腫瘤多藥耐藥相關(guān)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究現(xiàn)狀

1、腫瘤多藥耐藥相關(guān)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究現(xiàn)狀         【關(guān)鍵詞】  腫瘤 腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)多藥耐藥性往往是導(dǎo)致臨床化療失敗及生存預(yù)后差的主要原因之一。多藥耐藥是腫瘤細(xì)胞耐藥的主要形式，腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指一種藥物作用于腫瘤細(xì)胞使之產(chǎn)生耐藥性后，該腫瘤細(xì)胞逐漸對(duì)未接觸過的、結(jié)構(gòu)無關(guān)、作用靶點(diǎn)和機(jī)制不同的多種抗腫瘤藥物也具有交叉耐藥性。目前研究認(rèn)為，腫瘤產(chǎn)生MDR的分子機(jī)制主要有以下幾方面:（1）跨膜藥泵基因的擴(kuò)增或過度表達(dá)，跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高

2、表達(dá)，從而促進(jìn)藥物外排及藥物的亞細(xì)胞分布改變以降低藥物濃度。（2）代謝轉(zhuǎn)化改變，如細(xì)胞內(nèi)一些蛋白酶的改變引起細(xì)胞解毒功能增強(qiáng)。（3）藥物作用靶點(diǎn)改變，如核酶DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase，TOPO）含量減少或性質(zhì)改變，導(dǎo)致對(duì)TOPO為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物耐藥。（4）其他機(jī)制還包括凋亡相關(guān)通路改變、細(xì)胞增殖速率改變、損傷修復(fù)增強(qiáng)及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)因素改變等。這些機(jī)制常多種同時(shí)存在，但多以一種為主，同時(shí)不同機(jī)制常相互影響。近年來對(duì)MDR產(chǎn)生機(jī)制中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究不斷深入，先后發(fā)現(xiàn)了P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥蛋白（multidrug resis

3、tance pro-tein，MRP）、肺耐藥相關(guān)蛋白（the lung resistance-related protein，LRP）、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）它們均具有藥物排出泵功能。    下面就對(duì)與MDR相關(guān)的這四種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的生物學(xué)特性、結(jié)構(gòu)特性、生理功能、耐藥性質(zhì)及耐藥機(jī)制目前的研究現(xiàn)狀作一綜述。    1 P-糖蛋白（P-gp）    1.1 P-gp的生物學(xué)特性

4、  1976年Juliano等 1 首先觀察到具有MDR表型的中國倉鼠卵巢（CHO）細(xì)胞中有一種與耐藥程度呈正相關(guān)的高分子糖蛋白，命名為P-糖蛋白。P-gp由mdr1基因編碼，人類的mdr1基因位于7，q21.1，P-gp的cDNA長度為4.3kb，編碼的蛋白質(zhì)由1280個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為170kD，故又名為P-gp170或P170。    1.2 P-gp的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生理功能  P-gp是一種ATP依耐性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員之一，具有ABC全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)，即共含12個(gè)跨膜區(qū)，

5、可分為左右?guī)缀跸嗟鹊膬刹糠?，其分子每部分都?個(gè)疏水區(qū)及1個(gè)親水區(qū)，疏水區(qū)由6個(gè)跨膜區(qū)（membrane spanning domains，MSDs）構(gòu)成，它提供結(jié)合底物的特異性，而位于胞漿內(nèi)的親水區(qū)含1個(gè)親水性核酸結(jié)合區(qū)（nucleotide-bind domain，NBD），該結(jié)構(gòu)上有1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)。NBDs含有特征性基團(tuán)WalkerA和B，間隔90120個(gè)氨基酸，存在于所有ATP結(jié)合蛋白中，起傳遞能量以轉(zhuǎn)運(yùn)底物穿出細(xì)胞膜的作用 2 。P-gp定位于胞質(zhì)膜，在人體正常組織中廣泛表達(dá)，一些研究表明在成人，高水平的P-gp的mRNA表達(dá)于腎

