亞慢性毒性試驗(yàn)

1、毒理學(xué)作業(yè) 農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥為白色粉末，水溶性，表1是其對(duì)SD大鼠的急性經(jīng)口試驗(yàn)結(jié)果，請(qǐng)根據(jù)表中結(jié)果，給出該農(nóng)藥的90天亞慢性試驗(yàn)的試驗(yàn)方案，以及如何對(duì)保證實(shí)驗(yàn)質(zhì)量予以控制。表1 2，4-滴鈉鹽原藥對(duì)SD大鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果動(dòng)物性別劑量（mg/kg)動(dòng)物數(shù)（只）死亡數(shù)（只）LD50及95%可信限（mg/kg)雌21550584（430794）46451100055215055雄21550501（344730）46452100055215055 劑量設(shè)置高劑量為25%LD50，中劑量為12.5%, 低劑量為6.3%。雌性LD50為584mg/kg，高劑量為146mg/kg,中劑量為73mg

2、/kg,低劑量為37mg/kg；雄性為501mg/kg，高劑量為125mg/kg，63mg/kg,低劑量為31mg/kg。根據(jù)GB15670農(nóng)藥登記毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的農(nóng)藥急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，2，4-滴鈉鹽原藥的LD50500mg/kg，屬于低度農(nóng)藥。因此試驗(yàn)時(shí)選擇SD大鼠的LD50為584mg/kg。農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥SD大鼠亞慢性毒性試驗(yàn)?zāi)康? 研究喂飼農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥對(duì)大鼠的亞慢性毒性。方法：取初斷乳 SD大鼠80只，雌雄各半按照體重隨機(jī)分為4組。將2,4-滴鈉鹽原藥按146、73、37mg/kg mg/kg劑量分別拌入飼料內(nèi)經(jīng)口喂飼染毒90d。觀察：大鼠外觀體征、體質(zhì)量、進(jìn)食情況等

3、。在實(shí)驗(yàn)中期和末期采血檢測(cè)檢測(cè)血液學(xué)。試驗(yàn)?zāi)┢跈z測(cè)血生化指標(biāo)以及尿常規(guī)檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，計(jì)算臟器指數(shù)，并對(duì)主要臟器進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。1 材料和方法1.1 受試物 農(nóng)藥2,4-滴鈉鹽原藥，白色粉末，水溶性，由某地某農(nóng)藥公司提供。SPF級(jí)初斷乳大鼠80只，雌雄各半，體質(zhì)量50100 g，由XXX實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng)提供，動(dòng)物合格證號(hào)為醫(yī)動(dòng)字第XX-XXXX號(hào)。1.2 飼養(yǎng)與管理 SPF 環(huán)境條件下，同組同性別兩只一籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。環(huán)境溫度 2125，相對(duì)濕度 40%60%。嚴(yán)格控制晝夜交替。1.3實(shí)驗(yàn)方法 試驗(yàn)前將雌、雄大鼠各半按體重隨機(jī)分為3個(gè)劑量組和1個(gè)對(duì)照組，每組20只

4、，將2,4-滴鈉鹽原藥按146、73、37mg/kg mg/kg劑量分別均勻混入飼料中制成顆粒飼料輻照滅菌后分別供高、中、低劑量組動(dòng)物食用，連續(xù)每日一次喂養(yǎng)90d；對(duì)照組給予不加受試物的正常飼料。1.4 觀察指標(biāo)1.4.1一般情況 試驗(yàn)期間觀察動(dòng)物的一般情況包括外觀體征和行為活動(dòng)、糞便性狀、食物攝入量及體重變化等。1.4.2血常規(guī)在實(shí)驗(yàn)中期和末期按常規(guī)方法測(cè)定血液學(xué)指標(biāo)1.4.3血液生化指標(biāo)試驗(yàn)?zāi)┢跈z測(cè)血液生化指標(biāo)1.4.5尿常規(guī)檢查 尿常規(guī)測(cè)定顏色、 pH值、比重(SG)、 尿糖(GLU)、 尿蛋白，將尿液離心， 并對(duì)尿中沉淀物進(jìn)行鏡檢。1.4.6臟器病理 解剖動(dòng)物，取心、 肝、 脾、 肺、

