第7章--原生質(zhì)體的培養(yǎng)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第7章 原生質(zhì)體的培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交（3學(xué)時）原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體融合本章小結(jié)目的要求：(1)了解原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義(2)掌握原生質(zhì)體分離的大致步驟(3)掌握原生質(zhì)體培養(yǎng)的方法(4)掌握原生質(zhì)體融合的方湊第一節(jié) 原生質(zhì)體的分離與純化原生質(zhì)體培養(yǎng)的意義(1)再生植株 由原生質(zhì)體再生生成植株，不論在進行有關(guān)細(xì)胞生物學(xué)或生物合成和代謝的實驗研究上，還是在組織培養(yǎng)實踐中，都有一定的優(yōu)點：可利用均一的分化細(xì)胞群體；因無細(xì)胞壁，試劑對細(xì)胞作用更為直接，其反應(yīng)能直接測量，以使反應(yīng)產(chǎn)物能較快的分離出來；在理論和實踐中，可極大節(jié)省空間，如在一個三角瓶就能培養(yǎng)210個細(xì)

2、胞，但在大田種植需要4畝地；可縮短實驗周期，如懸浮培養(yǎng)時僅需12個小時。原生質(zhì)體培養(yǎng)可在遺傳學(xué)方面進行基因互補，不親和性，連鎖群和基因鑒定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化問題時，用一個均一的原生質(zhì)體群體可以篩選數(shù)以千計的不同。營養(yǎng)和激素條件，探索誘導(dǎo)單細(xì)胞的分化條件等。(2)用于遠緣體細(xì)胞融合，進行體細(xì)胞雜交。這是一種新的遠緣雜交方法，為人們提供新的育種方法。兩個親緣關(guān)系較遠的植株用一般雜交方法是不容易成功的，而用細(xì)胞融合的方法卻成為可能。首先，兩個原生質(zhì)體融合形成異核體，異核體再再生細(xì)胞壁，進行有絲分裂，發(fā)生核融合，產(chǎn)生雜種細(xì)胞，由此可培養(yǎng)新的雜種。一、原生質(zhì)體(protopla

3、st)的分離（一）材料來源原生質(zhì)體是通過質(zhì)壁分離與細(xì)胞壁分開的部分，是能存活的植物細(xì)胞的最小單位。自從1960年用酶法制備大量植物原生質(zhì)體首次獲得成功以來，原生質(zhì)體培養(yǎng)成為生物技術(shù)最重要的進展之一。通過大量的試驗表明，沒有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體仍然具有"全能性"，可以經(jīng)過離體培養(yǎng)得到再生植株。原生質(zhì)體的分離研究較早，1892年Klereker首先用機械的方法分離得到了原生質(zhì)體，但數(shù)量少且易受損傷。1960年，英國植物生理學(xué)家Cocking首先用酶解法從番茄幼苗的根分離原生質(zhì)體獲得成功。他使用一種由疣孢漆斑菌培養(yǎng)物制備的高濃度的纖維素酶溶液降解細(xì)胞壁。然而，直至1960年纖維素酶和

4、離析酶成為商品酶投入市場以后，植物原生質(zhì)體研究才成為一個熱門的領(lǐng)域。至今從植物體的幾乎每一部分都可分離得到原生質(zhì)體。并且能從煙草、胡蘿、矮牽牛、茄子、番茄等70種植物的原生質(zhì)體再生成完整的植株。此外，原生質(zhì)體融合，體細(xì)胞雜交的技術(shù)也得到廣泛的應(yīng)用。（二）分離方法1.機械分離法1982年，Klercker第一次用機械方法從Stratiots aloides中獲得原生質(zhì)體.他們的做法是首先使細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離,然后切開細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體.2.酶法分離(1)酶的種類及特點構(gòu)成植物細(xì)胞壁的三個主要成分是： 纖維素酶類：占細(xì)胞壁干重的25至50不等。 半纖維素酶類：平均約占細(xì)胞壁干重的53左右。 果膠酶

