和分泌的、能與糖結(jié)合的蛋白質(zhì),在細(xì)胞識(shí)別和粘著反應(yīng)中起重要作用,主要是促進(jìn)細(xì)胞間的粘著，因具有一個(gè)以上同糖結(jié)合的位點(diǎn)，因此能夠參與細(xì)胞的識(shí)別和粘著。2實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)通過對(duì)豆角中血細(xì)胞凝集素的粗提取，應(yīng)用凝膠層析法對(duì)其分離提純，并且應(yīng)用SDS-PAGE電泳測(cè)定其蛋白質(zhì)相對(duì)分子量，來進(jìn)一步研究豆角中血細(xì)胞凝集素的生物化學(xué)性質(zhì)及意義。3 實(shí)驗(yàn)原理31 血細(xì)胞凝集素特性：血細(xì)胞凝集素是一種非免疫來源的、對(duì)糖及其綴合物可逆專一識(shí)別的蛋白質(zhì)分子，它是能夠可逆地結(jié)合到特異單糖或多糖上的蛋白質(zhì)，故可通過葡萄糖洗脫液洗脫分離。

3、32 凝膠是一種經(jīng)過交聯(lián)而具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多聚體，因其有立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)故有分子篩效應(yīng)，利用凝膠層析可以脫鹽，分離提純蛋白質(zhì)。33 聚丙烯酰胺，即丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（CH2=CHCONH2）2-CH2(縮寫B(tài)is)在催化劑過硫酸銨（NH4）2S2O8作用下形成凝膠。反應(yīng)液中還加有四甲基乙二胺（TEMED）用來引發(fā)和控制聚合反應(yīng)。反應(yīng)混合物在底部用1.5%瓊脂凝膠封閉，反應(yīng)液頂部覆蓋一層水層，保證凝膠表面平坦，同時(shí)起到隔離大氣中氧氣的作用，因?yàn)檠鯕饪梢种凭酆戏磻?yīng)。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺

4、凝膠電泳一般可分成1225個(gè)組分。因此適用于不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。4 實(shí)驗(yàn)設(shè)備名稱規(guī)格數(shù)目備注恒溫水浴箱-1臺(tái)自動(dòng)部分收集器-1臺(tái)蠕動(dòng)泵-1臺(tái)組織搗碎機(jī)-1臺(tái)普通離心機(jī)3000r/m1臺(tái)移液槍10L，100L各一試管、燒杯小號(hào)各3個(gè)SDS-PAGE電泳儀-1臺(tái)染色/脫色皿-1個(gè)濾紙-5塊層析柱1.0*25cm1個(gè)筆記本電腦-1臺(tái)搖床-1臺(tái)為自備用品，無需主辦方提供。為非必須器材，主辦方?jīng)]有則不必準(zhǔn)備5 實(shí)驗(yàn)材料及試劑51試劑的配制511 蒸餾水 500mL512 Sephadex G50 (自備)513 1M的氯化鈉溶液 1000mL514 含0.5M葡萄糖的1M的氯化鈉溶

5、液 500mL515 下膠：（12%） 水-9.9mL 30%丙烯酰胺溶液-12.0mL 1.5mol/L Tris(pH8.8)-7.5mL 10% SDS-300L 10%過硫酸氨-300L TEMED-12L516 上膠：（6%） 水-4.1mL 30%丙烯酰胺溶液-1000L 1.5mol/L Tris(pH6.8)-750L 10% SDS-60L 10%過硫酸氨-60L TEMED-6L517 染色液：0.5g考馬斯亮藍(lán)R250，90mL甲醇，20mL冰乙酸，加水至200mL518 脫色液：90mL甲醇，20mL冰乙酸，加水至200mL519 10×電泳緩沖液（pH 8.

6、3）：稱取3.0g Tris base，14.4g Glycine，SDS 1.0g加雙蒸水至100mL溶解。5110 2×樣品緩沖液：0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8)2.0mL，甘油2.0mL，20%SDS(w/v)2.0mL，-巰基乙醇1.0mL，0.1%溴酚藍(lán)（w/v）0.5mL，雙蒸水2.5mL52材料的處理521新鮮四季豆的種子6實(shí)驗(yàn)操作步驟61血細(xì)胞凝集素粗提611 取樣：取600g新鮮四季豆，取其種子。612 將上述種子用組織搗碎機(jī)搗碎，用微孔篩過濾取其濾液。613 將濾液置于離心管中，3000r/m離心十分鐘，取上清液。62血細(xì)胞凝集素提純621 凝膠

