月季組織培養(yǎng)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上目錄摘要···············································&

2、#183;···4前言·············································

3、3;·····4綜述············································&

4、#183;······51外植體··········································51

5、.1取材部位1.2取材時間1.3取材大小2. 消毒···········································83. 接種方式·

6、83;·····································84.培養(yǎng)基···········

7、83;······························94.1基本培養(yǎng)基4.2激素4.2.1不同激素對誘導(dǎo)愈傷組織的影響4.2.2不同激素對繼代培養(yǎng)的影響4.2.3不同激素對生根培養(yǎng)的影響4.3糖濃度的影響4.4無機(jī)鹽4.5瓊脂5.培養(yǎng)基的配置···

8、3;······························136.培養(yǎng)條件··················&#

9、183;···················147防褐化·····························&#

10、183;········14技術(shù)路線與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)································15參考文獻(xiàn)······

11、83;···································17摘要：為了進(jìn)行月季組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，我們查閱了相關(guān)文獻(xiàn)，從多個方面了解影響月季組織培養(yǎng)的因素，如外植體的取材部位、時間、大小、消毒、接種方式、不同階段激素的配比、培養(yǎng)基成分、

12、培養(yǎng)條件等，以期在實(shí)驗(yàn)中調(diào)控月季組培的環(huán)境，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行?；谖覀兿胩骄考に貙M織培養(yǎng)中細(xì)胞的脫分化和再分化的作用這一想法，我們的設(shè)計(jì)了以濃度、濃度、外植體部位為影響因素的正交實(shí)驗(yàn)（L9（3），并考察NAA與6BA的交互作用。同時，我們還以接種方式作為單因素考察其對愈傷組織誘導(dǎo)的影響。關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)、影響因素、正交前言在閱讀了植物組織培養(yǎng)的相關(guān)文獻(xiàn)資料后，我們設(shè)計(jì)了此次組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)方案，考察細(xì)胞分裂素濃度、生長素濃度、接種方式、取材部位因素對愈傷組織的形成有何影響，期望尋找出誘導(dǎo)月季愈傷組織的最佳條件；同時探究由愈傷組織誘導(dǎo)出芽及生根所需的最佳濃度配比。并在月季組織培養(yǎng)過程中，掌握外植體

13、消毒方面要注意的事項(xiàng)，整個培養(yǎng)過程中培養(yǎng)條件的選取與控制，實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)的現(xiàn)象的觀察記錄以及分析，在這個過程中不斷加強(qiáng)理論與實(shí)踐的聯(lián)系，深化對理論知識的理解。對于外植體選擇，我們采用了以往研究者的做法，即選用帶腋芽的枝條。但是，我們的不同之處在于，我們還保留了一部分剛好能包裹住腋芽的葉柄。這樣做的目的是為了在消毒時避免芽受到太大損傷。參考論文中防褐化多用抗氧化劑和其他抑制劑，減輕外植體在組培中的酶促褐變，我們根據(jù)生理生化原理，考慮到酶活性與溫度有關(guān)、以及外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)含量有關(guān)，因此需對外植體做如下處理：接種前先將外植體用低溫水流沖洗24小時；選擇晴朗天氣采摘外植體。激素濃度的選擇：由于不同

14、種的月季對濃度的需求有差異，我們是以前人得到的最適濃度為中間值，設(shè)置了不同濃度，試圖探究我們所培養(yǎng)的月季品種所需的最適宜濃度。培養(yǎng)條件：我們決定采用一般植物組織培養(yǎng)的條件，如溫度控制在24左右，光照時間為12h/天。考慮到光對褐化的影響，我們計(jì)劃接種后暗培養(yǎng)一周后，再光照下培養(yǎng)。培養(yǎng)基的配制方面，我們著重考慮pH對培養(yǎng)基的影響。通過查閱文獻(xiàn)，激素加入MS培養(yǎng)基后將pH調(diào)為6，配置鐵鹽過程中同樣注意pH的調(diào)節(jié)。 組織培養(yǎng)的每個步驟均有可考察因素，很多細(xì)節(jié)需要把握，在實(shí)驗(yàn)過程中不斷吸取經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)，學(xué)以致用。因此我們希望通過實(shí)驗(yàn)深入學(xué)習(xí)植物組織培養(yǎng)的基本過程和基本方法，了解組培的經(jīng)濟(jì)意義和實(shí)用價(jià)值，

