益氣養(yǎng)陰、消癥通絡(luò)中藥對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響

1、益氣養(yǎng)陰、消通絡(luò)中藥對(duì)大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的影響作者：張江華陳志強(qiáng)孫玉鳳1趙雯紅王月華王會(huì)青李玉梅【摘要】口的探討益氣養(yǎng)陰、消藏通絡(luò)中藥藥物血清對(duì)大鼠系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)不同成分的抑制作用。方法以體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞及血清藥理學(xué)方法為基礎(chǔ)，采用幅聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)ECM中纖維連接蛋口(FN)、層黏連蛋白(LN)、IV型膠原(ColIV)的含量。結(jié)果FN、ColIV的含量均增加，而益氣養(yǎng)陰、消通絡(luò)中藥對(duì)其具有明顯抑制作用。結(jié)論益氣養(yǎng)陰、消通絡(luò)藥物能夠減少ECM的積聚，可能是其防治腎小球硬化的機(jī)制之一?！娟P(guān)鍵詞】系膜細(xì)胞；益氣養(yǎng)陰、消藏通絡(luò)；層黏連蛋口；纖維連接蛋白；IV

2、型膠原；細(xì)胞外基質(zhì)AbstractObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectofherbofsupplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollateralsonthemesangialcells(MCs)secretingextracellularmatrix(ECM)?MethodsBasedonthemethodofculturingMCsinvitroandserumpharmacology,thecontentsoffibronectin(FN),laminin(LN)andc

3、ollagenIV(ColIV)inECMweredetectedbyELISA.ResultsThecontentsofFN,LN,CollinECMwereallincreased,whileinhibitedbyherbofsupplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollateralssignificantly.ConclusionsHerbofsupplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollateralscandecreasetheaccumu

4、lationofECM,whichmaybeoneofthemechanismsofpreventingglomerulosclerosisKeywordsMesangialcells;Supplementqiandnourishyineliminatingmassanddredgenelsandcollaterals;Laminin:Fibronectin;CollagenIV;Extracellularmatrix糖尿病腎?。―N）基本病理改變?yōu)樵缙谀I小球毛細(xì)血管球肥大，基底膜（GBM）增厚，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）進(jìn)行性積聚。ECM的產(chǎn)生增加和（或）降解減少被認(rèn)為是ECM積聚的主要原因。系膜

5、細(xì)胞產(chǎn)生ECM的能力最強(qiáng)。ECM的主要成分是層黏連蛋白（LN）膠原纖維（ColIV）.纖維連接蛋白（FN）及蛋白多糖,因此，LN和FN、ColIV可作為研究小早期病理變化的重要指征（1）。本研究主要針對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠系膜細(xì)胞ECM進(jìn)行檢測(cè)，探討消通絡(luò)中藥對(duì)小的保護(hù)作用，為DN臨床治療提供依據(jù)。1材料與方法地龍、水蛭、鱉甲、大黃、砂仁等組成，水煎、過(guò)濾、濃縮按成人劑量的15倍制成含生藥0?7g/ml）,111河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省中醫(yī)藥中藥房提供。厄貝沙坦片（安博維），150mg/片，用時(shí)按成人用量15倍用水溶解，配制成含藥濃度為1?88g/ml藥液，杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)

6、0809155c血管緊張素II（AngII）、胰蛋白幅、IV型膠原幅、Hepes（美國(guó)Sigma公司），RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（澳大利亞PAA公司），EDTA（美fflAmresco公司）。318MC型幅標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司）；低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），C02恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋電機(jī)株式會(huì)社）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；超凈工作臺(tái)（北京半導(dǎo)體設(shè)備廠）。1. 2方法1.1.1 實(shí)驗(yàn)血清的制備健康SD大鼠36只，SPF級(jí)，體重180?220g雌雄兼用，山河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：905042c將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，正常組、中

7、藥組及厄貝沙坦組。正常組給予相應(yīng)劑量的蒸憎水，其余各組按每次4皿灌置給藥，每日2次，連續(xù)3do最后1d2次給藥時(shí)間間隔為2h,于末次給藥后1?2h,用3%戊巴比妥（1.5ml/kg體重）腹腔麻醉大鼠，股動(dòng)脈取血，3000r/min離心10min分離血清，56C水浴中滅活30min,0.22Um微孔濾膜過(guò)濾，-20C冷藏備用。1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組分為正常組：RPMII1640培養(yǎng)液中含5%胎牛血清+5%正常大鼠血清；高糖組：培養(yǎng)液含有D葡萄糖濃度25mmol/L+5%胎牛血清+5%正常大鼠血清；高糖+AngI組：培養(yǎng)液含有D葡萄糖濃度25mmol/L+5%胎牛血清+5%正常大鼠血清+AnglI1

8、0-6mol/L;厄貝沙坦組：培養(yǎng)液含有D葡萄糖濃度25mmol/L+5%胎牛血清+Ang1110-6mol/L+5%厄貝沙坦血清；中藥組：培養(yǎng)液含有D葡萄糖濃度25mmol/L+5%胎牛血清+AngI10-6mol/L+5%中藥血清。1.1.3 系膜細(xì)胞的培養(yǎng)正常Wistar大鼠，體重75?100g,斷頸處死后，清潔取腎，分離皮質(zhì)、髓質(zhì)。皮質(zhì)被剪成碎屑，依次通過(guò)100,140,200L1篩網(wǎng)，收集腎小球，IV型膠原酶溶液消化，當(dāng)細(xì)胞分散成單個(gè)時(shí),用胎牛血清終止消化，加適量培養(yǎng)基吹勻接種于含20%的胎牛血清、10萬(wàn)U/L青霉素、100g/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，5%C02、37C培

