(完整word版)western+blotting實驗操作步驟

1、蛋白免疫印跡雜交（Western Blot, WB ）WB 是將蛋白樣本通過聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜上，然后通過一抗 /二抗復(fù)合物對靶蛋白進行特異性檢測的方法。WB 是進行微量蛋白質(zhì)分析比較成熟的技術(shù)之一。以下是總結(jié)Western Blot 操作方法及常見問題分析，有助于成功完成 WB 。A 第一部分：蛋白樣本提取制備蛋白樣品制備是 Western Blotting的第一步，更是決定 WB 成敗的關(guān)鍵步驟， 總體原則和注意事項：1. 盡可能提取完全或降低樣本復(fù)雜度只集中于提取目的蛋白 （通過采用不同提取方法或選擇不同的試劑盒產(chǎn)品）；2. 保持蛋白處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的

2、 pH 、鹽濃度、表面活性劑、還原劑等的選擇）；3. 提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等， （低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；4. 盡量去除核酸， 多糖，脂類等干擾分子 （通過加入核酸酶或采取不同提取策略）；5. 樣品分裝，長期于 -80中保存，避免反復(fù)凍融。方法的選擇自行配制抽提試劑，根據(jù)文獻方法或經(jīng)驗提?。毁徺I商品化試劑盒，按其說明書的方法提取。Example 1 ：實驗中提取腎臟總蛋白，具體實驗過程如下：1. 提前一天 4解凍 RIPA，一定要完全融化；配 PBS（用于細胞試驗則需高壓） ；2. 配制裂解液： PMSF:RIPA=1:99,PMSF 終濃度為 100mM

3、（根據(jù)樣本數(shù)配制所需的量，臨用臨配）；3. 裂解組織：每個樣品稱取 100mg，加 1ml 裂解液，勻漿后 4靜置 2h 使其充分裂解， 14000g，4離心 10min，取上清。4. 蛋白定量：取少量上清稀釋 30 倍蛋白定量，然后計算出各樣本原液蛋白濃度。注意由于裂解液里含有較高濃度的洗滌劑，蛋白定量不能選用 Bradford 法，可以選用改良的 Lowry s法或者 BCA 法。5. 樣品蛋白濃度均一化：根據(jù)蛋白定量計算的結(jié)果將各樣品蛋白濃度調(diào)整一致。具體方法為加入 PBS 稀釋至樣品濃度一致，本次蛋白濃度為 3mg/ml 。6. 分裝并存于 -80，避免反復(fù)凍融。B 第二部分：相關(guān)試劑

4、的配制：1. 10% 的 SDS（戴口罩稱?。悍Q取 SDS10g，先加雙蒸水 80ml ，再用磁力加熱攪拌助溶，然后定容至100ml。室溫保存，如在長期保存中出現(xiàn)沉淀，可在50水浴溶化后，仍可使用。2. 1.5M Tris/HCL （ pH8.8）Trisbase 18.17g，溶解于 80ml 雙蒸水，用濃鹽酸調(diào) pH 至 8.8，最后定容至 100ml，室溫下保存。3. 0.5M Tris/HCL （ pH6.8）Trisbase 6.06g，溶解于 80ml 雙蒸水，用濃鹽酸調(diào) pH 至 6.8，最后定容至 100ml，室溫下保存。4. 30% 丙烯酰胺 /0.8% N,N-亞甲丙烯酰

5、胺丙烯酰胺（ Acr） 75g甲叉雙丙烯酰胺2g加雙蒸水 150ml，37加熱溶解后，定容至250ml，查證該溶液pH 應(yīng)不大于7.0，4棕色瓶保存。使用時恢復(fù)至室溫且無沉淀。Be careful!：丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和口罩。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。5. 上樣緩沖液0.5mM Trisbase(pH6.8)2.5ml甘油2.0ml10SDS4.0ml0.4%溴酚藍（ mw669.97）1ml二巰基乙醇（ mw78.14）0.5ml注：配好后分裝 -20保存。6.