15、能夠廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)理論與實(shí)際應(yīng)用的相互轉(zhuǎn)化。綜述1. 外植體1.1取材部位外植體一般選取生長健壯的當(dāng)年枝條的飽滿而外萌發(fā)的側(cè)芽1。李青等分別選取一年生枝條的冬牙當(dāng)年生枝條腋芽作為外植體，相同條件下培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)越冬牙的成活率較高，且從接種到萌芽時間短，生長快，在后代繁殖中植株健壯1。本實(shí)驗(yàn)材料取自盆栽的豐花月季，剪取腋芽尚未萌發(fā)的枝條，去除莖段兩端各2毫米選芽以莖段中芽為最好，因?yàn)榻臃N后，中段芽第5 天左右就能萌發(fā)，而基部和稍部的芽往往遲至15 天才萌發(fā)2。用“和平”品種月季的枝條，均等分為6 段，取每段的一個側(cè)芽培養(yǎng)在無激素的MS 基本培養(yǎng)基上，2-3 天即可見接近枝條最頂端和緊挨著枝

16、條基部的芽發(fā)育最慢，而枝條中的芽發(fā)育比較快2。不同外植體的脫分化能力不同，誘導(dǎo)出愈傷組織的頻率和愈傷組織的狀態(tài)也存在較大差異。以葉片和莖段為外植體誘導(dǎo)得到的形態(tài)上差異不明顯，愈傷組織多數(shù)呈乳黃色部分呈綠色，白色，松散，程度不一，葉片誘導(dǎo)率稍高于莖段能達(dá)到90%以上，選取好的經(jīng)2-3代的繼代培養(yǎng)可獲得較疏松的，適宜于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的愈傷組織；葉柄為外植體主要是在基部及切口處形成愈傷組織，接種后生長極其緩慢，接10D時可見邊緣切口處發(fā)生褐化，得到愈傷組織少；因此認(rèn)為葉片和莖段是誘導(dǎo)愈傷組織和進(jìn)行細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的理想材料3。1.2取材時間外植體的取材部位對芽的萌發(fā)也有影響。外植體的取材時間及培養(yǎng)所需時間

17、對月季嫩莖的發(fā)育和增殖也有影響。對于“Bulgarian rose”而言，選取外植體的最佳時間是冬季4。外植體的取材時間及培養(yǎng)所需時間對月季嫩莖的發(fā)育和增殖也有影響。對于“Bulgarianrose”而言選取外植體的最佳時間是冬季(1-3月)(321；而“Improvedfire”月季的培養(yǎng)時問以28d繼代一次較好，超過28天，莖的數(shù)目就不再增加了5。1.3取材大小取無菌苗葉片切成0.5cm×0.5cm的小塊，葉柄，莖段切成小段3。外植體很小時，有利于培養(yǎng)脫毒的植株對月季的杉樹壞疽環(huán)斑病毒(Prtmus necrotic ringspot virus，PNRSV)可通過莖尖培養(yǎng)的方式

18、達(dá)到脫毒的目的，如果單純?yōu)榱丝焖俜敝?，可用大的莖尖或莖段進(jìn)行離體培養(yǎng)，這時外植體的大小決定了莖尖的成活比例。一般說外植體愈大，成活率愈高，成苗時間愈短。莖尖在1-10mm長短時，對形成多芽苗最有效，不但多芽苗所占百分率高，而且每個莖段的側(cè)枝數(shù)也比較多。外植體的大小同時影響外植體自身的發(fā)育和月季組培苗莖的增殖，外植體的長度在9.0-10.0mm，直徑在3.0-3.5mm范圍時莖的增殖和發(fā)育是最好的。但Horn對某幾種月季進(jìn)行微繁實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)外植體的大小對莖的增殖、葉片數(shù)目沒有影響，其他一些研究者對只有個莖節(jié)的“Sweet Promise”進(jìn)行組織培養(yǎng)中得到了類似的結(jié)論5。 2. 消毒 接種材料為當(dāng)