7、層析分離 1.裝柱：取直徑為1.0 cm，長度為 25 cm的層析柱，自頂部用玻璃管引流緩緩連續(xù)加入稀薄的Sephadex G50懸液，待凝膠上升至距頂柱約3-5 cm即可，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵，用1M NaCl溶液平衡10分鐘。 2.加樣：取樣品離心所得上清液上柱，靜置10分鐘。3.洗脫（1M氯化鈉）用1M的氯化鈉緩慢洗脫，啟動(dòng)自動(dòng)部分收集器開始收集洗脫液，設(shè)定為每3分鐘換一個(gè)玻璃試管（每管4mL），連續(xù)收集9管（3個(gè)柱體積），關(guān)閉自動(dòng)部分收集器，在各管中分別液在 280 nm 紫外光上比色檢測(cè)并記錄數(shù)值，直至吸光值下降到接近零為止。此洗脫峰為不與葡萄糖親和的雜蛋白峰。4.再洗脫（0.5M葡萄糖/1M

8、 NaCl）：改用含0.5M葡萄糖的1M NaCl進(jìn)行洗脫，啟動(dòng)自動(dòng)部分收集器開始收集洗脫液，設(shè)定為每3分鐘換一個(gè)玻璃試管（每管4mL），連續(xù)收集9管，關(guān)閉自動(dòng)部分收集器，在各管中分別取液在280nrn紫外光上比色檢測(cè)并記錄數(shù)值，直至吸光值下降至接近零為止。此洗脫峰為凝集素峰。5.取血細(xì)胞凝集素峰時(shí)的洗脫液，置于小試管中。此為四季豆中血細(xì)胞凝集素的提取液。63血細(xì)胞凝集素的分子量測(cè)定631安裝垂直電泳槽模具，并用瓊脂糖溶液封邊。632配制分離膠（下膠）：（12%）水9.9mL，30%丙烯酰胺溶液12.0mL，1.5mol/L Tris（pH8.8 7.5mL），10% SDS300L，10%過

9、硫酸氨300L，加入TEMED 12L后應(yīng)立即混合均勻，加入到凝膠模具中，并留出濃縮膠所需空間（梳齒長加1cm），用吸管沿玻璃板壁小心滴加一層水飽和正丁醇或雙蒸水，在凝膠與覆蓋液之間會(huì)看見一個(gè)明顯的分界面，然后將凝膠垂直置于室溫下，不要隨意移動(dòng)以免凝膠聚合后表面不平，分離膠最好在30min左右聚合。聚合后，原有的分界面消失，而在稍低的部位將會(huì)出現(xiàn)另一分界面，這就是聚合后的凝膠表面。傾出覆蓋層液體，用蒸餾水洗滌凝膠頂部數(shù)次，除去未聚合的丙烯酰胺，并用濾紙吸去殘留的液體。633制備濃縮膠（上膠）：（6%）水4.1mL，30%丙烯酰胺溶液1000L，1.5mol/L Tris(pH6.8)750L，

10、10% SDS 60L，10%過硫酸氨60L，加入TEMED 6L后將配好的濃縮膠溶液快速混合后灌注在已聚合的分離膠上，并立即在濃縮膠溶液中插入干凈的梳子，將凝膠垂直放置于室溫下，避免移動(dòng)。634濃縮膠聚合后，小心撥出梳子，用雙蒸水沖冼加樣槽除去未聚合的丙烯酰胺，將凝膠固定在電泳裝置上，加入10×電泳緩沖液。635取待測(cè)凝集素提取液50L加入EP管中，再加入2×樣品緩沖液50L，混合均勻，在100攝氏度水浴中煮沸10min。636在第一個(gè)電泳槽中加入高分子量marker637待提取液冷卻后，用移液器取30L溶液加入凝膠電泳槽中。638加樣完畢，把電泳裝置放在電泳槽內(nèi)，使電泳

