轉染細胞的穩(wěn)定篩選方法和實驗步驟

1、.轉染細胞的穩(wěn)定篩選1、藥物篩選前的準備藥篩前應確定藥物篩選濃度，不同細胞系具有不同的藥物敏感度，因此在篩選前應該用在藥物濃度范圍內設定濃度梯度來確定篩選穩(wěn)定克隆的藥物濃度。藥物濃度一般確定為能使未轉染細胞在7天之內全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般時間很短，只需要3-4天即可。2、藥物篩選注意事項（1）藥篩的時間加藥時間一般為轉染后48h。但由于慢病毒表達較慢，因此利用慢病毒感染將質粒轉入細胞的方法，加藥時間一般為72h空白對照加藥篩選時，最好設置空白對照，即未轉染細胞同時加藥，待空白對照中細胞全部死亡，轉染組中不具有抗藥性的細胞基本藥殺完，但還需繼續(xù)加藥。（2）換液如果加藥后

2、，細胞死亡較多，需及時換液，以防死細胞釋放有害物質導致具有抗藥性的細胞死亡。另外，隨著細胞的代謝，抗生素的活性會降低，因此，每隔3-5天應更換一次抗生素篩選培養(yǎng)液。3、克隆篩選注意事項 若轉染的質粒帶有熒光標記，不管是以下哪種篩選克隆的方法，都應該選擇帶有熒光較強的細胞克隆，因為加藥篩選時，可能會產生耐藥性的細胞，因此最好選擇帶有熒光較強的細胞。若是轉染的質粒不帶有熒光，那么只能盲挑。不管是帶有或者不帶有熒光標記，都應該挑出克隆后進行驗證，驗證存在不成功的概率。因此，挑克隆時，應盡量多挑幾個克隆，20個左右。精品.4、穩(wěn)定克隆篩選步驟（1）有限稀釋法步驟a) 將藥篩后的細胞（一般長滿六孔板即可

3、,若細胞生長很快藥篩時可以在10cm的dish中進行）用胰酶消化下來b) 對消化后的細胞懸液進行計數（如果細胞數量過大，可先稀釋后計數）c) 計算后，用槍頭吸取約200個細胞（其中有部分為死細胞）到10ml培養(yǎng)液中充分混勻，剩下的大部分細胞凍存保種d) 然后將以上10ml細胞懸液加到96孔板中，每孔100ul，這樣有的孔就可能只有一個細胞，過程中注意不時用槍頭吹打混勻細胞懸液（一個96孔板得到的克隆可能較少，可以用同樣的方法做2-3個96孔板）e) 待細胞貼壁后，逐孔在顯微鏡下觀察，沒有細胞或者多余一個細胞的孔劃叉，只有一個細胞的孔劃勾，以做好標記，如果只有一個細胞的孔數量太少，可將一個孔內有

4、兩個細胞的孔也劃勾，但這樣克隆就可能不純。f) 等細胞長起來以后，從96孔板到24孔板，再到6孔板逐漸擴大培養(yǎng)g) 細胞分6孔板中養(yǎng)起來后，可分出部分細胞提蛋白，用western驗證克隆是否為我們所需要的克隆，也可以用RT-PCR進行驗證，若驗證發(fā)現克隆并不是所需要的克隆，即失敗的克隆，就扔掉，保留驗證成功的克隆并大量培養(yǎng)h) 首次驗證成功的克隆養(yǎng)兩周后再次驗證，若仍能保持特性，表示篩出的克隆較穩(wěn)定，這樣較為穩(wěn)定克隆即可大量培養(yǎng)保種，并進行后續(xù)實驗精品.（2）無限稀釋法a) 將藥篩后的細胞（一般長滿六孔板即可）用胰酶消化下來b) 對消化后的細胞懸液進行計數（如果細胞數量過大，可先稀釋后計數）c

5、) 計算后，吸出約5000個細胞，鋪到10cm的dish中，搖勻d) 待細胞貼壁后，在顯微鏡下找到單個細胞，用馬克筆在dish的底部做好標記，然后放到孵箱里培養(yǎng)e) 待單個細胞長成了細胞團（約10個），在顯微鏡下觀察，如果有兩個細胞團靠得很近，則用馬克筆在底部做好標記，然后在安全柜內用白槍頭刮掉周圍舍棄的細胞團，并不斷在顯微鏡下觀察，看周圍的細胞是否已經都被刮掉。然后換培養(yǎng)液（將刮掉的細胞棄去）f) 放到孵箱里培養(yǎng)數天（細胞團較大，約一兩百個），克隆在肉眼下可見g) 將培養(yǎng)液倒掉，用PBS洗兩遍，再吸10ul的胰酶在標記好細胞團的地方不停的快速吹打約1-2min，最后將槍頭里細胞懸液打到24孔板內培養(yǎng)即為挑出的一個克隆，此過程切記不能過長，以免dish太干導致細胞死亡h) 照7的方法每種細胞至少挑出15個克隆，培養(yǎng)一段時間后，消化到六孔板中培養(yǎng)（處理時間根據24孔板內的細胞數量而定）i) 細胞分6孔板中養(yǎng)起來后，可分出部分細胞提蛋白，用western驗證克隆是否為我們所需要的克隆，也可以用RT-PCR進行驗證，若驗證發(fā)現克隆并不是所需要的克隆，即失敗的克隆，就扔掉，保留驗證成功的克隆并大量培養(yǎng)j) 首次驗