環(huán)境水樣品中大腸桿菌及糞耐熱大腸桿菌的檢測

1、環(huán)境水樣品中大腸桿菌及糞（耐熱）大腸桿菌的檢測【摘要】本次實(shí)驗采用多管發(fā)酵法檢測環(huán)境水樣中大腸桿菌及糞大腸桿菌（環(huán)境水樣取用水果湖樣點(diǎn)水樣）。本次試驗（多管發(fā)酵法）的主要步驟為：將待測水樣稀釋三個（實(shí)際上做了四個）適宜稀釋倍數(shù)梯度，接種在乳糖蛋白胨培養(yǎng)液中，37下培養(yǎng)24h，觀測結(jié)果。產(chǎn)酸產(chǎn)氣為陽性結(jié)果，不產(chǎn)酸產(chǎn)氣為陰性。將陽性管中菌液取定量接種于EC肉湯培養(yǎng)液中，45下培養(yǎng)24h，觀測結(jié)果。產(chǎn)酸并產(chǎn)氣為陽性結(jié)果，不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣為陰性。將陽性管中菌及之前37管中菌接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上，于對應(yīng)溫度下培養(yǎng)24h，鏡檢。根據(jù)菌落形態(tài)和顏色，可確認(rèn)大腸桿菌陽性結(jié)果。根據(jù)大腸桿菌陽性管數(shù)的MPN檢索可查

2、水樣中總大腸桿菌和耐熱大腸桿菌的最大或然數(shù)。再與中華人民共和國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)對比，判定水質(zhì)?！娟P(guān)鍵詞】 環(huán)境水樣 大腸桿菌 耐熱大腸桿菌 多管發(fā)酵法 最大或然數(shù)（MPN） 產(chǎn)酸產(chǎn)氣 【前言】水體的污染程度可大致由總大腸桿菌數(shù)及耐熱大腸桿菌數(shù)反映出來。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，無芽胞，糖代謝時可產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可使溴甲酚紫由紫色變?yōu)辄S色，并可通過伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基鑒定，大腸桿菌發(fā)酵乳糖造成的酸性環(huán)境，使兩種染料結(jié)合成復(fù)合物，使菌群產(chǎn)生帶核心的，有金屬光澤的深紫色菌落。耐熱大腸桿菌是一種特殊的大腸桿菌，由于它多見于人類或動物的糞便中，可耐高溫，當(dāng)由37環(huán)境變?yōu)?5時，依舊可以正常

3、生長。當(dāng)水體被糞便污染時，其含量較高，由此判斷水質(zhì)高低。【材料與方法】：（一） 材料乳糖蛋白胨培養(yǎng)液：蛋白胨10g、牛肉膏3g、乳糖5g、氯化鈉5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml、蒸餾水1000ml （10ml/試管+小倒管 20支）EC肉湯培養(yǎng)基：胰蛋白胨20g、3號膽鹽1.5g、乳糖5g、磷酸氫二鉀4g、磷酸二氫鉀1.5g、氯化鈉5g、蒸餾水1000ml （10ml/試管+小倒管 10支） 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基：蛋白胨10g、乳糖10g、磷酸氫二鉀2g、瓊脂2030g、2%伊紅水溶液20ml、0.5%美藍(lán)水溶液13ml、蒸餾水1000ml （150ml/瓶） 4.5 mL無菌水：4支 （二）

4、器材無菌1 mL移液管：4支；40200 微升移液器、吸氣器：各1支；200微升無菌Tip：20只；載玻片和蓋玻片若干；革蘭氏染色各試劑；培養(yǎng)皿若干套；酒精燈；顯微鏡等（二） 原理及方法1、 樣品的稀釋和培養(yǎng)： 取原環(huán)境水樣0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成 10-1樣品；再從10-1樣品中溶液取0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成10-2樣品；再從10-2樣品中溶液取0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成10-3樣品，再從10-3樣品中溶液取0.5ml加入到4.5ml無菌水中，混合均勻，制成10-4樣品，每個稀釋度兩管。再從10-1、10-2 、10

5、-3和10-4樣品中各取1ml到乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中（每個稀釋度樣品各5支試管）2、初發(fā)酵實(shí)驗：原理：發(fā)酵管內(nèi)裝有乳糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，并倒置杜氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細(xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細(xì)菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內(nèi)加有溴甲酚紫作為PH指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。溴甲還有抑制其他細(xì)菌如芽孢桿菌的生長的作用。方法：（1）將上述15支試管放入37中培養(yǎng)24h；（2）取出試管觀察，若發(fā)現(xiàn)試管由紫色變成了黃色，即證明產(chǎn)酸；若發(fā)現(xiàn)小倒管中有氣泡產(chǎn)生，即證明產(chǎn)氣；（3）記錄各試管的產(chǎn)酸產(chǎn)氣的情況，將陽性反應(yīng)（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）的試管中的樣品取一滴

