病理學(xué)方法學(xué)2013年研究生

1、激光共聚焦顯微鏡技術(shù)激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(Confocal laser scanning microscope, CLSM)激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理激光掃描共聚焦顯微鏡成像原理 激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡和光束整形激光器發(fā)出的激光束經(jīng)過(guò)擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長(zhǎng)通分色反鏡，變成一束直徑較大的平行光束，長(zhǎng)通分色反射鏡使光束偏轉(zhuǎn)射鏡使光束偏轉(zhuǎn)9090度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦度，經(jīng)過(guò)物鏡會(huì)聚在物鏡的焦點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿點(diǎn)上，樣品中的熒光物質(zhì)在激光的激發(fā)下發(fā)射沿各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、長(zhǎng)通分各個(gè)方向的熒光，一部分熒光經(jīng)過(guò)物鏡、長(zhǎng)通

2、分色反射鏡、聚焦透鏡、會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，色反射鏡、聚焦透鏡、會(huì)聚在聚焦物鏡的焦點(diǎn)處，再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器接收。再通過(guò)焦點(diǎn)處的針孔，由檢測(cè)器接收。標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片厚度為標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片厚度為0.17mm載玻片厚度是載玻片厚度是1.1mm載物臺(tái)與物鏡之間的工作距離有限載物臺(tái)與物鏡之間的工作距離有限清晰度高清晰度高物鏡最大放大倍數(shù)物鏡最大放大倍數(shù)150X主要用于切片的觀察主要用于切片的觀察正置激光共聚焦顯微鏡正置激光共聚焦顯微鏡物鏡、聚光鏡、光源的位置顛倒物鏡、聚光鏡、光源的位置顛倒長(zhǎng)工作距離物鏡和聚光鏡長(zhǎng)工作距離物鏡和聚光鏡透射光源和載物臺(tái)之間空間更寬敞透射光源和載物臺(tái)之間空間更寬敞清晰度略低于

3、正置清晰度略低于正置物鏡最大放大率為物鏡最大放大率為60X多用于無(wú)色透明的活體觀察，如組多用于無(wú)色透明的活體觀察，如組織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、織培養(yǎng)、細(xì)胞離體培養(yǎng)、浮游生物、環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)環(huán)境保護(hù)、食品檢驗(yàn)倒置激光共聚焦顯微鏡倒置激光共聚焦顯微鏡工作原理工作原理計(jì)算機(jī)系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)激光照射系統(tǒng)激光照射系統(tǒng)顯微鏡系統(tǒng)顯微鏡系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)X-Y平臺(tái)系統(tǒng)平臺(tái)系統(tǒng)Z-軸步進(jìn)馬達(dá)軸步進(jìn)馬達(dá)激光共聚焦顯微鏡發(fā)展史激光共聚焦顯微鏡發(fā)展史早在早在1957年就已提出，年就已提出，二十年后由二十年后由Brandengoff在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具有高清晰度在高數(shù)值孔徑透鏡裝置上改裝成功具

4、有高清晰度的共聚焦顯微鏡，的共聚焦顯微鏡，1985年年Wijnaendts Van Resandt發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微發(fā)表了第一篇有關(guān)激光掃描共聚焦顯微鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，鏡在生物學(xué)中應(yīng)用的文章，1. 1987年，發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。年，發(fā)展成現(xiàn)在通常意義上的第一代激光掃描共聚焦顯微鏡。由于由于pinhole的存在，使得部分雜散光（虛線部分）沒(méi)有被的存在，使得部分雜散光（虛線部分）沒(méi)有被PMT探測(cè)器探測(cè)到，從探測(cè)器探測(cè)到，從而提高了成像效果。而提高了成像效果。通過(guò)對(duì)樣品在通過(guò)對(duì)樣品在X-Y方向上的逐點(diǎn)掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)節(jié)焦平面在方向上

5、的逐點(diǎn)掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)節(jié)焦平面在Z線的線的位置，連續(xù)掃描多個(gè)不同位置，連續(xù)掃描多個(gè)不同Z位置的二維圖像，則可以形成一個(gè)位置的二維圖像，則可以形成一個(gè)3D圖像，圖像，3D的重建需的重建需要軟件的支持。要軟件的支持。普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別 傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡采用點(diǎn)光源照射樣本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓分明的微鏡采用點(diǎn)光源照射樣本，在焦平面上形成一個(gè)輪

6、廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測(cè)針孔。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面明針孔和探測(cè)針孔。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，是共軛的，焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)被擋在探測(cè)針孔之外不能成像，這樣得到的焦平面以外的點(diǎn)被擋在

7、探測(cè)針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)切面，避免了非焦平面上雜散光線共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)切面，避免了非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)，因此能得到整的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)，因此能得到整個(gè)焦平面上清晰的共聚焦圖像。個(gè)焦平面上清晰的共聚焦圖像。 激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別激光共聚焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像2.具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片3.增加側(cè)向分辨率4.由于點(diǎn)對(duì)點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡

8、的區(qū)別普通熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區(qū)別普通的熒光顯微鏡普通的熒光顯微鏡激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡*激光共聚焦顯微鏡的性能特點(diǎn)激光共聚焦顯微鏡的性能特點(diǎn)1.分辨率高分辨率高 最小觀察厚度是最小觀察厚度是0.5m， 分辨率是普通光學(xué)顯微鏡的分辨率是普通光學(xué)顯微鏡的1.4倍倍2. 靈敏度高靈敏度高 利用利用PMT檢測(cè)熒光檢測(cè)熒光3. 掃描速度快掃描速度快 毫秒級(jí)和微妙級(jí)毫秒級(jí)和微妙級(jí)4. 掃描范圍大掃描范圍大 最大可達(dá)最大可達(dá)2cmX2cm5. 圖像存取方便圖像存取方便6. 可進(jìn)行光切片的觀察可進(jìn)行光切片的觀察 三維圖像分析三維圖像分析7. 可進(jìn)行熒光定量分析可進(jìn)行熒光定量分析激光共聚焦

9、顯微鏡的應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡的應(yīng)用 定量熒光測(cè)量定量熒光測(cè)量 進(jìn)行重復(fù)性極佳的低光探測(cè)及活細(xì)胞熒光定量分析。進(jìn)行重復(fù)性極佳的低光探測(cè)及活細(xì)胞熒光定量分析。 單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體，線粒體、單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體，線粒體、DNA、RNA和受體分子含量、和受體分子含量、成份及分布進(jìn)行定性及定量測(cè)定，還可測(cè)定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反成份及分布進(jìn)行定性及定量測(cè)定，還可測(cè)定諸如膜電位和配體結(jié)合等生化反應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測(cè)定，這種定量可以準(zhǔn)確應(yīng)程度。此外，還適用于高靈敏度快速的免疫熒光測(cè)定，這種定量可以準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān)

10、監(jiān)測(cè)抗原表達(dá)，細(xì)胞結(jié)合和殺傷及定量的形態(tài)學(xué)特性，以揭示諸如腫瘤相關(guān)抗原表達(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息?？乖磉_(dá)的準(zhǔn)確定位及定量信息。1. 定量共聚焦圖像分析定量共聚焦圖像分析借助于激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度借助于激光共焦系統(tǒng)，可以獲得生物樣品高反差、高分辨率、高靈敏度的二維圖像?？傻玫酵暾畹幕蚬潭ǖ募?xì)胞及組織的系列及光切片，從而得的二維圖像。可得到完整活的或固定的細(xì)胞及組織的系列及光切片，從而得到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。能測(cè)定細(xì)胞到各層面的信息，三維重建后可以揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系。能測(cè)定細(xì)胞光學(xué)切片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如光學(xué)切

11、片的物理、生物化學(xué)特性的變化，如DNA含量、含量、RNA含量、分子擴(kuò)散、含量、分子擴(kuò)散、胞內(nèi)離子等，亦可以對(duì)這些動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)及定位分胞內(nèi)離子等，亦可以對(duì)這些動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量、定時(shí)及定位分析。析。3. 三維重組分析生物結(jié)構(gòu)三維重組分析生物結(jié)構(gòu)組合成一個(gè)真實(shí)的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借組合成一個(gè)真實(shí)的三維圖像，并可從任意角度觀察，也可以借助改變照明角度來(lái)突出其特征，產(chǎn)生更生動(dòng)逼真的三維效果。助改變照明角度來(lái)突出其特征，產(chǎn)生更生動(dòng)逼真的三維效果。4. 動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定動(dòng)態(tài)熒光測(cè)定Ca2+ 、pH 及其它細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)定，能迅速對(duì)樣品的點(diǎn)，線及其它細(xì)胞內(nèi)離子測(cè)定

12、，能迅速對(duì)樣品的點(diǎn)，線或二維圖像掃描，測(cè)量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，或二維圖像掃描，測(cè)量單次、多次單色、雙發(fā)射和三發(fā)射光比率，使用諸如使用諸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多種熒光探針對(duì)各種離子作等多種熒光探針對(duì)各種離子作定量分析。可以直接得到大分子的擴(kuò)散速率，能定量測(cè)定細(xì)胞溶液定量分析?？梢灾苯拥玫酱蠓肿拥臄U(kuò)散速率，能定量測(cè)定細(xì)胞溶液中中Ca2+對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、生長(zhǎng)因子及各種激素等刺激的反應(yīng)，以對(duì)腫瘤啟動(dòng)因子、生長(zhǎng)因子及各種激素等刺激的反應(yīng)，以及使用雙熒光探針及使用雙熒光探針Fluo-3和和CNARF進(jìn)行進(jìn)行Ca2+和和pH的同時(shí)測(cè)定。的同時(shí)測(cè)定。5. 熒光光漂白恢復(fù)

13、（熒光光漂白恢復(fù)（FRAP）-活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞某一區(qū)域，熒光光漂白恢復(fù)技術(shù)借助高強(qiáng)度脈沖式激光照射細(xì)胞某一區(qū)域，從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅，該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子將以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，可通過(guò)低強(qiáng)度激光掃描探測(cè)此擴(kuò)散速率。以一定速率向受照區(qū)域擴(kuò)散，可通過(guò)低強(qiáng)度激光掃描探測(cè)此擴(kuò)散速率。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可直接測(cè)量分子擴(kuò)散率、恢復(fù)速度，并由此而通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可直接測(cè)量分子擴(kuò)散率、恢復(fù)速度，并由此而揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相關(guān)的機(jī)制。揭示細(xì)胞結(jié)構(gòu)及相關(guān)的機(jī)制。6.