11、裝置底部電極絲浸于緩沖液中，將電泳裝置的負(fù)極與電泳液相接，將電流設(shè)置在90-120V，樣品應(yīng)10min之內(nèi)進(jìn)入濃縮膠，否則說明鹽濃度過大。待測(cè)樣品進(jìn)入分離膠后可將電源調(diào)至120-160V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，關(guān)閉電源。639從電泳裝置上卸下玻璃板，放在濾紙上，撬開玻璃板，取出凝膠，在凝膠下緣切角標(biāo)記位置。6310將凝膠板輕輕放入染色液中染色，40染色1h。倒出染色液以后備用，用蒸餾水沖洗酌留的染色液。將凝膠浸入脫色液中，其間更換34次脫色液，直至背景透明，回收后的脫色液經(jīng)活性炭吸附后可重復(fù)使用。6311干膠制作方法：將凝膠包在兩層浸濕的玻璃紙間，四周用夾子或膠帶紙固定在玻璃板上，

12、室溫下自然干燥，待凝膠干燥后去掉玻璃板，即可長期保存。7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄1MNaCl洗脫表格(表-1)試管號(hào)12345吸光值1.8412.4660.8950.3620.140試管號(hào)6789吸光值0.0820.0550.0250.0030.5M葡萄糖/1M NaCl洗脫表格(表-2)試管號(hào)12345吸光值2.6020.5352.3450.2680.215試管號(hào)6789吸光值2.5420.1252.6230.030根據(jù)表-2中的吸光度值，取1,3,6,8號(hào)試管中的樣品50L，各加入2×樣品緩沖液50L，煮沸10分鐘，然后8000r/m離心5分鐘，各取上清液10L上樣。將電泳結(jié)果通過數(shù)碼相機(jī)

13、拍攝并將相片輸入筆記本電腦，用gelpro32軟件分析。結(jié)果如圖：（圖-1）（圖-2）Lanes:Lane 1Lane 2Lane 3Lane 4Lane 5Rows(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)(mol.w.)(amount)r11163.133101.93.674111.12.2411162.475121.10.885r266.21.49963.081.14961.570.98063.082.647r3452.67139.133.67141.381.79841.382.80642.556.35

14、3r4354.71232.807.76333.664.98632.803.60732.808.795r5251.00724.411.65327.0110.74r618.40.69017.140.54115.62.34515.970.456r715.64.75014.534.26614.538.06911.481.73911.4812.12（圖-3）8 結(jié)果討論與分析81 從表-1中可以看出,雜蛋白的洗脫峰集中在第一個(gè)柱體積的洗脫液里,即此洗脫液中蛋白含量最高(如用280紫外自動(dòng)檢測(cè)儀檢測(cè),在第一個(gè)柱體積的洗脫液時(shí)可出現(xiàn)明顯峰值) .82 從表-2中可看出,與葡聚糖親和蛋白的洗脫峰不連續(xù)出現(xiàn),原

15、因可能有以下兩方面:層析柱成柱時(shí)沒有一次性成柱,導(dǎo)致柱各段不均勻;目的蛋白與葡聚糖結(jié)合不連續(xù),呈分段結(jié)合.83 層析柱上樣后,待樣品完全進(jìn)入層析柱時(shí)關(guān)閉蠕動(dòng)泵停止洗脫(根據(jù)顏色判斷樣品是否完全進(jìn)入層析柱),等待10分鐘左右,可以使樣品中的目的蛋白與葡聚糖充分結(jié)合,從而使第二次洗脫時(shí)目的蛋白的峰值更明顯,增加洗脫所得目的蛋白含量.84 根據(jù)血細(xì)胞凝集素的特性：血細(xì)胞凝集素是一種非免疫來源的、對(duì)糖及其綴合物可逆專一識(shí)別的蛋白質(zhì)分子，它能夠可逆地結(jié)合到葡聚糖上，故可通過葡萄糖洗脫液洗脫分離。故血細(xì)胞凝集素可以導(dǎo)致人體內(nèi)糖蛋白的聚合變性導(dǎo)致中毒。85 根據(jù)gelpro32分析電泳結(jié)果，由圖-1可知在116KDa處有峰值，結(jié)合圖-2，圖-3可知其為目的蛋白。9注意事項(xiàng)91 在凝膠制備過程中防止微生物感染。92 爭取一次成膠，避免在制膠過程中使氣泡進(jìn)入凝膠內(nèi)。93 在洗脫時(shí)用蠕動(dòng)泵調(diào)節(jié)控制洗脫液的流速。93 安裝電泳槽時(shí)要注意均勻用力旋緊固定螺絲，避免緩沖液滲漏。94 用瓊脂(糖)封底及灌膠時(shí)不能有氣泡，以免電泳時(shí)影響電流的通過。95 加樣時(shí)樣品不能超出凹形樣品槽。