多糖多酚復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒操作方法及步驟說明書

1、EASYspin Plus Complex Plant RNA KitEASYspin Plus多糖多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒目錄號：RN53v 適用范圍：適用于快速提取植物組織細胞總RNA，使用獨有基因組DNA清除柱技術(shù)可有效清除電泳可見gDNA殘留，RNA可用于反轉(zhuǎn)錄PCR，熒光定量PCR等。v 試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性：試劑盒組成保存50次(RN5301)裂解液CLB 室溫50 ml裂解液RLT Plus室溫25 ml去蛋白液RW1室溫40 ml漂洗液RW室溫10 ml第一次使用前按說明加指定量乙醇RNase-free H2O室溫10 ml基因組DNA清除柱和收集管室溫50套RN

2、ase-free吸附柱RA和收集管室溫50套本試劑盒在室溫儲存12個月不影響使用效果。儲存事項：1. 不合適的儲存于低溫（4或者20）會造成溶液沉淀，影響使用效果，因此運輸和儲存均在室溫下（1525）進行。2. 避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、PH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時蓋緊蓋子。注意事項1. 所有的離心步驟均可在室溫完成（4離心也可以），使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。2. 需要自備-巰基乙醇，乙醇，研缽(可選)。3. 樣品處理量絕對不要超過基因組清除柱DA和和RNA吸附柱RA處理能力，否則造成DNA殘留或產(chǎn)

3、量降低。開始摸索實驗條件時，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時可使用較少的樣品處理量，將來根據(jù)樣品試驗情況增加或者減少處理量。4. 裂解液CLB和RLT Plus 和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操作時戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。5. 關(guān)于DNA 的微量殘留:一般說來任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做到100%無殘留），本公司的EASYspin Plus RNA提取產(chǎn)品，由于采取了本公司獨特的緩沖體系和基因組DNA清除柱技術(shù)，絕大多數(shù)DNA已經(jīng)被清除，不需要DNase消化，可直接用

4、于反轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR。個別特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行模板和引物的選擇時：1) 選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作為模板參與擴增反應(yīng)。2) 選擇基因組DNA和cDNA上擴增的產(chǎn)物大小不一樣的引物對。3) 將RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理。本試劑盒還可以用于DNase I處理后的RNA清潔(cleanup) ，請聯(lián)系我們索取具體操作說明書。4) 在步驟去蛋白液RW1漂洗前，直接在吸附柱RA上進行DNase I柱上消化處理。購買DNA酶柱上消化試劑盒(貨號：RN

5、34)前可先索取具體操作說明書。v 操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）提示：ð 第一次使用前請先在漂洗液RW瓶加入指定量無水乙醇!ð 取1ml裂解液 CLB至離心管內(nèi)(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5% -巰基乙醇（1ml CLB加50l -巰基乙醇）。顛倒混勻后65°C水浴中預(yù)熱。多個樣品按照比例放大準備。1. 直接研磨法（實驗室無液氮情況下或者柔軟易研磨植物樣品推薦此法）:a. 新鮮植物組織或者冰凍保存樣品稱重后取100-200mg（水分少的樣品如葉片種子等可加100-150mg，水分多的樣品如草莓西瓜

6、果實可多加一些）迅速剪成小塊放入研缽，加入 1ml CLB（已加有-巰基乙醇）室溫下充分研磨成勻漿，注意應(yīng)該迅速研磨讓組織和裂解液CLB立刻充分接觸以抑制RNA酶活性。-巰基乙醇是裂解液CLB的關(guān)鍵成分，必要的時候可以提高終濃度到10-20%。如果特別復(fù)雜植物，可以嘗試在裂解液中加入PVP40至終濃度2%。b. 將裂解物轉(zhuǎn)入離心管，立即劇烈振蕩15秒，短時放回 65°C水浴中（5-10 min），中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。13，000rpm離心10分鐘，沉淀不能裂解的碎片。c. 取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量）轉(zhuǎn)到一個新離心

7、管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。d. 立刻接操作步驟的步驟3。2. 液氮研磨法（適用廣泛，提取復(fù)雜難破碎，易降解樣品時推薦此法）:a. 液氮中研磨新鮮或-70°C冷凍的材料至細粉。b. 轉(zhuǎn)移100-200mg細粉（水分少的樣品如葉片種子等可加100-150mg，水分多的樣品如草莓西瓜果實可多加一些）加至預(yù)熱的裂解液CLB（已加有-巰基乙醇）離心管中。立即劇烈渦旋30-60秒或者用吸頭吹打混勻裂解直得到滿意勻漿結(jié)果(或者電動勻漿30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度