6、上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)，也高表達(dá)于腎臟及胎盤，而在肺、肝臟、小腸和結(jié)腸中呈中等表達(dá)，在其它組織中它低水平表達(dá) 3，4 。定位研究表明mdr1正常表達(dá)于肝臟、膽小管、胰腺小管、腎臟近端小管。在生理狀態(tài)下，P-gp與防止毒素入侵及細(xì)胞分泌類固醇 激素有關(guān)，其底物可能是有細(xì)胞毒性的代謝物和化合物。位于血腦屏障毛細(xì)血管腔表面的P-gp可防止細(xì)胞毒素穿透內(nèi)皮，在體外給藥時(shí)，P-gp可減少腦中的藥物濃度及藥物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng) 5 。有研究發(fā)現(xiàn)，P-gp的抑制劑如奎尼丁、環(huán)孢霉素等可增強(qiáng)P-gp底物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)效應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)中奎尼丁顯著降低了血清中的丁哌卡因的濃度

7、，而未影響腦中的濃度，由此可表明P-gp可抑制丁哌卡因通過血腦屏障。位于睪丸和胎盤部位的P-gp也起到抵抗細(xì)胞毒素侵害的功能。有研究表明P-gp能調(diào)節(jié)口服藥物的生物利用度。    1.3 P-gp的耐藥機(jī)制  P-gp能夠通過脂質(zhì)雙分子層有效的消除細(xì)胞毒性藥物和許多常用藥物，P-gp的跨膜區(qū)域結(jié)合帶有中性正電荷的疏水性藥物底物，可能直接從脂質(zhì)雙分子層遞呈給轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。P-gp的表達(dá)與蒽類化合物、長春堿類、紫杉醇類和鬼臼毒素類的耐藥相關(guān)。P-gp作為一種ATP依耐性跨膜蛋白，可能量依耐性地將藥物泵出細(xì)胞外，并減少藥物轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞內(nèi)地藥物蓄積

8、減少;還可使細(xì)胞內(nèi)藥物再分布，致藥物集聚于藥物作用無關(guān)的細(xì)胞器如溶酶體內(nèi)，進(jìn)一步減少作用靶點(diǎn)部位的藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥。研究認(rèn)為P-gp在轉(zhuǎn)運(yùn)一個(gè)藥物分子時(shí)發(fā)生兩次ATP水解事件，第一次是在跨膜區(qū)域結(jié)合底物后激活P-gp的ATP酶活性時(shí)發(fā)生，引起蛋白質(zhì)構(gòu)象變化，以釋放底物到膜外側(cè)部分或者是細(xì)胞外空間，ATP位點(diǎn)的第二次水解則是重置轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以利于再次轉(zhuǎn)運(yùn) 6，7 。另外P-gp還可延遲凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高腫瘤細(xì)胞存活率 8 ，并能保護(hù)耐藥細(xì)胞免于細(xì)胞毒性藥物及Fas配體誘導(dǎo)的多種形式的caspase依賴性凋亡 9 。  &#

9、160; 2 多藥耐藥蛋白MRP    2.1 MRP的生物特性  1992年Cole等 10 在耐阿霉素小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H69AR中發(fā)現(xiàn)了一種與多藥耐藥性表型獲得與缺失相關(guān)的蛋白，后證明它也屬于ABC超家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，命名為多藥耐藥蛋白MRP。因它是人多藥耐藥蛋白家族MRPs成員之一，也就是該家族中的MRP1。原位雜交顯示人MRP的基因位于16P13.1，其mRNA為7.88.2kb，編碼一個(gè)由1522個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其分子量為190kDa。    2.2 MRP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及

10、生理功能  MRP與P-gp一樣屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但它在結(jié)構(gòu)上具有以下獨(dú)特的特點(diǎn) 2 :1、MRP具有3個(gè)MSDs，其構(gòu)像為MSD1-MSD2-NBD1-MSD3-NDS2。2、在P-gp及其他一些真核生物ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中位于NH2端NBD即NBD1的walkerA和walkerB之間的13個(gè)氨基酸，在MRP卻位于COOH端的NBD（NBD2）中。3、MRP其分子量較其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白大，在其NH2端較其他蛋白多了一約250個(gè)氨基酸殘基組成的序列。MRP在體內(nèi)廣泛分布于多種上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞中，與此推測MRP具有保護(hù)機(jī)體抵御外來活性物質(zhì)（異