5、類：一般占細(xì)胞壁的5。分離原生質(zhì)體最常用的酶有纖維素酶、半纖維素酶和果膠酶。 崩潰酶：一種粗制酶 蝸牛酶：主要用于分離小孢子的原生質(zhì)體。纖維素酶是從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑，主要含有纖維素酶C1，作用于天然的和結(jié)晶的纖維素，具有分解天然纖維素的作用，還含纖維素酶Cx，作用于定形的纖維素，可分解短鏈纖維素，另含有纖維素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果膠酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，總體作用是降解纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體。果膠酶是從根霉中提取的，使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來。半纖維素酶制劑可以降解半纖維素為單糖或單糖衍生物。此外，還有蝸牛酶，主要用于花粉母細(xì)胞和四分體

6、細(xì)胞。ZA3-867纖維酶是上海植物生理研究所從野生型綠色木霉同各菌種中提取制成的，粗制品是多種酶的復(fù)合物，含有纖維素酶(包括C1、Cx、B-葡萄糖苷酶等)，果膠質(zhì)，半纖維素酶等，分離細(xì)胞壁的效果較好。這種復(fù)合酶使用時不需加半纖維素酶和果膠酶等，就可以分離出植物原生質(zhì)體。日本產(chǎn)的Onozuka纖維素酶常和果膠酶結(jié)合使用，可先用果膠酶降解果膠，使分開細(xì)胞，再用纖維素酶處理降解細(xì)胞壁。即二步法降解。(2)酶液的配制酶的配比及濃度(見表7-1)。滲透穩(wěn)定劑及pH。植物細(xì)胞壁對細(xì)胞有良好的保護作用。去除細(xì)胞壁之后如果溶液中的滲透壓和細(xì)胞內(nèi)的滲透壓不同，原生質(zhì)體有可能漲破或收縮。因此在酶液、洗液和培養(yǎng)液

7、中滲透壓應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同，或者比細(xì)胞內(nèi)滲透壓略大些。滲透壓大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定，但也有可能阻礙原生質(zhì)體的分裂。因此，在分離原生質(zhì)體的酶溶液內(nèi)，需加入一定量的滲透穩(wěn)定劑，其作用是保持原生質(zhì)體膜的穩(wěn)定，避免破裂。常用的兩種系統(tǒng)為：糖溶液系統(tǒng)：包括甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，濃度約在0.400.80molL。本系統(tǒng)還可促進分離的原生質(zhì)體再生細(xì)胞壁并繼續(xù)分裂；鹽溶液系統(tǒng)：包括KCl、MgS04和KH2PO4等。其優(yōu)點是獲得的原生質(zhì)體不受生理狀態(tài)的影響，因而材料不必在嚴(yán)格的控制條件下栽培，不受植株年齡的影響，使某些酶有較大的活性使原生質(zhì)體穩(wěn)定。另外，添加牛血清蛋白可減少或防止降解壁過程中

8、對細(xì)胞器的破壞。近年來多采用在鹽溶液內(nèi)進行原生質(zhì)體分離，然后再用糖溶液作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此外，酶溶液里還可加入適量的葡聚糖硫酸鉀，它可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這種物質(zhì)可使RNA酶不活化，并使離子穩(wěn)定。酶溶液的pH值對原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。用菜豆葉片作培養(yǎng)材料時，發(fā)現(xiàn)原始pH值為5.0時， 原生質(zhì)體產(chǎn)生得很快，但損壞較嚴(yán)重，并且培養(yǎng)后大量破裂。當(dāng)pH值提高到6.0時，最初原生質(zhì)體卻產(chǎn)生少，但與pH值為5.0時處理同樣時間后相比，原生質(zhì)體數(shù)量顯著增加。原始pH值提高到7.0時生活的原生質(zhì)體數(shù)量進一步增加，損傷的原生質(zhì)體也少得多。 (3)分離原生質(zhì)體兩步分離法一步分離法分離原生質(zhì)體