6、 電泳緩沖液10 倍儲存液1 倍應(yīng)用液Trisbase30g3g甘氨酸144g14.4gSDS10g1g加水至 1000ml，PH 值用 HCl 調(diào) 8.3。已經(jīng)配制了 1000ml 的儲存液。電泳緩沖液用應(yīng)老師的電泳槽應(yīng)用液300ml。用 10 倍的儲存液 30ml 加入水 270ml。7.轉(zhuǎn)移緩沖液（臨用臨配，鐵盒子里攪拌混勻并4預(yù)冷）：Tris base甘氨酸H2O（ml ）甲醇（ ml ）終體積（ ml）0.606g2.88g160402002.424g11.52g6401608002 板膠轉(zhuǎn)移緩沖液的用量約為200ml。8. 洗滌緩沖液（ TBS）10 倍儲存液1 倍應(yīng)用液Tris

7、base24.2g2.42gNaCl80g8g加水 800ml，用 HCL 調(diào)整 PH 為 7.6，再加水至 1000ml，已經(jīng)配制了1000ml的 TBS 液，臨用時再加 0.1%的 Tween-20。一般做兩板膠要用洗滌緩沖液 500ml；用儲存液 50ml 加入 450ml 水，后加 0.5ml Tween-20。9. 封閉緩沖液（ 5% 脫脂奶粉） 10ml/膜脫脂奶粉2g洗滌緩沖液40ml兩板膠 4 張膜要用封閉緩沖液40ml。具體實驗步驟：準(zhǔn)備：準(zhǔn)備器材： 10%過硫酸銨；冰盒；預(yù)熱恒溫加熱器；拿出試劑（雙丙和TEMED提前從冰箱拿出平衡，否則凝膠過程產(chǎn)生的熱量會使低溫時溶解于儲存

8、液中的氣體析出而導(dǎo)致氣泡）；電泳儀器；洗干凈的板子和梳子； 濾紙條用于吸水； 剪刀；尺子；剪好的膜（根據(jù)目的蛋白分子量以及樣品個數(shù)決定）及比膜稍大些的干凈濾紙；脫脂奶粉；干凈的裝封閉液的容器約50ml 大?。惶崆扒逑床ＡО宀⒘栏桑鹤⒁獠灰们鍧嵡蛑惖拇植谖锲非逑床ＡО?，可用洗潔精泡約 2h，用自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗干凈，置于架子上晾干。做膠分離膠：1. 先稱取過硫酸胺，配兩板膠用10的過硫酸胺 150l，一般要稱取過硫酸胺0.2-0.3mg，溶解到相應(yīng)量的雙蒸水中，混勻。分離膠（括號里為2 板膠的用量）試劑7.5101215水(ml)4.9 (7.35)4.1(6.15)3.4(5.1)

9、2.4(3.6)(ml)1.5MTris/HCl2.5(3.75)2.5(3.75)2.5(3.75)2.5(3.75)(pH=8.8)丙 /雙丙烯酰胺2.5(3.75)3.3(4.95)4.0(6.0)5.0(7.5)10%SDS100,(150)100,(150)100,(150)100,(150)10%過硫銨50,7550,7550,7550,75( l)TEMED10,1510,1510,1510,15適用蛋白分子量100kDa60-100kDa20-60kDa20kDa玻板間夾上膠條，用夾子將兩塊玻板夾緊。按以上方法配膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用 10ml

10、槍吸取 5ml 膠沿玻璃放出，將膠加入到玻璃板的夾層中。加入的量略高于夾子的最高處（或者膠面升到綠帶中間線高度時即可）加好后加入 1ml 的水壓膠。做分離膠時，凝固時間大約為 2540 分鐘，要根據(jù)溫度來確定。一般可以依據(jù)剩下在離心管中的膠的凝固情況來確定膠的凝固。當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。注意：舊的 1.0mm 的板子短的玻璃在里面，新的在外面。過硫酸銨一般現(xiàn)配現(xiàn)用。注意各種試劑加入的順序， “三大三小”，后面加過硫酸銨，最后加TEMED 。配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠出現(xiàn)濃度不均的情況。要根據(jù)溫度