11、生質(zhì)）的排出泵的作用 11 。此外在許多具有內(nèi)分泌功能的細(xì)胞如腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、胰島細(xì)胞、胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞、睪丸及卵巢中分泌睪丸素的細(xì)胞，都有MRP的高表達(dá)，提示MRP可能參與激素的轉(zhuǎn)運(yùn) 11 。還有研究 12 發(fā)現(xiàn)塞爾托利氏（sertoli）細(xì)胞基膜內(nèi)高表達(dá)的MRP，可通過睪丸小管將有害物質(zhì)排出從而保護(hù)生殖細(xì)胞。還發(fā)現(xiàn) 5 脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞中的MRP可起防止藥物進(jìn)入的作用。    2.3 MRP的耐藥機(jī)制  MRP在小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、甲狀腺腫

12、瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、纖維肉瘤及各型白血病的腫瘤細(xì)胞中都有過度表達(dá) 2 。MRP介導(dǎo)的MDR分子機(jī)制與P-gp基本一致，也是通過降低胞內(nèi)化療藥物的濃度，且在一些特定細(xì)胞株中也發(fā)現(xiàn)MRP可改變藥物在細(xì)胞內(nèi)的分布，使藥物集中分布于胞質(zhì)囊或核周高爾基樣區(qū)域中，有效降低藥物的核質(zhì)分布比例。但區(qū)別于P-gp，MRP并不能獨(dú)立完成未經(jīng)修飾地化療藥物的天然產(chǎn)物，但卻能轉(zhuǎn)運(yùn)生物轉(zhuǎn)化后與谷胱苷肽GSH結(jié)合的產(chǎn)物，隨著GSH的耗盡，MRP介導(dǎo)的對(duì)長春堿類和蒽環(huán)類藥物耐藥將消失。由此可肯定MRP與GSH共同介導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生，目前認(rèn)為藥物首先通過谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶和GSH結(jié)合，然后由MRP轉(zhuǎn)

13、運(yùn)出細(xì)胞，故稱MRP為一種藥物排出泵不準(zhǔn)確，確切講MRP是一種GSH-X泵 14 。    3 乳腺癌耐藥蛋白BCRP    3.1 BCRP的生物學(xué)特征  1990年Chen等用阿霉素（adri-amycin，Adr）加維拉帕米（verapamil，Vp）從人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7誘導(dǎo)得到一株MDR細(xì)胞MCF-7/AdrVp該細(xì)胞株對(duì)抗腫瘤藥物均能產(chǎn)生交叉耐藥，后證實(shí)MCF-7/AdrVp細(xì)胞株無P-gp、MRP、LRP的過度表達(dá)。到1998年Dovle等 14 用RNA指

14、紋分布技術(shù)研究比較乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/AdrVp和親代細(xì)胞MCF-7的mRNA表達(dá)差異，結(jié)果在乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/AdrVp中發(fā)現(xiàn)了一2.4kbmRNA的過度表達(dá)能翻譯一由655個(gè)氨基酸殘基組成的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。因該蛋白首先在乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，故命名為乳腺癌耐藥蛋白。后Allikmets等 15 和Miyake等有分別從人胎盤組織和耐米托蒽醌的人結(jié)腸癌細(xì)胞S1-M1-80中克隆得到BCRP基因，因而BCRP又稱為胎盤特異性ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)分子（placenta-specific ATP-binding cassette transpo

15、rter，ABCP）和耐米托蒽醌轉(zhuǎn)運(yùn)分子（mitoxantrone resis-tance transporter，MXR）。人的BCRP基因位于4q22，BCRP的cDNA長度為2.4kb，其編碼的蛋白質(zhì)由655個(gè)氨基酸組成。BCRP的分子量約為72.6kD。             3.2 BCRP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生理功能  BCRP與P-gp和MRP一樣同屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，也存在ATP結(jié)合盒，并具有ATP依耐性藥物外排功能。但