9、時，首先要讓酶制劑大量地吸附到細(xì)胞壁的纖維素上去，因此，一般先將材料分離成單細(xì)胞，然后分解細(xì)胞壁。采用將酶液減壓滲入組織，或?qū)⒔M織切成薄片等方法，都可增加酶液與纖維素分子接觸的機會。酶處理目前常用的多是"一步法"，即把一定量的纖維素酶，果膠酶和半纖維素酶組成混合酶溶液，材料在其中處理一次即可得到分離的原生質(zhì)體。植物材料須按比例和酶液混合才能有效地游離原生質(zhì)體，一般去表皮的葉片需酶量較少，而懸浮細(xì)胞則用酶量較大。每克材料用酶液1030ml不等。由于不同材料的生理特點不同，在研究游離條件時，必須試驗不同滲透壓濃度的細(xì)胞，找出適宜的滲透濃度。例如，游離小麥懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體的酶液

10、中須加入0.55molL甘露醇，游離水稻懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體的酶液中只加0.40.45molL的甘露醇，兩者差別較大。酶解處理時把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。去表皮的方法是：在無菌條件下將葉面晾干、順葉脈輕輕撕下表皮。如果去表皮很困難，也可直接將材料切成小細(xì)條，放入酶液中。對于懸浮細(xì)胞等材料，如果細(xì)胞團的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龍網(wǎng)篩過濾一次，將原細(xì)胞團去掉，留下較均勻的小細(xì)胞團時再進行酶解。酶解處理一般地在黑暗中靜止進行，在處理過程中偶爾輕輕搖晃幾下。對于懸浮細(xì)胞，愈傷組織等難游離原生質(zhì)體的材料，可置于搖床上，低速振蕩以促進酶解。酶解時間幾小時至幾十

11、小時不等、以原生質(zhì)體游離下來為準(zhǔn)。但是，時間過長對原生質(zhì)體有害，所以一般不應(yīng)超過24h。酶解溫度要從原生質(zhì)體和酶的活性兩方面考慮。對于這幾種酶來說，最佳處理溫度在4050但這個溫度對植物細(xì)胞來說太高，所以一般都在25左右進行酶解。若用葉片作為材料，取已展開的生活葉片，用0.53次氯酸鈉和70酒精進行表面滅菌，然后切成2cm見方。把4g葉組織置于含有200ml不加蔗糖和瓊脂的培養(yǎng)基500ml三角瓶中。在4黑暗條件下培養(yǎng)1624h，以后葉片轉(zhuǎn)入含有纖維素酶、果膠酶、無機鹽和緩沖液的混合液中，pH值為5.6，通常在酶液中使用的等滲劑為0.550.6mol甘露醇。然后，酶液真空滲入葉片組織。在28條件

12、下，每分鐘40轉(zhuǎn)的旋轉(zhuǎn)式轉(zhuǎn)床上培養(yǎng)4h后，葉片組織可完全分離。若用懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，可不經(jīng)過果膠酶處理，因為懸浮細(xì)胞液主要由單細(xì)胞和小細(xì)胞團組成。取懸浮細(xì)胞放人10ml的酶液中(3纖維素酶，14蔗糖，pH值5.06.0)，在2533條件下酶解24h。原生質(zhì)體-酶混合液用30um的尼龍網(wǎng)過濾，通過低速離心收集原生質(zhì)體。在分離原生質(zhì)體時，滲透穩(wěn)定劑有保護原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)及其活力的作用。糖溶液系統(tǒng)可使分離的原生質(zhì)體能再生細(xì)胞壁，并使之能繼續(xù)分裂，其缺點是有抑制某些多糖降解酶的作用。鹽溶液系作滲透穩(wěn)定劑時對材料要求較嚴(yán)格，且使原生質(zhì)體穩(wěn)定，使某些酶有較大活性。但是易使原生質(zhì)體形成假壁，同時使分裂后細(xì)胞是分散的