5、 腎、 胃腸、 腎上腺、胸腺、 腦和卵巢、 睪丸等臟器，觀察大體變化并稱重（胃腸除外），計(jì)算臟器指數(shù)臟器質(zhì)量/體重）100%。將解剖取得的臟器福爾馬林固定，常規(guī)制片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，符合正態(tài)的指標(biāo)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，否則經(jīng)變換后分析。 結(jié)果2.1 一般狀況2.2 體重變化 見表22.3 血常規(guī)檢驗(yàn)結(jié)果 見表32.4 血生化檢測(cè)結(jié)果 見表42.5 尿常規(guī)檢查2.5 臟器指數(shù) 見表52.6 病理組織學(xué)檢查表2 2，4滴原藥大鼠90 d亞慢性毒性試驗(yàn)體質(zhì)量變化情況性別劑量（mg/kg)染毒周數(shù)

6、02581013雌03773146雄03773146表3 2，4-滴鈉鹽原藥大鼠90 d亞慢性毒性試驗(yàn)血液常規(guī)檢驗(yàn)性別劑量（mg/kg)RBC/(1012L-1)Hb/(gL-1)WBC/(109L-1)GRA/%LYM/%雌性試驗(yàn)前03773146雄性試驗(yàn)前03773146雌性試驗(yàn)后03773146雄性試驗(yàn)后03773146表4 2，4-滴鈉鹽原藥大鼠90 d亞慢性毒性試驗(yàn)血生化檢測(cè)結(jié)果性別劑量（mg/kg)AST/(UL-1)ALT/(UL-1)ALP/(UL-1)BUN/(mmol L-1)TP/(g L-1)ALB/(g L-1)雌03773146雄03773146表5 臟器指數(shù)%性別

7、劑量（mg/kg)大腦肝臟脾臟心臟肺臟胸腺腎臟腎上腺睪丸（卵巢）雌03773146雄037731463. 討論控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量1 大鼠毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)技術(shù)因素的質(zhì)量控制1. 1 動(dòng)物臨床觀察指標(biāo)的質(zhì)量控制 在藥品臨床前大鼠毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究過程中 , 其臨床觀察指標(biāo)主要包括行為活動(dòng) 、體質(zhì)量 、增質(zhì)量 、飼料生物利用度等 ，而體質(zhì)量 、增質(zhì)量 、飼料生物利用度指標(biāo)均為需要統(tǒng)計(jì)分析的客觀指標(biāo) 。因其貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期 ,數(shù)據(jù)的客觀性與實(shí)驗(yàn)環(huán)境 、給藥過程中動(dòng)物感受是否舒適 、動(dòng)物密度 、動(dòng)物健康狀況等因素相關(guān) 。在動(dòng)物臨床指標(biāo)統(tǒng)計(jì)分析前控制體系中 , 實(shí)驗(yàn)環(huán)境應(yīng)選擇 S P F級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 ;每籠 2只

8、 ;體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)適應(yīng)環(huán)境周期 1周 ; 計(jì)算飼料攝入量每日應(yīng)稱質(zhì)量 , 每周給藥完畢即計(jì)算大鼠的飼料生物利用度 ,比較分析各組動(dòng)物飼料生物利用度的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ; 分析產(chǎn)生差異的原因 ,討論差異是否與動(dòng)物自發(fā)性疾病 ( 如大鼠自發(fā)性糖尿病會(huì)引起大鼠飼料生物利用度明顯增大 ) 有關(guān) , 同時(shí)應(yīng)排除營養(yǎng)因素或給藥途徑對(duì)動(dòng)物的損傷因素 ; 在動(dòng)物行為活動(dòng)指標(biāo)觀察中應(yīng)在每日投藥過程中重點(diǎn)觀察大鼠投藥部位是否發(fā)生充血 、水腫 、嘔血 ,是否發(fā)生動(dòng)物爭(zhēng)斗外傷 、皮毛稀疏豎散 、糞便性狀改變等變化 ,并及時(shí)處理與藥物因素?zé)o關(guān)的改變 ,并詳細(xì)記錄 ,認(rèn)真分析 。1. 2 血液學(xué)樣本的質(zhì)量控制 大鼠慢性毒理學(xué)