11、調(diào)整 TEMED 的使用量。夏天凝結(jié)的快，冬天凝結(jié)的慢。冬天如果凝結(jié)的慢，兩板膠可以加 TEMED 20-30 l。水封的時候水要慢慢加入，太快會導(dǎo)致膠面不平，封膠后切記勿動。膠通常在 0.5 1h 內(nèi)凝集最好，過快膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。下一步實驗準(zhǔn)備a 準(zhǔn)備樣品：1預(yù)熱微量恒溫器（ 98）；2準(zhǔn)備一套中 EP 管并標(biāo)記 ，以用于混勻樣品和上樣緩沖液；3取出樣品，marker，上樣緩沖液 置于冰上；4樣品：上樣緩沖液 =3:1 混勻，置于微量恒溫器上98 5min 變性；b 配制電泳緩沖液；c 配 4濃縮膠， TEMED 臨用時加。濃縮膠（括號里為2 板膠用量）水3.00ml(4.

12、5ml)0.5MTris/HCl(PH=6.8)1.25ml(1.875ml)丙/雙丙烯酰胺（30%/0.8%） 0.67ml (1.005ml)10%SDS50l(75l)過硫酸胺（ 10）50l(75l)TEMED5l(15l)膠凝固后，迅速向上將梳子拔下， 將玻璃板夾上電泳架， 完整的玻璃板在外圍。電泳槽中倒入電泳緩沖液（約300ml）。加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。 （電泳液至少要漫過內(nèi)側(cè)的小玻璃板） 。注意：濃縮膠的加入很重要，由于其硬度比分離膠小，而且還要加入梳子，掌握其凝固的時機很重要。太遲膠要粘住梳子，太早膠凝固不好。用Bio-Rad 的玻璃板用TEMED 15 l，在溫度為

13、22時凝固的時間為10 分鐘左右，溫度再高一些可以達到89 分鐘，低一些可以延長一些。膠的凝固很快，主要是加入TEMED 后的動作要迅速，以免在離心管中凝固了。加入的量要與玻璃板的最高線平行。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補膠（其實說經(jīng)常有點過了，補12 次就行了，不補膠問題也不大） 。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。插梳子要用力均勻，一次成型，且要注意梳子插入時哪面朝內(nèi)哪面朝外。加樣（加變性后的樣品）：用微量進樣器或加樣吸頭吸入樣

14、品 20l，加入到加樣孔中。用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出時不要吸進氣泡。 將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔， 若有氣泡也可能使樣品溢出。 ）加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌 3 次，以免交叉污染。在第一孔和最后一孔加 20l 上樣緩沖液以避免邊緣效應(yīng)， 第二孔加 3l marker，其他孔加 20l 樣品（樣品加樣 20-30 l都可以，但不超過 30l, 加樣量取決于蛋白濃度），保證每個上樣孔蛋白濃量為 30-50 g。電泳：100V，電泳 2 小時，電泳時要注意電泳槽上的電泳緩沖液的量，較少時，要從下槽中吸取一部分轉(zhuǎn)移到上槽。有時電

15、泳的時間用不到2 小時，要依據(jù)溴酚藍的位置確定是否要停止電泳。通常電泳時溴酚藍到達膠的底端處附近即可停止電泳。轉(zhuǎn)膜：蛋白因結(jié)合 SDS 而帶電荷，在電場下從膠中轉(zhuǎn)至膜上，轉(zhuǎn)膜操作根椐電轉(zhuǎn)儀制造商的說明書進行轉(zhuǎn)膜方式分為半干和濕轉(zhuǎn)兩種，半干式轉(zhuǎn)膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于 100 kDa 的蛋白。要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，膠很易裂，要用巧勁）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作） ，要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟

16、去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠，（膜蓋下后不可再移動）并去除氣泡。準(zhǔn)備：1. 電泳期間，剪好濾紙和膜，寬度由 marker 及目的蛋白分子量確定，長由加樣孔數(shù)決定；2. 配置轉(zhuǎn)膜緩沖液并預(yù)冷；3. PVDF 膜用甲醇活化（目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團， 使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的）。半干法轉(zhuǎn)膜：電泳完畢后，用卡片從一角的縫隙撬下一塊玻璃板，注意用力適度，用刀將沒用的膠切除：濃縮膠，加樣孔以外的膠，和溴酚藍下方的膠。先將 PVDF 膜和海綿泡在轉(zhuǎn)移緩沖液中，將 PVDF 膜做好標(biāo)記：剪刀剪下其一邊的兩角，一大，一小。將上述東西置于半

17、干轉(zhuǎn)膜儀器上，“三明治”從下往上的順序依次是：（）濾紙 -膠 -膜-濾紙（）。用電轉(zhuǎn)緩沖液稍微潤濕，轉(zhuǎn)膜 100mA 1.5h。注意防止轉(zhuǎn)膜時電源插反。濕法轉(zhuǎn)膜：“三明治”從下往上的順序依次為： ( )海綿 -濾紙 -膠 -膜-濾紙 -海綿 ()，三明治安放的方向確認正確， 負極方為帶負電的膠里的蛋白， 向正極方（膜）的電遷移。100mA 轉(zhuǎn)膜一個半小時即可。夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。蛋白帶負電，膜要靠近正極注意：1. 避免用手直接接觸膜，應(yīng)使用鑷子，手指上的油脂與蛋白會封閉轉(zhuǎn)膜效率并易產(chǎn)生背景污斑；2. 用卡片把玻板撬開時注意用力要輕以

18、免損壞玻板；3. 把膠從玻板上剝離時要保持膠的完整性，以及膠和膜之間不能有氣泡。若有氣泡則可用小玻棒輕輕滾下趕走氣泡；4. 濾紙膠膜之間的大小，一般是濾紙膜膠。5. 轉(zhuǎn)膜前要在轉(zhuǎn)膜緩沖液里平衡一下防止膠變形，也有助于進一步去掉可能有礙于轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。還有人在這一步浸泡幫助蛋白復(fù)性，可以直接在膠上檢測蛋白活性。封閉：轉(zhuǎn)膜完成后，將膜從轉(zhuǎn)膜夾中取下，將膜用TBS 從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。注意要將 貼膠的一面朝上（正面）的放在封閉盒子中，加入封閉液。4過夜。注意：如果選用 AP 作為顯色方法，封閉時就要選擇Tris 緩沖系統(tǒng)，不要用 PBS，因為 PBS

19、滋擾 AP。洗脫 （10mim/次，洗脫 3 次） ：第二天，將封閉液倒掉，加入洗脫緩沖液，室溫下?lián)u10 分鐘，倒掉；再加入洗脫緩沖液，室溫下?lián)u10 分鐘，倒掉；加入洗脫緩沖液，搖10 分鐘，倒掉。一抗孵育：準(zhǔn)備：拿出配制抗體的新管子并標(biāo)記（抗體名稱，稀釋比例，配制日期及所有人）；抗體的稀釋：用洗脫緩沖液稀釋eg.1:200，則 10l 加 2ml 洗脫緩沖液；一抗原液用之前要12000rpm 離心 20s 或者用手輕彈使蛋白混勻。步驟：加入一抗每小盒 2ml（皿用 5ml），室溫下?lián)u動孵育2 小時。2h 后回收一抗 。洗脫：步驟同前（ 10mim/次，洗脫 3 次）。二抗孵育：準(zhǔn)備：拿出配制