13、。二、原生質(zhì)體的純化和活力測定（一）原生質(zhì)體的純化 1.離心沉淀法在分離的原生質(zhì)體中，常?；祀s有亞細(xì)胞碎片，維管束成分，未解離細(xì)胞，破碎的原生質(zhì)體以及微生物等。這些混雜物的存在會對原生質(zhì)體產(chǎn)生不良影響。此外，還需去掉酶溶液。以凈化原生質(zhì)體。原生質(zhì)體純化常用過濾和離心相結(jié)合的方法，步驟大致如下：（1)將原生質(zhì)體混合液經(jīng)篩孔大小為40-100tm的濾網(wǎng)過濾，以除去未消化的細(xì)胞團塊和篩管、導(dǎo)管等雜質(zhì)，收集濾液。（2)將收集到的濾液離心，轉(zhuǎn)速以將原生質(zhì)體沉淀而碎片等仍懸浮在上清液中為準(zhǔn)，一般以500rmin離心15min。用吸管謹(jǐn)慎地吸去上清液。（3)將離心下來的原生質(zhì)體重新懸浮在洗液中(除不含酶外，

14、其他成分和酶液相同)，再次離心，去上清液，如此重復(fù)三次。（4)用培養(yǎng)基清洗一次，最后用培養(yǎng)基將原生質(zhì)調(diào)到一定密度進行培養(yǎng)。一般原生質(zhì)體的培養(yǎng)密度為104-106ml。2.漂浮法應(yīng)用滲透劑含量較高的洗滌液使原生質(zhì)體漂浮于液體表面。3.界面法選用兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液的密度大于原生質(zhì)體密度，一種溶液的密度小于原生質(zhì)體密度。（二）原生質(zhì)提活力的測定1.形態(tài)識別形態(tài)上完整，含有飽滿的細(xì)胞質(zhì)，顏色新鮮的原生質(zhì)體即為存活的。2.染色識別在原生質(zhì)體培養(yǎng)前，常常先對原生質(zhì)體的活性進行檢測。測定原生質(zhì)體活性有多種方法，如觀察胞質(zhì)環(huán)流、活性染料染色、熒光素雙醋酸酯(FDA)染色等。這些方法各有特點，

15、但現(xiàn)在一般用的是FDA染色法。FDA本身無熒光，無極性，可透過完整的原生質(zhì)體膜。一旦進入原生質(zhì)體后，由于受到脂酶分解而產(chǎn)生有熒光的極性物質(zhì)熒光素。它不能自由出入原生質(zhì)體膜，因此有活力的細(xì)胞便產(chǎn)生熒光，而無活力的原生質(zhì)體不能分解FDA，因此無熒光產(chǎn)生。FDA染色測活性的方法如下：取洗滌過的原生質(zhì)體懸浮液0.5ml，置于10×100mm的小試管中，加入FDA溶液使其最終濃度為0.01，混勻、置于室溫5min后用熒光顯微鏡觀察。激發(fā)光濾光片用QB24，壓制濾光片用JB8。發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體為有活力的，不產(chǎn)生熒光的為無活力的。由于葉綠素的關(guān)系，葉肉原生質(zhì)發(fā)黃綠色熒光的為有活力的，發(fā)紅色熒光

16、的為無活力的。第二節(jié) 原生質(zhì)體培養(yǎng)將有生活力的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，很快就開始出現(xiàn)細(xì)胞壁再生和細(xì)胞分裂的過程。約12個月后，通過細(xì)胞的持續(xù)分裂，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞團。細(xì)胞團長到24mm左右，即可轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)芽和根長成完整的植株。一、培養(yǎng)基1.碳源2.氮源3.生長物質(zhì)4.鈣鎂5.滲透壓6.pH及滅菌二、培養(yǎng)方法1.液體淺層培養(yǎng)液體培養(yǎng)法是在培養(yǎng)基中不加凝膠劑，原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中，常用的是液體淺層培養(yǎng)法，即含有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層。這種方法操作簡便，對原生質(zhì)體傷害較小，日便于添加培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，是目前原生質(zhì)體培養(yǎng)工作中廣泛應(yīng)用的方