8、和提高產(chǎn)量。c. 短時放回 65°C水浴中（5-10 min），中間偶爾顛倒1-2次幫助裂解。d. 將裂解物13,000 rpm離心10分鐘，沉淀不能裂解的碎片。e. 取裂解物上清（在不超過基因組DNA清除柱能力的情況下可以取更多的上清，這樣可以提高產(chǎn)量）轉(zhuǎn)到一個新離心管。加入上清體積一半的無水乙醇(0.5體積)，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。若上清表面有漂浮物，用吸頭挑開吸取下面液體即可。f. 立刻接操作步驟的步驟3。3. 將混合物(每次小于720l，多可以分兩次加入)加入一個基因組清除柱中，（清除柱放入收集管中）13,000 r

9、pm離心2分鐘，棄掉廢液。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。4. 將基因組DNA清除柱子放在一個干凈2ml離心管內(nèi)（不用RNAse free 或者DEPC處理，一般干凈的新離心管即可。也可使用RNA吸附柱配套的新的干凈收集管），在基因組清除柱內(nèi)加500l裂解液RLT Plus，13,000 rpm離心30秒， 收集濾液（RNA在濾液中），用微量移液器較精確估計濾過液體積（通常為450-500l左右，濾過時候損失體積應(yīng)該減去），加入0.5倍體積的無水乙醇，此時可能出現(xiàn)沉淀，但是不影響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。5. 立刻將混合物(每次小于720l，

10、多可以分兩次加入)加入一個吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心2分鐘，棄掉廢液。確保離心后液體全部濾過去，膜上沒有殘留，如有必要，可以加大離心力和離心時間。6. 加700l 去蛋白液RW1，室溫放置1分鐘，13,000rpm 離心30秒，棄掉廢液。7. 加入500l漂洗液RW（請先檢查是否已加入無水乙醇!），13,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。加入500l漂洗液RW，重復(fù)一遍。8. 將吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。9. 取出吸附柱RA，放入一個RNase free離心管中，根據(jù)預(yù)期R

11、NA產(chǎn)量在吸附膜的中間部位加30-50l RNase free water（事先在 70-90水浴中加熱可提高產(chǎn)量）， 室溫放置1分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。10. 如果預(yù)期RNA產(chǎn)量>30g，加30-50l RNase free water重復(fù)步驟9，合并兩次洗液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重復(fù)步驟一遍(如果需要RNA濃度高)。洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高,分兩次洗脫合并洗脫液的RNA產(chǎn)量比前者高1530%,但是濃度要低,用戶根據(jù)需要選擇。附錄1：DNA酶柱上消化（詳細請參考RN34 DNase I 柱上消化試劑盒說明書)1. 按照前面所列RN53試劑盒操作步驟操作

12、，直到做完操作步驟5。2. 取45l DNase I buffer和5l RNase free DNase I在離心管輕輕吹打混勻成工作液（處理多個離心柱子要按照比例放大制備工作液）。3. 向吸附柱RA 中加入350l去蛋白液RW1，12,000 rpm 離心30 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。4. 向吸附柱RA 中央加入50l的DNase I 工作液，室溫（20-30）放置15 分鐘。注意直接將工作液滴在膜中央上向膜四周浸潤充分和膜接觸，不要讓工作液滴在O型墊圈或是離心柱管壁上掛壁或者掛在墊圈上不能充分和膜接觸。5. 向吸附柱RA 中加入350l去蛋白液RW1， 12,000 rpm 離

13、心30-60 秒，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。6. 接操作步驟7完成后續(xù)步驟。附錄2：RNA含量少樣品或者RNA復(fù)雜產(chǎn)量低的解決方案 可以提高樣品處理量到300-500mg/2ml裂解液CLB，上清過兩根基因組DNA清除柱子，洗脫下來的RNA，可以兩個合并到一根RNA吸附柱上，可以大大提高RNA濃度。附錄3：使用EASYspin/EASYspin Plus植物RNA提取系列試劑盒發(fā)表文章100多篇：1. 桃果實、花、根、葉：Isolation, characterisation and phylogenetic analysis of resistance gene  &

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