9、實(shí)驗(yàn)中血液學(xué)常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目主要有紅細(xì)胞計(jì)數(shù) ( R B C ) 、血紅蛋白定量 ( H b ) 、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類計(jì)數(shù) ( WB C+D C ) 、血小板計(jì)數(shù) ( P T ) 、凝血時(shí)間 ( C T ) ; 血清生物化學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目主要有天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( A S T ) 、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 ( A L T ) 、堿性磷酸酶 ( A L P ) 、總蛋白 ( T P ) 、清蛋白 ( A L B ) 、總膽固醇 ( T -C H O ) 、總膽紅素 ( T - B I L ) 、空腹血糖 ( G L U ) 、尿素氮 ( B U N ) 、肌酐 ( C r ) 。選擇合適的血樣采集法，不僅

10、對(duì)動(dòng)物損傷小 、樣本溶血率低 、可重復(fù)采樣等優(yōu)勢(shì) ,而且使大鼠慢性毒理實(shí)驗(yàn)中分階段檢測(cè)藥物對(duì)造血系統(tǒng) 、生化系統(tǒng)的影響成為可能。1. 3 動(dòng)物病理組織標(biāo)本分析前的質(zhì)量控制 組織病理學(xué)檢查對(duì)于判斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性靶器官或靶組織具有重要意義 。在長(zhǎng)期毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中有重要地位 , 是評(píng)價(jià)藥物毒性的重要依據(jù)。組織病理學(xué)檢查對(duì)判斷動(dòng)物的毒性靶器官或靶組織具有重要意義 。實(shí)踐中使用的組織學(xué)檢測(cè)前優(yōu)質(zhì)標(biāo)本取材流程可以為 : 根據(jù)實(shí)驗(yàn)取材項(xiàng)目設(shè)計(jì)表格 ,需要取得臟器系數(shù)的器官或組織和其他器官或組織分別標(biāo)示于一個(gè)完整的記錄單元中 ; 使用 250 m L廣口瓶貯存新鮮配制的 10%甲醛溶液 180 200 m L

11、備用 ; 對(duì)擬取材的大鼠進(jìn)行解剖分組順序編號(hào) ; 大鼠麻醉狀態(tài)下 ,股動(dòng)脈放血致死胸腔組織 ( 胸腺 、心 、肺 ) 腹腔組織 ( 胃 、十二指腸 、空腸 、回腸 、盲腸 、直腸 、肝 、脾 、胰腺 、腎上腺 、腎 、卵巢 、子宮 、膀胱 、前列腺 、睪丸 、附睪 ) 頸 、腦部組織 ( 甲狀腺 、腦 、垂體 、脊髓 ) 。其中胸腺 、胰腺 、腎上腺 、卵巢 、甲狀腺 、垂體 、脊髓等腺體組織或微小組織應(yīng)使用擦鏡紙或紗布非擠壓式包裹置于 3. 6% 4. 0%甲醛 。這樣使浸泡于甲醛溶液中的易混淆臟器在進(jìn)行石蠟包埋時(shí)容易分辨 ,同時(shí)保證病理組織學(xué)檢查中組織樣本數(shù)目完整 ; 其他組織除大體觀察有