17、法之一。其缺點是原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中分布不均勻，容易造成局部密度過高或原生質(zhì)互相粘連而影響進一步的生長發(fā)育并且難以定點觀察，很難監(jiān)視單個原生質(zhì)體的發(fā)育過程。在固體培養(yǎng)法中提到的飼養(yǎng)培養(yǎng)和共培養(yǎng)，也可以用于液體培養(yǎng)的方法。微滴培養(yǎng)法是液體培養(yǎng)的一種方式。將懸浮有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液用滴管以0.1ml左右的小滴接種在無菌且清潔干燥的培養(yǎng)皿卜由于表面張力的作用，小滴以半球型保持在培養(yǎng)皿表面，然后用Paratilm封口，防止干燥和污染。如果把培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)過來，則成為懸滴培養(yǎng)。由于小滴的體積小，在一個培養(yǎng)皿中可以做很多種培養(yǎng)基的對照實驗。如果其中一滴或幾滴發(fā)生污染，也不會殃及整個實驗。同時也容易添加新鮮培養(yǎng)基。

18、其缺點也是原生質(zhì)體分布不均勻，容易集中在小滴中央。此外由于液滴與空氣接觸面大，液體容易蒸發(fā)，造成培養(yǎng)基成分濃度的提高。解決蒸發(fā)問題最簡單的辦法就是在液滴上覆蓋礦物油。有些研究工作需要進行單個原生質(zhì)體培養(yǎng)。如選擇出特定的原生質(zhì)體和經(jīng)融合處理后數(shù)量很少的融合體等。已有實驗證實，單個原生質(zhì)體的單獨培養(yǎng)的關(guān)鍵在于培養(yǎng)基原體積要特別小。如油菜單個的原生質(zhì)體須培養(yǎng)在50ml的培養(yǎng)基中，這種比例相當(dāng)于每毫升培養(yǎng)基有2X104個原生質(zhì)體，在這種條件下，原生質(zhì)體的再生細(xì)胞可以持續(xù)分裂直到形成愈傷組織。這樣小體積的微滴，是極易蒸發(fā)的，為此，Koopt設(shè)計了一個特殊的裝置：首先，在一個長度為3350um。并絕對潔凈

19、的蓋玻片上滴50滴2.0molL蔗糖小滴，每滴1ul，分布成10行，每行的距離為3.4um。然后把蓋玻片在硅溶液中浸一下，使得蔗糖小滴占領(lǐng)的圓點外的全部蓋玻片被硅化。硅化的目的是防止以后的礦物油滴相互連通。硅化后，用水小心地把蔗糖液滴洗去，然后使蓋玻片干燥并滅菌。在原來蔗糖液滴占領(lǐng)的圓點區(qū)域加上1um的礦物油滴，再把已懸浮有原生質(zhì)體的培養(yǎng)液用注射器注到礦物油滴中。這樣制備好的蓋玻片放到一個雙環(huán)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿的外環(huán)加滿0.2molL的甘露醇溶液，最后封口。由于有礦物油并且蓋玻片相當(dāng)于保持在一個濕潤的小室中，保證了微小培養(yǎng)基不會蒸發(fā)，從而可以達到單個原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的。2.平板法培養(yǎng)取1ml原生