16、在結(jié)構(gòu)上BCRP僅相當(dāng)與P-gp分子的一半，它僅有6個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)ATP結(jié)合位點(diǎn)，故被稱為不完全轉(zhuǎn)運(yùn)分子（half transporter）?；诖罅縨dr1基因和MRP基因的突變研究表明，P-gp和MRP均許2個(gè)ATP結(jié)合區(qū)和廣泛的跨膜區(qū)才能發(fā)揮作用。過去有研究推測BCRP可能是與細(xì)胞膜上一種未知組分共同組成異二聚體發(fā)揮作用 14 ，但至今未發(fā)現(xiàn)此種細(xì)胞膜組分。而另一種假設(shè)則認(rèn)為BCRP是通過其單體形成同二聚體或多聚體發(fā)揮功能。這一假設(shè)已為Kage等 16 人所證實(shí)，他們的研究發(fā)現(xiàn)BCRP單體以二硫鍵連接形成同二聚體，而此同二聚體是BCRP發(fā)

17、揮功能所必需的。與P-gp相似，BCRP在正常組織中也分布廣泛，且主要分布于具有分泌和排泄功能的組織如胎盤合體滋養(yǎng)層、小腸和結(jié)腸上皮、肝細(xì) 胞膜膽小管面中 17 。在小腸和結(jié)腸上皮中的分布提示BCRP可能通過返運(yùn)從腸腔進(jìn)入的外源性物質(zhì)如藥物等來調(diào)節(jié)吸收，防止可能發(fā)生的毒性反應(yīng) 17 。另外有研究發(fā)現(xiàn)BCRP在胎盤組織中表達(dá)豐富，提示BCRP在胎盤屏障的形成過程中可能發(fā)揮重要作用。BCRP也可能參與肝臟解毒及血腦屏障的形成。 3.3 BCRP的耐藥機(jī)制  BCRP并非乳腺癌所特有，以Mx誘導(dǎo)的人骨髓瘤細(xì)胞株

18、RPM18226、人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株GLC4、人結(jié)腸癌細(xì)胞株S1-M1-3.2都發(fā)現(xiàn)了有BCRP的過表達(dá) 18 。其耐藥譜包括了米托蒽醌、阿霉素、柔紅霉素、鬼臼乙叉苷、拓?fù)涮乜系?，且?duì)長春新堿、紫杉醇無交叉耐藥。其耐藥分子機(jī)制與P-gp及MRP基本相似，即通過主動(dòng)外排藥物及降低藥物核質(zhì)分布比例達(dá)到MDR。但BCRP也具有自身的特點(diǎn) 16 :首先BCRP單體之間通過二硫鍵形成同二聚體，使結(jié)構(gòu)近似于一完全轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，而后在發(fā)揮藥物排出泵作用。此外BCRP也具有與前兩種耐藥蛋白不同的藥物結(jié)合位點(diǎn)。Honjo等 19 研究表明，BCRP的482

19、位氨基酸殘基的點(diǎn)突變能改變BCRP的底物特異性，由此推測BCRP上第3跨膜區(qū)內(nèi)的482的氨基酸可能使BCRP藥物結(jié)合位點(diǎn)的一部分。  4 肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP）    4.1 LRP的生物學(xué)特性  1993年Scheper等 20 用多柔比星（阿霉素）從人NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）細(xì)胞株SW-1573選擇到一株MDR細(xì)胞SW-1573/2R120，該細(xì)胞株對(duì)足葉乙苷、長春新堿、短桿菌肽D等多種化療藥物產(chǎn)生耐藥。發(fā)現(xiàn)在無P-gp過量表達(dá)的情況下，仍出現(xiàn)能量依耐性藥物蓄積能力的下降并發(fā)現(xiàn)一種新蛋白的表達(dá)，因

20、最早發(fā)現(xiàn)于肺癌耐藥細(xì)胞株中，故命名為肺耐藥相關(guān)蛋白LRP。LRP基因定位于16q11.2，其cDNA為2688bp組成的開放讀碼框架，編碼一個(gè)由896個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子量約為110kD。    4.2 LRP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及生理功能  與前三種耐藥蛋白不同，LRP不屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族，1995年Scheper等發(fā)現(xiàn)LRP基因編碼的氨基酸序列與“穹隆主體蛋白（major vault protein，MVP）”基本相同，由此推測LRP可能就是人的MVP。MVP是重要細(xì)胞器的主要組成部分，穹隆的功能可能與胞核與胞漿的轉(zhuǎn)