9、養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。第5?7代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。1.1.4 系膜細(xì)胞鑒定形態(tài)學(xué)及功能鑒定。1.1.5 系膜細(xì)胞上清的收集取傳代培養(yǎng)的系膜細(xì)胞，吸去培養(yǎng)液，用DHanks液洗滌培養(yǎng)瓶2次，然后加0.25%胰蛋口幅/0.02%EDTA4ml,放入培養(yǎng)箱中，37C消化數(shù)分鐘，之后加入含20%FCS1640液5ml終止消化，4、1000r/min,離心5min,充去上清，加入培養(yǎng)液以1X104/孔接種于48孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24h,使細(xì)胞貼壁。更換無(wú)血清1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步于G0/G1期，吸充培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，按實(shí)驗(yàn)分組加入各自不同條件培養(yǎng)液

10、，繼續(xù)培養(yǎng)72h,終止培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清液，-80C低溫冰箱保存待測(cè)。1.1.6 培養(yǎng)的上清FN、LN、ColIV的含量檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè),嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以xb表示，用SPSS13.0B計(jì)軟件進(jìn)行多組數(shù)據(jù)間比較用方差分析。2結(jié)果2.1 系膜細(xì)胞的鑒定倒置顯微鏡下觀察其典型的形態(tài)學(xué)特征：培養(yǎng)18d后,貼壁的腎小球周圉長(zhǎng)出梭形或星形特點(diǎn)的細(xì)胞,隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞鋪滿瓶底，見(jiàn)圖1；功能鑒定：在細(xì)胞上滴加血管內(nèi)皮素后，細(xì)胞呈強(qiáng)烈的收縮反應(yīng)，山梭形、星形或不規(guī)則形變?yōu)閳A形;超微結(jié)構(gòu)觀察:透射電鏡下GMC也成星形或梭形，胞質(zhì)內(nèi)有少量分布的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合

11、體外，還有最為特征性的是位于胞膜下和細(xì)胞突起向內(nèi)的微絲結(jié)構(gòu)，核居中央，多呈圓形或卵圓形,核染色質(zhì)較為稀疏，見(jiàn)圖2。2.2 各組細(xì)胞上清液中LY、及ColIV的表達(dá)高糖組系膜細(xì)胞分泌FN、LN和ColIV量明顯增加，與正常組比較有非常顯著性差異(P0.01);與高糖組相比,高糖+AngII組系膜細(xì)胞分泌FN、LN和ColIV量顯著增加(P0.01);厄貝沙坦組與中藥組均能明顯降低FN、LN和ColIV的分泌量(P0.05,P0.01再高糖+Angl【組比較有非常顯著性差異(P0.05)。表1LN、FN及ColIV含量的比較與正常組比較:l)P0.05,2)P0.01;與高糖組比較:3)P0.05

12、,4)P0.01;與高糖+AngII組比較：5)P0.013討論腎小球系膜細(xì)胞過(guò)度增殖引起ECM合成的增加，是腎小球碩化發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，亦是造成腎臟功能進(jìn)行性損害的重要環(huán)節(jié)(2)。高糖活化系膜細(xì)胞內(nèi)的某些信號(hào)通路，如AngII以及炎癥細(xì)胞因子等的活化，導(dǎo)致FN、LN和ColIVmRNA轉(zhuǎn)錄增加、分泌增多以及腎小球系膜細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致間質(zhì)的纖維化腎小球的肥大，加速了小的發(fā)生與發(fā)展。Ang為系膜細(xì)胞外基質(zhì)合成的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，主要是導(dǎo)致系膜細(xì)胞增殖肥大，促使ECM合成、沉積，最終促進(jìn)嘰的發(fā)展，發(fā)生腎臟纖維化(3)。故本研究采用高糖環(huán)境下，Ang誘導(dǎo)系膜細(xì)胞增殖。目前認(rèn)為，DN為本虛標(biāo)實(shí)之證，以脾腎及氣血陰陽(yáng)之虛為本，氣滯、濕阻、血瘀、痰聚為標(biāo)，氣陰兩虛是糖尿病腎病發(fā)病基礎(chǔ)，消渴病曰久不愈，傷陰耗氣。益氣養(yǎng)陰、化瘀通絡(luò)中藥是陳志強(qiáng)教授針對(duì)臨床上病程中氣陰兩虛，血瘀濁聚基本病機(jī)而確立的復(fù)方中藥，其中黃茂益氣，走而不守，配伍茯苓、砂仁、熟地，氣陰兼顧、健脾益氣、補(bǔ)腎斂精、利水消腫;水蛭性緩則氣血不傷，善入則堅(jiān)積易破，配伍地龍、鱉中，活血祛瘀，散結(jié)軟堅(jiān);大黃同煎，可通腑泄熱，蕩滌積滯，使?jié)嵝皬南赂[而出；與積雪草同用，有清熱利濕、消腫解毒之