20、抗體的新管子并標(biāo)記（抗體名稱，稀釋比例，配制日期及所有人） ；二抗的稀釋直接依照稀釋倍數(shù)用洗脫液稀釋；二抗原液用之前要12000rpm 離心 20s 或者用手輕彈使蛋白混勻。步驟：加入二抗每小盒 2ml（皿用 5ml），室溫下?lián)u動孵育2 小時。1h 后回收二抗 。洗脫：步驟同前（ 10mim/次，洗脫 3 次），注意洗第三遍后，不要立即將洗脫緩沖液倒掉。顯影：辣根過氧化物酶HRP-ECL 發(fā)光法：1) 配置顯影液： 2 張膜配 A 和 B 液各 700l 并混勻。2) 準(zhǔn)備 U 盤或者刻錄盤， 1000 槍，槍頭，籃子，方蓋子，鑷子，濾紙， 1.5EP 管，顯影液。3) 將膜從盒中夾出， 濾紙

21、貼角吸干， 正面朝上平整的放在方蓋子里， 將顯影劑用槍打到膜上，盡量不要讓膜在盒子里挪動，均勻的在膜上澆顯影液 35min，倒掉顯影液，并用濾紙拭干周圍。4) 把膜放入機器（正面朝上） ，打開電腦， snap軟件，此時再推進機器，按鈕變成藍色，界面中間部分有 2 個圖標(biāo)，左邊為單個拍照，時間在其下調(diào)試；另一個為連續(xù)拍照， 點擊圖標(biāo)后輸入曝光時間 （推薦 30s，可跟據(jù)試劑情況延長到幾分鐘），3 次即可，顯影后，另存為 As，再保存張 export as TIFF 格式。AP-NBT/BICP 顯色法：原理：本試劑盒采用 BCIP 和 NBT 為底物，可由標(biāo)記于二抗上的 AP 催化，產(chǎn)生化學(xué)顯色

22、反應(yīng) ，在蛋白轉(zhuǎn)印膜陽性蛋白條帶處形成藍紫色沉淀， 適用于使用 AP 標(biāo)記抗體的 Western blot。與化學(xué)發(fā)光類試劑相比，本產(chǎn)品使用方便，可快速獲得結(jié)果；但檢測靈敏度不及化學(xué)發(fā)光類試劑。使用方法：用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，去除膜上多余的漂洗液；正面朝上平整的放在干凈的方蓋子上，將顯影劑用槍均勻澆到膜上，盡量不要讓膜在盒子里挪動，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，室溫孵育515min，顯色20s后每10s 觀察一次，至條帶明顯或有本底出現(xiàn)時用蒸餾水洗滌12 次即可終止顯色反應(yīng)，放濾紙上晾干即可觀察與掃描。WB 過程中常見的問題及可能原因分析問題轉(zhuǎn)膜不充分背景高可能原因驗

23、證或解決辦法膜沒有完全均勻濕透使用 100% methanol 浸透膜靶蛋白分子量小于 10,000選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時間可嘗試使用其他緩沖液如靶蛋白等電點等于或接近CAPS緩沖液（ pH 10.5) 或使轉(zhuǎn)移緩沖液 pH值用低 pH 值緩沖液如乙酸緩沖液過高甲醇濃度會導(dǎo)致蛋白質(zhì)與 SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時會使凝膠收縮甲醇濃度過高或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替轉(zhuǎn)移時間不夠 Thick gel對于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時間膜沒有完全均勻濕透使用 100% methanol 浸透膜洗膜不充分增加洗液體積和洗滌次數(shù)增加封閉液孵育時間，或者阻斷不充分提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉， BSA，酪蛋白等）二抗?jié)舛冗^高降低二抗?jié)舛葯z測過程中膜干燥保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象曝光過度縮短曝光時間檢測抗體與阻斷蛋白的交抗體與阻斷蛋白有交叉反叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)應(yīng)的封閉劑 。洗滌液中加入