21、運(yùn)有關(guān)。穹隆蛋白由240kD，193kD，104kD三個(gè)蛋白及一種獨(dú)特的穹隆RNA（VRNA）所組成，該蛋白如桶狀，有兩個(gè)中心和分葉狀的壁，中間是空的，有兩個(gè)伸出的帽狀結(jié)構(gòu)和中部內(nèi)陷的腰部，LRP是一種主要的穹隆蛋白，可能通過雙向核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生MDR。LRP可以分布于多種正常組織中，如血管上皮、消化道上皮、支氣管上皮、腎小管上皮等細(xì)胞以及吞噬細(xì)胞。這些組織均具有分泌和排泄的功能，因此推斷正常組織中的LRP可能發(fā)揮清除外界活性物質(zhì)和毒物的作用 21 。    4.3 LRP的耐藥機(jī)制  LRP可以在幾乎所有類型的腫瘤細(xì)胞中過量表

22、達(dá)，它作為人的穹隆主體蛋白通過參與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而在腫瘤化療過程中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的MDR，其機(jī)制可能是:（1）阻止以細(xì)胞核為靶點(diǎn)的藥物進(jìn)入細(xì)胞核，起到中間關(guān)卡的作用，組織藥物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)或者將已進(jìn)入核內(nèi)的藥物通過轉(zhuǎn)運(yùn)載體重新運(yùn)出細(xì)胞核。（2）將細(xì)胞漿中的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至運(yùn)輸囊泡，從而使藥物呈房室性分布，并通過胞吐機(jī)制將藥物排出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，最終產(chǎn)生耐藥。有研究證明LRP不僅對(duì)蒽環(huán)類、生物堿、表鬼臼毒素類產(chǎn)生耐藥，也對(duì)以腫瘤細(xì)胞的DNA為作用靶點(diǎn)的非P-gp和MRP介導(dǎo)耐藥的順鉑、卡鉑、烷化劑等藥物產(chǎn)生耐藥，所以一般認(rèn)為LRP主要通過核屏蔽機(jī)制引起MDR。  5 展望 &

23、#160;   MDR已成為腫瘤化療過程嚴(yán)重的障礙，而由與MDR相關(guān)的這四種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白所介導(dǎo)的多藥耐藥又是其中一個(gè)重要的機(jī)制。因此深入了解這四種耐藥蛋白，對(duì)尋求克服它們介導(dǎo)的MDR的產(chǎn)生，提高腫瘤患者化療敏感性及改善病人生活質(zhì)量是十分有意義地。目前的研究已發(fā)現(xiàn)了一些有效的逆轉(zhuǎn)劑，如維拉帕米、環(huán)孢素A、三苯氧胺、類固醇激素可逆轉(zhuǎn)由P-gp介導(dǎo)的MDR，霉菌毒素C（FTC）則可逆轉(zhuǎn)由BCRP介導(dǎo)的對(duì)阿霉素、米托蒽醌和拓?fù)涮乜系腗DR。但這些逆轉(zhuǎn)劑因其較多的副作用，還不能投入臨床使用。目前我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究這些耐藥蛋白的確切耐藥機(jī)制，而且因?yàn)槊糠N腫瘤往往表達(dá)多種耐藥蛋白，故探究

24、這幾種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間的相互關(guān)系也是十分必要的。同時(shí)在研究由跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白引起的MDR時(shí)也應(yīng)與其他機(jī)制聯(lián)系起來。    參考文獻(xiàn)    1 Juliano R L，Ling V.A surface glycoprotein drug permeability in Chi-nese hamster ovary cell mutants.BBA:Biomembrans，1976;455（1）:152162 2 Hipfner D R，Deeley R G，Cole S P C，et al.Structural mechanistic and clinical aspects of MRP1.BBA:Biomembrans，199