19、年抽生側(cè)芽飽滿的幼嫩莖段，自來水沖洗10-20min；75%或70%乙醇浸泡30s,0.1%升汞表面消毒3min,無菌水沖洗4-5次，將側(cè)芽切下接種到MS培養(yǎng)基上，獲得無菌苗備用3。 取回枝條用自來水沖洗干凈，無菌條件下用70%酒精表面消毒30-40s，再用0.1%Hgcl2溶液滅菌5-10min，最后用無菌水沖洗3-5次1。 組織培養(yǎng)中的污染源大致可分為三類：外界環(huán)境污染，植株內(nèi)生菌和外植體處理不當(dāng)。因此，可在試驗(yàn)過程中每隔一段時間用巴斯德消毒液噴灑培養(yǎng)室；對培養(yǎng)基，工具的高壓滅菌要徹底；試驗(yàn)員要在進(jìn)入超凈太之前用1.0%巴斯德消毒液擦手；接種時工具和手不要在培養(yǎng)基上方攪動，以防止細(xì)菌落入其

20、中；探索適宜的消毒處理時間。此外，防止細(xì)菌特別是內(nèi)生菌污染，很重要的措施是在培養(yǎng)基中加入抗生素63.接種方式 在外植體的接種中采用了垂直接種，斜向上45度接種，水平接種和反轉(zhuǎn)接種4種方式，發(fā)現(xiàn)垂直接種和斜向上45接種，水平接種和反轉(zhuǎn)接種4種方式，發(fā)現(xiàn)垂直接種和斜向上45度接種是最佳的接種方式，腋芽再生芽數(shù)多，且生長健壯，這可能與植物的生長極性有關(guān)1。4.培養(yǎng)基4.1基本培養(yǎng)基眾多培養(yǎng)基中以 MS 培養(yǎng)基的效果為最好，廣泛用于月季的離體快速繁殖中。對 MS 培養(yǎng)基的成分及物理性能進(jìn)行合理的選擇會提高月季組織培養(yǎng)的成功率4莖段培養(yǎng)階段，將帶有腋芽的嫩莖接種到不添加任何激素類物質(zhì)的 MS 和 1/2

21、MS 培養(yǎng)基上，兩周后，MS 培養(yǎng)基上的腋芽生長，而在 1/2MS 培養(yǎng)基上的腋芽幾乎不萌發(fā)或發(fā)育不良4。MS培養(yǎng)基上愈傷個數(shù)最多達(dá)到32個，誘導(dǎo)率為35.5%；培養(yǎng)基上愈傷個數(shù)達(dá)到27個，誘導(dǎo)率為30%，培養(yǎng)4d后外植體葉的一端開始膨大，葉片切口處可見少數(shù)綠色愈傷組織；大小如沙粒，柔軟，結(jié)構(gòu)密實(shí)。而WPM，White在培養(yǎng)第二天外植體即有部分開始脫色變白，第三天有部分變黃，大部分褐變，最后枯死。可見MS，B5兩種培養(yǎng)基對愈傷組織的誘導(dǎo)效果明顯，結(jié)果表明，不同培養(yǎng)基對葉片誘導(dǎo)程度可排列為MS>B5>WPM>White.94.2激素4.2.1不同激素對誘導(dǎo)愈傷組織的影響誘導(dǎo)培養(yǎng)

22、基以為基本培養(yǎng)基，附加適量的細(xì)胞分裂素6-BA和NAA。NAA增加至0.1mg/L時，6-BA濃度的高與低已對增殖系數(shù)不產(chǎn)生明顯影響。最適的側(cè)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5-3.0mg/L和NAA0.01-1.00mg/L，且培養(yǎng)基中添加蔗糖有增加叢生芽數(shù)量的作用1。激素及激素濃度直接影響著愈傷組織的狀態(tài)，質(zhì)地和分散性。單獨(dú)使用細(xì)胞分裂素沒有愈傷組織形成，對正交研究進(jìn)行極差分析，各因素對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響作用：2,4-D濃度KT濃度BA濃度NAA濃度。最佳愈傷組織誘導(dǎo)組合是：KT2mg/L NAA2mg /L+2,4-D 1 mg /L3。BA用量及側(cè)芽在莖段上的位置對側(cè)芽發(fā)育的影響。在