6、（50）L轉(zhuǎn)接于EC培養(yǎng)基上，并做好標(biāo)記。注：在量少的情況下，也可能延遲48h后才產(chǎn)酸產(chǎn)氣，此時應(yīng)視為可疑結(jié)果。48h培養(yǎng)后仍不產(chǎn)酸產(chǎn)氣的為陰性反應(yīng)。 3、45培養(yǎng)鑒定： 原理：37下培養(yǎng)產(chǎn)生陽性反應(yīng)的試管樣品不一定是全部都是糞大腸桿菌，經(jīng)過45下培養(yǎng)，若還能產(chǎn)生陽性反應(yīng)的即可能為糞大腸桿菌（耐熱性較好） 方法：（1）將上一步接種的EC培養(yǎng)基的試管置于45下培養(yǎng)24h； （2）取出試管觀察，記錄發(fā)生陽性反應(yīng)的試管（產(chǎn)酸并產(chǎn)氣）4、平板分離： 原理：伊紅美藍(lán)瓊脂平板含有伊紅和美藍(lán)染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結(jié)合成復(fù)合物，使大腸菌群產(chǎn)生帶核心的、有金屬光澤的

7、深紫色（龍膽紫的紫色）陽性菌落。 方法：（1）將37培養(yǎng)管（48h）和45培養(yǎng)中的發(fā)生陽性反應(yīng)的試管中的菌接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)平板，分別再于37和45的條件下培養(yǎng)過夜。 （2）培養(yǎng)過夜后取出平板，挑選深紫色、具金屬光澤，紫黑色、不帶或略帶金屬光澤，淡紫紅色中心顏色較深的菌落。 5、革蘭氏染色： 原理：大腸桿菌為革蘭氏染色陰性菌，經(jīng)過革蘭氏染色后在顯微鏡下顯示為紅色桿狀（有的能觀察到芽胞）。 方法：挑選伊紅美藍(lán)培養(yǎng)陽性的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢為紅色且無芽胞即為大腸桿菌群。 6、查閱MPN表，得出全部大腸桿菌和耐熱大腸桿菌的最可能數(shù)?！窘Y(jié)果與討論】1. 實(shí)驗結(jié)果記錄 1.1 37培養(yǎng)24小時后，

8、10-1、10-2和10-3均產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為陽性結(jié)果；10-4中只有C管產(chǎn)酸產(chǎn)氣，其余四管不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣?，F(xiàn)象試管號產(chǎn)酸產(chǎn)氣10-1 A + B +C + D + E +10-2 A + B +C + D + E +10-3 A + B +C + D + E +10-4 A B C + D E “+”為有此現(xiàn)象，“”為無此現(xiàn)象。37 10-1稀釋度37 10-2稀釋度 37 10-3稀釋度37 10-4稀釋度1.2 陽性管中樣品接種于EC培養(yǎng)基（16管），45培養(yǎng)24小時后，10-1、10-2和10-3的AE管均產(chǎn)渾濁產(chǎn)氣，10-4的C管中不產(chǎn)渾濁不產(chǎn)氣（A、B、D、E管37下為陰性，不接種至45

9、）現(xiàn)象試管號產(chǎn)酸產(chǎn)氣10-1 A + B + C + D + E +10-2 A + B + C + D + E +10-3 A + B + C + D + E +10-4 C 45 10-1稀釋度45 10-2稀釋度45 10-3稀釋度1.3 37和45培養(yǎng)過24小時后的陽性和假陽性管中的菌于伊紅美蘭平板培養(yǎng)，鏡檢結(jié)果及革蘭氏染色結(jié)果如下：試管號現(xiàn)象溫度 37 45菌落顏色菌體形狀革蘭氏染色菌落顏色菌體形狀革蘭氏染色10-1A白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性B白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性C白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀

10、陰性D白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性E白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性10-2A白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性B白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性C白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性D白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性紫，無明顯金屬光澤 短桿狀陰性E白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性紫，無明顯金屬光澤 短桿狀陰性10-3A白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性B白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性C白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短

11、桿狀陰性D白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性E白，外區(qū)紫并有金屬光澤桿狀陰性深紫，金屬光澤 短桿狀陰性10-4A無菌落桿狀陰性B少量透明菌落桿狀陰性C少量透明菌落（略帶紫）桿狀陰性D少量透明菌落桿狀陰性E無菌落桿狀陰性伊紅美藍(lán)實(shí)驗 37伊紅美藍(lán)實(shí)驗 45革蘭氏染色結(jié)果，依次為陽對，陰對，樣品代表1.4 查MPN表結(jié)果45時，10-1、10-2、10-3的陽性管數(shù)依次為5,5,5。通過生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法微生物指標(biāo)（GB/T5750.12-2006）查表可知，環(huán)境水樣品的總大腸菌群數(shù)為1600MPN/100ml，即160000MPN/L。2. 有關(guān)該樣品水質(zhì)的判斷根據(jù)中華