12、明顯病灶的組織外 ,要求動(dòng)物組織樣本均取自該組織的代表區(qū) 。1. 4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的給藥途徑不同而引起的取材質(zhì)量控制 因臨床給藥途徑不同 , 在大鼠慢性毒理實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中存在不同的給藥方式 , 主要給途徑有主要給藥途徑有灌胃 、直腸 、舌下 、腹腔注射 、肌內(nèi)注射 、皮膚涂抹等。在毒理學(xué)研究中可能通過對(duì)直接接觸藥物部位的檢測(cè)結(jié)果分析藥物慢性刺激對(duì)直接刺激局部組織的影響 ,還可以分析藥物吸收和給藥技能合理與否 。2 影響大鼠毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的環(huán)境 、動(dòng)物福利 、誤差控制2. 1 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的環(huán)境控制 在不同環(huán)境中進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的大鼠 ,對(duì)照組和藥物組動(dòng)物均不同程度地存在因環(huán)境所致的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或間質(zhì)性肺

13、炎等病理變化 ,這些變化與實(shí)驗(yàn)環(huán)境級(jí)別及日常消毒措施合理與否息息相關(guān)。樣本固定前的大體解剖觀察處理與組織學(xué)檢查結(jié)果具有直接關(guān)系 ,取樣以肉眼能觀察到病灶的肺葉和表面觀察正常的肺葉各取一為原則 ,在同一個(gè)受試動(dòng)物肺組織中不可單一地單純選擇大體觀察異常的小葉或大體觀察正常的小葉樣本 。2. 2 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的動(dòng)物福利控制 動(dòng)物在毒理學(xué)研究過程中，會(huì)產(chǎn)生緊張 、疼痛 、呼吸困難 、痙攣 、顫抖 、腹瀉 、孔道出血 、癱瘓 、休克 , 甚至死亡的情況 。因此 ,它們?cè)谟龅娇謶只驉毫迎h(huán)境時(shí) ,生理和心理都可能患病 ?？刂圃瓌t為實(shí)驗(yàn)人員投藥過程時(shí)間宜短不宜長(zhǎng) , 抓取動(dòng)物輕拿輕放 , 血清采樣宜快不宜慢

14、,盡量提供人為因素影響小的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，要求實(shí)驗(yàn)研究人員具備愛護(hù)動(dòng)物之心和熟練的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技能并貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期 。2. 3 毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的誤差質(zhì)量控制 在大鼠慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中系統(tǒng)誤差主要與樣本的隨機(jī)性 、實(shí)驗(yàn)操作的一致性 、流程的恒定性有關(guān) 。 抽樣誤差 : 一般情況下 ,慢性毒性實(shí)驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組應(yīng)使用相等數(shù)量的雌 、雄動(dòng)物 。每組動(dòng)物大鼠至少 20只 。差異應(yīng)不超過平均體質(zhì)量的 20%。 系統(tǒng)誤差 。包括下列兩類情況 。實(shí)驗(yàn)技術(shù)熟練因素造成的誤差 : 在毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中 ,為了真實(shí)反映外來化合物的毒性 ,除了要統(tǒng)一各種實(shí)驗(yàn)條件外 , 每日的給藥時(shí)間應(yīng)一致 。一是可比性強(qiáng) ,二是為了避免錯(cuò)誤而影響其他藥理實(shí)驗(yàn)甚至臨床用藥 。因此 , 應(yīng)將實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)熟練因素以一定的模式貫穿于各實(shí)驗(yàn)組中 ,在整個(gè)給藥期中給藥人員每天應(yīng)互換給藥的組別 ,同時(shí)應(yīng)保證給藥時(shí)間的準(zhǔn)確性和一致性 ；流程造成的誤差控制 : 系統(tǒng)誤差可因分析方法 、儀器校正錯(cuò)誤 、試劑純度不夠 、檢測(cè)者的感觀 、環(huán)境因素改變等因素造成 ;隨機(jī)可能因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過程中各種隨機(jī)因素的共同作用等因素造成 。如實(shí)驗(yàn)過程的溫度波動(dòng) - 電壓變化 - 儀器故障