病原物分離培養(yǎng)實驗報告

1、病原物分離培養(yǎng)和純化普通植物病理學題目病原物的分離培養(yǎng)和純化姓名學號所在學院農(nóng)學院年級專業(yè)植物保護201201指導教師完成時間年月日6病原物分離培養(yǎng)和純化病原物的分離培養(yǎng)和純化植物保護指導教師【摘要】本實驗主要通過用對十大功勞炭疽病病菌的分離和在PDA培養(yǎng)基中對炭疽病菌消毒后做無菌培養(yǎng)然后轉(zhuǎn)移到斜面培養(yǎng)的實驗過程觀察炭疽病菌的生長情況，了解分離與純化病原物的基本原理與方法，掌握實驗室常用的消毒滅菌方法，并掌握培養(yǎng)基的制作和無菌操作技術?！娟P鍵字 】分離培養(yǎng)；純化；PDA培養(yǎng)基；滅菌；斜面試管培養(yǎng)基柯赫氏法則 (KochsRule) 是確定侵染性病害病原物的操作程序。如發(fā)現(xiàn)一種不熟悉的或新的病害

2、時， 就應按柯赫氏法則的四個步驟來完成診斷與鑒定。診斷是從癥狀等表型特征來判斷其病因，確定病害種類。 鑒定則是將病原物的種類和病害種類同已知種類比較異同，確定其科學名稱或分類上的地位。有些病害特征明顯， 可直接診斷或鑒定， 如霜霉病或稈銹病。 但在許多場合難以鑒定病原物的屬、種。如花葉癥狀易于識別，要判斷由何種病原物引起，就必須經(jīng)詳細鑒定。比較后才能確定。 柯赫氏法則表述為：“ (1) 在病植物上常伴隨有一種病原微生物存在；(2) 該微生物可在離體的或人工培養(yǎng)基上分離純化而得到純培養(yǎng)；(3) 將純培養(yǎng)接種到相同品種的健株上，出現(xiàn)癥狀相同的病害；(4) 從接種發(fā)病的植物上再分離到其純培養(yǎng)，性狀與

3、接種物相同”【1】如果進行了上述四步鑒定工作得到確實的證據(jù)，就可以確認該微生物即為其病原物。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 供試材料十大功勞炭疽病病害部位、PDA培養(yǎng)基（自制）1.1.2 試驗試劑及儀器超凈工作臺、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、接種鏟、接種針、70%酒精、 0.1升汞、電爐等1.2 方法（ 大田苗圃鑒定 ）1.2.1 培養(yǎng)基的配制“培養(yǎng)基按成分及對成分了解程度分為天然培養(yǎng)基、半組合培養(yǎng)基、組合培養(yǎng)基三類，從物理性分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基兩種，培養(yǎng)基不同，配制方法不同。”【1】本實驗采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，簡稱PDA培養(yǎng)基。（ PDA培養(yǎng)基是植物實驗室最常用的培養(yǎng)基，主要用于

4、植物病原真菌的分離培養(yǎng)。） PDA培養(yǎng)基的配制方法：首先準備優(yōu)質(zhì)去皮馬鈴薯200 克、葡萄糖 10-20 克、瓊脂 20 克，加水至 1000ml。將馬鈴薯切成小塊，加水1000ml 煮沸約半小時，煮沸過程中要不斷攪拌， 然后用雙層紗布濾去薯塊， 補足水量， 加入小塊瓊脂， 加熱融化， 再加糖， 待完全溶化后， 趁熱分裝于三角瓶和試管中，注意每個三角瓶不宜裝太 多，以少于 1/2 為宜，試管中用于制備斜面培養(yǎng)基，也應較少，1/3 左右為宜， 然后將三角瓶和試管塞好棉塞以備滅菌。由于 PDA略帶酸性，適于真菌生長，因此不用調(diào)節(jié)pH 值。1.2.2 滅菌為了得到某種病原物的純培養(yǎng)， 用于培養(yǎng)病原物

5、的器物和培養(yǎng)基必須經(jīng)過滅菌才能使用。 滅菌前在三角瓶中加入少許孟加拉紅抑制細菌和放線菌的生長。本實驗采用高壓蒸汽滅菌法對做好的PDA培養(yǎng)基和試管內(nèi)斜面培養(yǎng)基滅菌。高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它是利用高壓提高蒸汽溫度， 達到滅菌的目的，其操作步驟如下：A、關好清水閥門，放入清水至標準度為止注意水量要加足，否則易造成事故。B、將要滅菌的培養(yǎng)基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關上氣蓋，旋緊螺旋時，先將每個螺旋旋轉(zhuǎn)到一定程度，不要太緊，再旋緊相對的兩個旋鈕，以達到平衡旋緊，否則易造成漏氣不能徹底滅菌。C、通電加溫，同時打開排氣閥門排盡鍋內(nèi)的空氣，當活門噴出的全是蒸汽的時候即可關閉

6、閥門， 一定要排盡空氣以達到徹底滅菌的目的，通常溫度表上升至 90時打開放氣降至零點再關閉。D、溫度表的指針上升時壓力也隨之升高，當壓力表升至 15 磅時蒸汽壓相當于一個大氣壓，此時計算滅菌時間，控制熱源，使處于15 磅壓力保持 30 分鐘， 就能達到完全滅菌目的，然后停止加溫。E、一般應待壓力表降至5 磅時稍微打開排氣活門，使鍋內(nèi)蒸汽緩慢排除，然后加大活門開口，勿使排氣過快。F、當壓力表降至0 時鍋內(nèi)蒸汽完全排盡時，打開鍋蓋取出培養(yǎng)基。然后將高壓鍋內(nèi)水排出。G、抽取上述培養(yǎng)基放入25恒溫箱中，48 小時不見雜菌證明培養(yǎng)基已達到目的。有些培養(yǎng)基經(jīng)高溫滅菌后容易失去營養(yǎng)成分，則可采用間歇性蒸汽滅