20、質(zhì)體密度為4×105/ml懸浮液，與等體積已溶解的含有1.4%低熔點（40）瓊脂糖的培養(yǎng)基均勻混合后，置于直徑為6cm培養(yǎng)皿中，此時密度為2×105/ml，待凝固后，將培養(yǎng)皿翻轉(zhuǎn)，置于四周墊有保濕材料的直徑為9cm培養(yǎng)皿內(nèi)3.懸滴法培養(yǎng)將含有一定密度原生質(zhì)的懸浮液，用滴管或定量加液器，滴在培養(yǎng)皿的內(nèi)側(cè)上，一般直徑為6cm培養(yǎng)皿蓋滴67滴，皿底加入培養(yǎng)液或滲透劑等液體以保濕，輕而快的將皿蓋蓋在培養(yǎng)皿上，此時培養(yǎng)小滴懸掛在皿蓋內(nèi)4.雙層培養(yǎng)法為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)想結(jié)合的方法5.飼喂層培養(yǎng)培養(yǎng)方法是將飼喂層的細(xì)胞用培養(yǎng)基制作平板，此平板即“飼喂層”三、培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度保持在252

21、7，光照16h/d左右，凈置為主，但為了不使細(xì)胞集聚，最初幾天需經(jīng)常輕輕搖動，以助通氣四、原生質(zhì)體存活率、密度及產(chǎn)量的測定（一）雙醋酸鹽維生素1.FDA活性染色 20ml原生質(zhì)體的懸浮介質(zhì)中加入10ulFDA母液，混勻后即為FDA活性染色液。2.測定原生質(zhì)體存活率存活率=存活原生質(zhì)體數(shù)/總原生質(zhì)體數(shù)×100%（二）測定原生質(zhì)體的密度原生質(zhì)體的密度（個/ml）=（原生質(zhì)體數(shù)/1區(qū)域）×104×稀釋倍數(shù)（三）原生質(zhì)體產(chǎn)量的測定原生質(zhì)體產(chǎn)量指每克鮮重材料制備所得存活原生質(zhì)體量（個）之值第三節(jié) 原生質(zhì)體融合通過原生質(zhì)體融合可實現(xiàn)體細(xì)胞的雜交，這是70年代興起的一項新技術(shù)。

22、因為應(yīng)用植物的根、莖、葉等營養(yǎng)器官及其愈傷組織或懸浮細(xì)胞的原生質(zhì)體進行融合，所以稱之為體細(xì)胞雜交。體細(xì)胞雜交育種克服了遠緣雜交中某些障礙，如雜交不親和性等，從而更廣泛地組合各種植物的遺傳性狀，為有效地培育新品種，開辟了一條嶄新的途徑。一、原生質(zhì)體的選擇采用即能方便融合、雜種篩選，又能形成穩(wěn)定遺傳重組體，并能再生的原生質(zhì)體親本組合，才能期望獲得有效的研究結(jié)果。二、原生質(zhì)體融合的方法及過程（一）無機鹽誘導(dǎo)融合原生質(zhì)體的融合方式分自發(fā)融合和誘導(dǎo)融合兩類。自發(fā)融合是在植物原生質(zhì)體分離過程中，用酶法分解細(xì)胞壁后進行融合。這類融合是種內(nèi)融合，與胞間連絲有關(guān)，融合的個體一般不能進一步發(fā)育。誘導(dǎo)融合是指制備出

23、原生質(zhì)體后，加入誘導(dǎo)劑或用其他方法促使兩個親本原生質(zhì)體融合，誘導(dǎo)融合可以是種內(nèi)的，也可以是種間的，甚至是屬間、科間的融合。誘導(dǎo)融合的方法大體可以分為物理的和化學(xué)的兩類。前者是利用顯微操作、灌流吸管、離心或振動等機械以促使原生質(zhì)體融合，這種方法目前多與誘導(dǎo)劑結(jié)合起來使用，化學(xué)融合法是用不同的試劑作誘導(dǎo)劑，促使原生質(zhì)體融合。目前常用的比較有效的是高pH值一高鈣法和聚二乙醇法。（二）聚乙二醇與高pH高鈣相結(jié)合的誘導(dǎo)融合聚乙二醇法為我國學(xué)者高國楠首創(chuàng)。聚乙二醇(PEG)分子式為HOCH2 (CH2-O-CH2)nCH2OH，分子量15006000水溶性，pH值4.66.8，因多聚程度而異。由于PEG分