23、不同濃度BA的MS培養(yǎng)基上，BA含量為0.03-0.3毫克/升的培養(yǎng)基促進(jìn)側(cè)芽的發(fā)育，若超過0.3mg/L則延遲芽的發(fā)育，但對于莖段中部的芽影響較小7。不同生長素種類和濃度對月季生根和移栽成活率的影響。以“彩云”為材料，用NAA 誘導(dǎo)生根和提高移栽成活率效果最好，濃度為100ppm 為宜，現(xiàn)在IAA 誘導(dǎo)生根和提高移栽成活率效果并不理想，其濃度只能在1mg/L 以下,超過時對生根的促進(jìn)作用已不顯著,反而大幅度降低移栽成活率。NAA和IBA對月季的誘導(dǎo)生根都有較好的效果,在1/2MS培養(yǎng)基附加NAA或IBA0.1-1.5mg/kg均可誘導(dǎo)不定根的產(chǎn)生,生根63.3%-93.3%8。4.2.2不同

24、激素對繼代培養(yǎng)的影響低濃度的6-BA有利于不定芽的增殖，濃度過高則抑制不定芽的增值，適量NAA有利于芽和葉生長。在NAA濃度相同而BA濃度不同的培養(yǎng)基中，隨BA濃度的升高，芽苗的增殖系數(shù)也相應(yīng)提高。此外，增殖系數(shù)還與品種有關(guān)。從增值倍數(shù)、葉片數(shù)。再生芽長勢等綜合因子來看，MS+BA0.5-02.0mg/L+NAA0.01-0.05mg/L是最適的不定芽增殖培養(yǎng)基1。NAA濃度為0.5mg/kg時對生根是較為適宜的濃度,而不必向在誘導(dǎo)植物芽分化時必須按一定比例配比細(xì)胞分裂素與生長素混合使用8。將上述無菌芽從原莖段上切下轉(zhuǎn)接到MS+BA1-2+IAA0.1-0.3或MS+BA1-2+NAA0.01

25、-0,1的培養(yǎng)基上促使嫩莖長出更多的側(cè)芽，原莖段棄去。繼代增殖培養(yǎng)基每升用蔗糖30克7。4.2.3不同激素對生根培養(yǎng)的影響多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用的培養(yǎng)基為1/2MS(大量元素減半）。Skivrin等在用“Forever yours ”月季做生根試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，采用1/4MS培養(yǎng)基，不加生長素可以促進(jìn)生根。利用1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭誘導(dǎo)生根，生根率最高90%，且隨著隨著活性炭百分比的加大，生根率逐漸下降?；钚蕴康募尤肽茱@著促進(jìn)生根量和根的長勢，但又含活性碳的培養(yǎng)基只見較少發(fā)根，且根細(xì)弱，說明植物激素對于生根是必不可少的。MS培養(yǎng)基中鹽濃度過高，特別是氮含量過高會導(dǎo)致生根不適應(yīng)，所以需減少無機(jī)

26、鹽用量1。4.3糖濃度的影響不同類型的月季，其組培要求的碳源和糖濃度有所不同。月季組培最常用的碳源是蔗糖，在豐花月季的組織培養(yǎng)中，初代培養(yǎng)的蔗糖含量為5%，繼代培養(yǎng)的蔗糖含量為3%時培養(yǎng)效果最好9。4.4無機(jī)鹽試驗(yàn)證明，全量的MS無機(jī)鹽對莖增殖效果最好5。無機(jī)鹽濃度和含糖量對月季生根的影響。采用較低濃度的無機(jī)鹽對月季生根效果較好。但糖濃度不可降低。否則削弱苗的生長勢，試驗(yàn)證明，1/2MS+30克/升蔗糖利于生根10。Hyndman認(rèn)為 MS 培養(yǎng)基中的氮鹽含量是影響月季生根的主要因素，把 MS 培養(yǎng)基中氮素含量從 60mmol/l減少到 7.5mmol/L（相當(dāng)于 1/8MS 中的氮素含量）時