7、菌法， 即每天保持 100一個小時連續(xù)三天也可達到滅菌效果。1.2.3 病原真菌的分離培養(yǎng)為了獲得分離菌的純培養(yǎng)， 必須進行分離菌的純化， 本實驗采用組織分離法分離炭疽病菌。 分離培養(yǎng)一般在超凈工作臺上進行，無菌室和無菌箱要經(jīng)過噴霧除塵，并用紫外線照射消毒， 工作前將所需物品放在超凈工作臺內(nèi)，操作人員需用肥皂洗手，操作時還需用70%的酒精擦拭雙手，操作時呼吸要輕，不要說話。操作方法如下：A、取滅菌培養(yǎng)基一個置于濕紗布上，在皿蓋上表明分離日期、材料和分離 人姓名，并分別將 10s、15s、20s、25s 四個標示均勻標示到培養(yǎng)皿背面?zhèn)溆?。點燃酒精燈。B、將培養(yǎng)皿拿在手上在酒精燈上烘烤皿口一圈，用

8、無菌培養(yǎng)操作法向培養(yǎng) 皿中加入 25%乳酸 1-2 滴，然后將溶化冷至 60 攝氏度左右的 PDA 培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿倒15-20 毫升，輕輕搖動使成平面，凝固后即成平板培養(yǎng)基。C、取十大功勞炭疽病新鮮病葉，選擇典型的單個病斑，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣既病健接合部切取長寬3-4mm 的方形小塊病組織數(shù)塊。D、取 5 個滅菌培養(yǎng)皿，兩個分別加入75%酒精、0.1%升汞，其余三個加入適量無菌水。將切好的病組織放入75%酒精中浸泡 3-5 秒（消除表面張力） ，然后按無菌操作法將病組織移入0.1%升汞液中分別進行表面消毒10s、15s、20s、25s，然后放入滅菌水中連續(xù)漂洗三次，除去殘留消毒

9、劑。E、將漂洗后的病組織放到無菌吸水紙上吸取多余水分，減少細菌污染，然后在酒精燈火線前用無菌操作法分別將消毒時間為10s、15s、20s、25s 的病組織各 1 個分別放入培養(yǎng)皿對應標識的位置，然后迅速將培養(yǎng)皿蓋上。F、將培養(yǎng)皿放到25左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。前兩天主要觀察是否被細菌污染，后兩天主要觀察待分離菌生長情況。G、若病組織長出較為一致的菌落則多半為要分離的病原菌，為確定病原物 是否為需要分離培養(yǎng)的病原物，可挑取菌落鏡檢， 觀察其形態(tài)特征， 若與之前看到的一致即為所需病原物。 待病原菌生長到一定情況， 取出培養(yǎng)皿， 在超凈工作臺內(nèi)用接種環(huán)在菌落邊緣挑取小塊移入斜面培養(yǎng)基上（接種環(huán)使用前在酒精

10、燈火焰上烘烤數(shù)秒，防止雜菌滋生） ，在 25左右恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，數(shù)日后觀察待分離菌生長狀況，如無雜菌生長，即得到該病菌的純菌種，便可置于冰箱中保存。如需驗證此病害， 可將分離培養(yǎng)所得病原物通過無菌操作接種到健康的相同植株上，保濕培養(yǎng)數(shù)日，觀察其所致病害特征是否與原來一致，如一致，可再將其病原物分離培養(yǎng)觀察其性狀是否與第一次分離培養(yǎng)的病原物一致。2 結果與分析2.1 實驗結果分離培養(yǎng)所得病原物菌落在平板培養(yǎng)基中生長不佳， 均只出現(xiàn) 2 個菌落。菌落呈灰白色或近深灰色，有少數(shù)被細菌污染，呈乳膠狀，灰色。約 3 天后接種到斜面培養(yǎng)基中，生長數(shù)天后觀察生長良好，無雜菌污染，呈黑褐色。挑取菌落部分與顯微鏡

11、下觀察， 其分生孢子著生于分生孢子盤內(nèi)壁上， 分生孢子梗呈無色或褐色， 分生孢子為無色單胞， 長橢圓形或新月形， 有的分生孢子盤上還長有黑褐色剛毛。2.2 結果分析本實驗過程主要為柯赫氏法則的前兩步，通過實驗操作， 了解了分離培養(yǎng)的基本原理和方法， 基本掌握了消毒滅菌方法和培養(yǎng)基的制作、無菌操作技術， 了解了柯赫氏法則的程序和方法。3 結論與討論普通植物病理學 上對炭疽病屬菌物描述如下： “分生孢子盤在寄生角質(zhì)下、表皮或表皮下，黑褐色，人工培養(yǎng)時有時產(chǎn)生菌核，在菌核和分生孢子盤上有時生有黑褐色的剛毛， 分生孢子梗無色至褐色， 產(chǎn)生內(nèi)壁芽生式分生孢子， 分生孢子為無色， 單胞， 長橢圓形或新月形， 有的含有 1-2 個油球萌發(fā)之后芽管頂端產(chǎn)生附著胞， 引起多種瓜果和蔬菜炭疽病。 ”【2】普通植物病理學實驗指導上對此描述大致一致。本實驗分離培養(yǎng)得到的病原物特征與炭疽病病原物描述一致，因此可以得知所得病原物為半知菌類腔孢綱黑盤孢目 （Melanconiales）炭疽病屬（Colle