24、子中醚鍵的存在使其分子末端帶有微弱電荷，能與水，蛋白質(zhì)、糖等極性物質(zhì)的正極形成氫鍵。PEG在相鄰原生質(zhì)體表面間作為分子橋，直接或間接地通過鈣而起作用。當(dāng)PEG分子被洗脫時，可能由于電荷紊亂和再分布，或使膜表面局部脫水，或改變構(gòu)型使類脂“液態(tài)”化而引起融合。具體操作過程如下：取等量，密度相近的兩種不同原生質(zhì)體懸浮液，在玻璃容器內(nèi)混合均勻，取150ul左右的原生質(zhì)體懸浮液滴在蓋玻片上。然后緩慢加入450ul左右的PEG溶液，放在2030條件保溫培養(yǎng)0.51h，后用原生質(zhì)體培養(yǎng)液洗凈融合劑。1.PEG誘導(dǎo)劑溶液的配制每100mlPEG融合誘導(dǎo)液中含30-50gPEG，150g CaCl2·

25、2H2O，10mgKH2PO4,3g甘露醇2. 高Ca2+一高pH法高pH一高鈣法是受動物細(xì)胞融合研究的啟發(fā)而產(chǎn)生的。用pH值9.510.5大于0.03M濃度Ca離子處理原生質(zhì)體，融合效果較好。具體處理方法是：在原生質(zhì)體沉淀中加入含有0.05M CaCl2和0.4M甘露醇，pH值調(diào)整到10.5，在37下保溫0.5h，可使原生質(zhì)體融合率達到10左右。高pH值能導(dǎo)致質(zhì)膜表面離子特性的改變，有利于原生質(zhì)體的融合。鈣能穩(wěn)定原生質(zhì)體，也起聯(lián)系融合的作用。3.原生質(zhì)體培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株所用培養(yǎng)基相同。4.融合過程異種原生質(zhì)體先經(jīng)膜融合形成共同的質(zhì)膜，然后經(jīng)胞質(zhì)融合，產(chǎn)生細(xì)胞壁，最后是核融合。細(xì)胞

26、核的融合是異種原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵。融合體只有成為單核細(xì)胞后才能繼續(xù)生長，才能合成DNA、RNA，并進行細(xì)胞分裂，這就要求兩個核必須同步分裂，如果兩個核所處時期不同，一個開始合成DNA， 另一個還處于合成的中途或已完成了復(fù)制，它們之間就會相互影響，導(dǎo)致最終不能進行細(xì)胞分裂。 （三）電融合技術(shù)三、雜種細(xì)胞的篩選與鑒定（一）互補選擇1.白化互補選擇法該法用葉綠素缺失突變體進行提細(xì)胞雜種的篩選2.營養(yǎng)缺陷型互補選擇借助于營養(yǎng)缺陷突變型進行體細(xì)胞雜種的互補選擇3.抗性互補選擇有抗性突變體或抗藥性有差異的材料，就可能用于互補選擇雜種4.代謝互補抑制選擇碘乙酸羅丹明原生質(zhì)體融合代謝互補抑制篩選體系

27、（二）機械分離雜種細(xì)胞法（三）雙熒光標(biāo)記選擇法四、雜種植株的鑒定1.形態(tài)學(xué)鑒定這種傳統(tǒng)的方法，是鑒定雜種的最準(zhǔn)確方法2.細(xì)胞學(xué)觀察染色體數(shù)目、大小與形態(tài)的變化在物種形成與進化中起著重要作用3.DNA內(nèi)切圖譜分析分子生物學(xué)技術(shù)的進展對于分析體細(xì)胞雜種的遺傳構(gòu)成是重大的促進4.同工酶分析由于植物在不同發(fā)育階段，不同組織中，同工酶鐠帶本身可以有較大的差異，因此，進行有關(guān)這方面比較時，取樣部分和時間要求嚴(yán)格一致                                                          &#