2022年膜蛋白的提取方法-全攻略

1、 bbkine 膜蛋白的提取方法-全攻略一、膜蛋白簡(jiǎn)介 膜蛋白在細(xì)胞中扮演著重要的角色：例如被熟知的識(shí)別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸?shù)裙δ埽彩怯盟幍睦硐氲陌悬c(diǎn)，雖動(dòng)物細(xì)胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類(lèi)繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。 根據(jù)膜蛋白別離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類(lèi)型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。 (1) 外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜外表的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上別離下來(lái)，膜構(gòu)造并不被破壞。 (2) 內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常嚴(yán)密，一般只有用去垢劑(detergent)使其膜解

2、后才可別離出來(lái)。 附注：使用分級(jí)抽提方法獲得的“膜蛋白中只有很少一局部是具備多跨膜區(qū)的整合膜蛋白。 二、膜蛋白的提取方法談及蛋白別離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法有時(shí)這些方法常常組合到一起對(duì)特定的物質(zhì)進(jìn)展別離純化。由于蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多，不同的蛋白質(zhì)由于構(gòu)造和組成的差異，其溶解 bbkine 度也各不一樣.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性，同時(shí)可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機(jī)溶劑提取.但是與胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于膜蛋白是嵌在膜中的，水溶性不好，根本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，然后用去污劑把蛋白從

3、膜中釋放出來(lái)。膜蛋白別離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡猛獗砘钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，CHAPS(一種離子去污劑，Emulgen和Lubrol等外表活性劑。 1先別離膜，然后提取；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過(guò)梯度離心得到含有膜蛋白的粗組分。例如：用液氮研磨組織，參加勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑，然后差速離心、蔗糖密度梯度離心。收集37%與41%間的成分，即為質(zhì)膜局部。裂解即可收集膜蛋白 2用特殊的去污劑選擇性的別離。 從膜上提取蛋白有許多困難。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜構(gòu)造中溶解下來(lái)，然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定。去垢劑的選擇

4、通常是依據(jù)他對(duì)所需要蛋白質(zhì)的提取效率來(lái)確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟。雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進(jìn)展純化，但最終仍可能需要除去去垢劑。這常常會(huì)引起蛋白質(zhì)失活，但如果蛋白質(zhì)是用于測(cè)序的，他將不是一個(gè)問(wèn)題。如果不是用于測(cè)序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠.許多文獻(xiàn)和生化試劑供給商的產(chǎn)品目錄中，都介紹有許多種不同的可用來(lái)溶解膜蛋白的去垢劑.然而，他們并不是普遍適用的.在設(shè)計(jì)膜蛋白溶解方案時(shí)，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì).如 triton X-100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)防止使用這類(lèi)去垢劑. 將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核別離

5、后，再進(jìn)一步從細(xì)胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來(lái).這種做法的好處是可以用強(qiáng)烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白，而無(wú)需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成分或染色質(zhì)成分的混入.使用這種方法所獲得的膜蛋白，無(wú)論在種類(lèi)上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白<5000Da要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的缺乏0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無(wú)疑對(duì)于研究膜蛋白的構(gòu)造和功能都是非常重要的. 酸溶解法簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。一般的都是利用4時(shí)所有的蛋白質(zhì)原那么上都溶于Triton X-114水溶液，在溫度超過(guò)20時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此

6、性質(zhì)可提取膜蛋白。3 )膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)：CMP別離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑如SDS溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子別離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)P-端，又具有陽(yáng)離子鈣C-端，與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量。利用原子散射法研究cAMP的別離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而到達(dá)分級(jí)別離的目的。 4) 順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)展抽

7、提的方法。用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的沉淀用標(biāo)準(zhǔn)液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含復(fù)合外表活性劑的蛋白溶解液，可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。 5)離心蛋白提取法centrifugal protein extraction 原理：高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶脹破裂后，超高速離心 評(píng)價(jià)：盡管分級(jí)(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點(diǎn).該方法相較MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上發(fā)表的分級(jí)抽提法減去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡(jiǎn)化,總而言之是一種不

8、錯(cuò)的方法。 6)detergent- based：提取時(shí)先用裂解液裂解胞膜選用不同的去污試劑是關(guān)鍵，梯度離心別離細(xì)胞器(ER)，然后分級(jí)抽提方法。例如，去掉細(xì)胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時(shí)不溶的局部。 細(xì)胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。 考前須知：膜蛋白的含量比擬少，需要收集大量的細(xì)胞，艾美捷推薦用試劑盒提取膜蛋白如：膜蛋白細(xì)胞組分提取試劑盒，很短的時(shí)內(nèi)得到高純度的蛋白并且具有天然活性的多層跨膜蛋白，且能夠有效的去除多糖、核酸等雜質(zhì)。 bbkine 內(nèi)容總結(jié)1 :/ abbkine 膜蛋白的提取方法-全攻略一、膜蛋