27、，嫩莖生根效果良好，保持 7.5mmol/L的氮素含量，MS 培養(yǎng)基中其它無機(jī)鹽的濃度減少到原配方的1/16，對生根沒有影響；但氮素含量過高會引起月季組培苗的生根不適4。4.5瓊脂 培養(yǎng)基中的固化支持物，并非完全不起作用的物質(zhì)，它含有能影響外植體的物質(zhì)，培養(yǎng)基中大約有十分之九的固化支持物是瓊脂，月季組織培養(yǎng)中，瓊脂的種類和產(chǎn)品質(zhì)量的差異會影響芽的發(fā)育與增殖：月季的側(cè)芽在純凈的瓊脂BD上發(fā)育較好，而在Merck1614和不純凈的BD上發(fā)育較差，但目前尚未有較好的方法檢測瓊脂的質(zhì)量?，F(xiàn)在已經(jīng)有人成功地利用其他支持物替代價(jià)格昂貴的瓊脂，月季試管苗在蛭石作固化物的培養(yǎng)基上的生根率幾乎與瓊脂作固化物的培

28、養(yǎng)基上的一樣，而移栽成活率卻高于瓊脂作固化物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的月季 10 。5.培養(yǎng)基的配置配置母液和激素時應(yīng)注意的事項(xiàng)：（1）配置母液時，各種化合物一定要單獨(dú)充分溶解后再倒入容量瓶中定容，避免其中的離子之間發(fā)生沉淀(2）激素一般難溶于水，所以生長素用少量0.1mol/L NaOH溶液，少量0.1mol/L HCL溶解，然后用蒸餾水或去離子水定容6。6.培養(yǎng)條件（溫度、光照、PH、無機(jī)鹽）誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)均在黑暗條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為25，3-4周更換一次培養(yǎng)基。3次重復(fù)。培養(yǎng)溫度21最好最高不超過25，有晝夜溫差，生根階段對溫度變化非常敏感，生根溫度保持在21度左右，光照10-12h/d，光強(qiáng)80

29、0-1200LX。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在不同的溫度下其生長情況有很大的差異。在21時嫩莖生根數(shù)目最多,而且嫩莖生根的百分率也最高,然而在溫度低于或高于21時,嫩莖生根數(shù)目均較21時減少,同時嫩莖生根的百分率降低,呈現(xiàn)出一個明顯的生根數(shù)量變化趨勢8。7防褐化 對于較易褐化的植物，在培養(yǎng)過程中應(yīng)在接種后進(jìn)行一段時間的遮光處理或暗培養(yǎng)；縮短培養(yǎng)基更換時間，接種后1-2天即轉(zhuǎn)至新鮮培養(yǎng)基中。此外，在培養(yǎng)基中加入抗氧化劑和其他抑制劑，可以有效地減輕外植體在組培中的酶促褐變，因此可選擇在培養(yǎng)基中加入抗生素（如VC），活性炭 等6。外源激素2mg/L 6-BA易引發(fā)褐變，應(yīng)用時可考慮少量添加。2mg/L Kt和2mg/L NAA對組織褐變影響不大，考慮使用；使用乙醇消毒劑時，對外植體泡的時間不能過長，建議以5-10為佳；全光照條件培養(yǎng)容易誘發(fā)褐變，采用仿人工氣候條件培養(yǎng)較其他條件培養(yǎng)科有效抑制褐變的發(fā)生，條件允許時推廣使用4。雖然我們培養(yǎng)的是木本植物，防褐化也是我們要注意的問題。特別是王的關(guān)于外源激素2mg/L 6-BA易引發(fā)褐變，觀點(diǎn)新穎值得重視。我們可以在分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時，把褐變和6-BA濃度關(guān)系進(jìn)行簡要分析。 外植體的大小對褐變的發(fā)生及褐變程度有一定影響. Bonga認(rèn)為外植體越小,切面與體積的比率越大，傷害及褐化的程度就越大;相