12、人民共和國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB3838-2002)，該樣品水質(zhì)為類（糞大腸菌群（個/L）<=40000）。3. 結(jié)果分析 （1）實(shí)驗檢測結(jié)果表明，取樣點(diǎn)（水果湖）的水質(zhì)為類，屬于較差級別類。我們根據(jù)取樣點(diǎn)的圖片（如下）分析，該處河流渾濁，顯棕綠色，且河水流速小，周圍植被覆蓋少，附近可能有下水道排污口，因此水中大腸桿菌的含量較多。特別是糞大腸桿菌，能在該環(huán)境下進(jìn)行大量繁殖，造成水體污染。（2） 本實(shí)驗中，在37前三個稀釋度的伊紅美藍(lán)實(shí)驗對應(yīng)的接種區(qū)均是白色菌落和紫色金屬光澤菌落同時存在，且都不少，而在45的三個稀釋度的15個接種區(qū)里均是深紫帶金屬光澤。說明在37下還有大腸桿菌之外的別種

13、菌也是優(yōu)勢菌種，而耐熱大腸桿菌能耐高溫，在45下成了唯一的優(yōu)勢菌種，從而白色菌落未出現(xiàn)。（3）在37下顯示為陽性的10-4C管在45下為陰性，可能的原因有是，那一管中確有大腸桿菌，只是耐熱大腸桿菌濃度極低或沒有，所以在高溫下顯示為陰性。而至于為什么同稀釋度其它四管沒有此現(xiàn)象，可能是該稀釋度的菌液沒有混合均勻造成的。（4）本實(shí)驗檢測的對象為大腸菌群，大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。大腸菌群

14、是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小?！緦?shí)驗感想】 微生物學(xué)與我們的生活緊密相關(guān)，不僅是因為微生物在現(xiàn)實(shí)世界里無處不在，更是因為它們對我們生活的影響表現(xiàn)在與人類及其他生物的方方面面。與生科院其他實(shí)驗一樣，我們在教學(xué)周里不斷演練著基本的實(shí)驗技巧，并在最后的開放實(shí)驗中將之運(yùn)用到實(shí)際，并解決一些簡單的問題，為今后更高層次的科學(xué)研究打下基礎(chǔ)。與大一的動生、植生實(shí)驗不同的是，我們的每一次實(shí)驗可討論的東西都更多，需要開始查找大量的文獻(xiàn)資料，這是一個生科人的特點(diǎn)，也極大地提高了我們閱讀、理解并運(yùn)

15、用高水平資料的能力。在論文的海洋里，我們發(fā)現(xiàn)了更多與微生物相關(guān)的信息，極大地拓寬了我們的視野，激發(fā)了我們的興趣。 此次開放實(shí)驗雖然操作過程較為簡單，但卻教會我們?nèi)绾螌⒁环菸募嬲x懂，并學(xué)會實(shí)際運(yùn)用。我想這就是老師開設(shè)此開放實(shí)驗真正目的。經(jīng)過本次對水樣品中微生物的含量檢測，我們意識到微生物在我們生活中的巨大作用，既有積極方面也有消極方面。我們可以利用微生物為我們提供很多環(huán)境信息，以警示我們周圍環(huán)境的狀況。環(huán)境惡化的罪魁禍?zhǔn)撞皇俏覀冇^測到的微生物，而是我們?nèi)祟悓Νh(huán)境的破壞和沒有及時有效地進(jìn)行改善。從這么多年對武漢典型地點(diǎn)的水樣結(jié)果來看，水質(zhì)改善收效甚微，我們還有很長的一段路要走。 剛開始遇到這個

16、實(shí)驗時，看到資料里講到的各種數(shù)量龐大的儀器、試劑，會擔(dān)心這個實(shí)驗會很難做。但做完才發(fā)現(xiàn)，數(shù)量龐大是有很強(qiáng)的理論做支撐的，多梯度、高重復(fù)本就是科學(xué)實(shí)驗的特點(diǎn)，只是在微生實(shí)驗中體現(xiàn)得更充分，也與今后的科學(xué)研究多梯度、高重復(fù)特點(diǎn)更接近。大量的儀器與藥品試劑及高重復(fù)的分步實(shí)驗也考驗著我們?nèi)绾卧趯?shí)驗前進(jìn)行合理規(guī)劃，如何在實(shí)驗過程中有條不紊、頭腦清醒，如何在實(shí)驗后進(jìn)行妥善處理。因此這個實(shí)驗對于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度和良好的實(shí)驗習(xí)慣的要求特別突出，也給了我們極大的鍛煉。 一直都對微生物學(xué)實(shí)驗信心不是很足，尤其是開放實(shí)驗這種需要連續(xù)好幾天高密度操作的實(shí)驗。但當(dāng)我進(jìn)行取樣、接種、劃線之類的無菌操作以及其他各種開放操作時，我發(fā)現(xiàn)經(jīng)過這一學(xué)期的鍛煉，其實(shí)我已經(jīng)能夠很熟練地進(jìn)行各種操作了。謝老師一直強(qiáng)調(diào)的熟能生巧我算是領(lǐng)會到了。而這學(xué)期多次以小組為單位的實(shí)驗操作也使我們小組在這次開放實(shí)驗中配合得很默契，這也是多次演練的結(jié)果。所以說，在將理論運(yùn)用于實(shí)際之