14、胞間通訊研究胞間通訊研究動(dòng)物細(xì)胞中由縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊被認(rèn)為在細(xì)胞增殖和分化動(dòng)物細(xì)胞中由縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊被認(rèn)為在細(xì)胞增殖和分化中起非常重要的作用。中起非常重要的作用。ACAS可用于測(cè)定相鄰植物和動(dòng)物細(xì)胞之間細(xì)可用于測(cè)定相鄰植物和動(dòng)物細(xì)胞之間細(xì)胞間通訊，測(cè)量由細(xì)胞縫隙連接介導(dǎo)的分子轉(zhuǎn)移，研究腫瘤啟動(dòng)因子胞間通訊，測(cè)量由細(xì)胞縫隙連接介導(dǎo)的分子轉(zhuǎn)移，研究腫瘤啟動(dòng)因子和生長(zhǎng)因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用，以及胞內(nèi)和生長(zhǎng)因子對(duì)縫隙連接介導(dǎo)的胞間通訊的抑制作用，以及胞內(nèi)Ca2+ ,PH和和cAMP水平對(duì)縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。水平對(duì)縫隙連接的調(diào)節(jié)作用。7. 細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定A

15、CAS設(shè)計(jì)了專用的軟件用于對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行定量和定性分析。熒光膜探針設(shè)計(jì)了專用的軟件用于對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性進(jìn)行定量和定性分析。熒光膜探針受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運(yùn)動(dòng)自由受到極化光線激發(fā)后，其發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉(zhuǎn)，而這種有序的運(yùn)動(dòng)自由度依賴于熒光分子周圍的膜流動(dòng)性，因此極性測(cè)量間接反映細(xì)胞膜流動(dòng)性。這種膜流度依賴于熒光分子周圍的膜流動(dòng)性，因此極性測(cè)量間接反映細(xì)胞膜流動(dòng)性。這種膜流動(dòng)性測(cè)定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應(yīng)和作用位點(diǎn)，溫度反應(yīng)測(cè)定和物種比較等動(dòng)性測(cè)定在膜的磷脂酸組成分析、藥物效應(yīng)和作用位點(diǎn)，溫度反應(yīng)測(cè)定和物種比較等方面有重要作用。方面有

16、重要作用。8. 籠鎖籠鎖解籠鎖測(cè)定解籠鎖測(cè)定許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時(shí)，其功能被封閉，而許多重要的生活物質(zhì)都有其籠鎖化合物，在處于籠鎖狀態(tài)時(shí)，其功能被封閉，而一旦被特異波長(zhǎng)的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復(fù)原有活性和功能，在細(xì)胞一旦被特異波長(zhǎng)的瞬間光照射后，光活化解籠鎖，使其恢復(fù)原有活性和功能，在細(xì)胞的增值、分化等生物代謝過(guò)程中發(fā)揮功能。利用的增值、分化等生物代謝過(guò)程中發(fā)揮功能。利用ACAS可以人為控制這種瞬間光的照可以人為控制這種瞬間光的照射波長(zhǎng)和時(shí)間，從而達(dá)到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其它化合物在生物代謝中發(fā)揮射波長(zhǎng)和時(shí)間，從而達(dá)到人為控制多種生物活性產(chǎn)物和其

17、它化合物在生物代謝中發(fā)揮功能的時(shí)間和空間作用。功能的時(shí)間和空間作用。9. 粘附細(xì)胞分選粘附細(xì)胞分選ACAS是目前唯一能對(duì)粘附細(xì)胞進(jìn)行分離篩選的分析細(xì)胞學(xué)是目前唯一能對(duì)粘附細(xì)胞進(jìn)行分離篩選的分析細(xì)胞學(xué)儀器，它對(duì)培養(yǎng)皿底的粘附細(xì)胞有兩種分選方法：儀器，它對(duì)培養(yǎng)皿底的粘附細(xì)胞有兩種分選方法：（1）Coolie-CutterTM法，它是法，它是Meidian公司專利技術(shù)，首先將公司專利技術(shù)，首先將細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，然后用高能量激光的欲選細(xì)胞四細(xì)胞貼壁培養(yǎng)在特制培養(yǎng)皿上，然后用高能量激光的欲選細(xì)胞四周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細(xì)胞則因在八角形之外而被周切割成八角形幾何形狀，而非選擇細(xì)胞則因

18、在八角形之外而被去除，該分選方式特別適用于選擇數(shù)量較少諸如突變細(xì)胞、轉(zhuǎn)移去除，該分選方式特別適用于選擇數(shù)量較少諸如突變細(xì)胞、轉(zhuǎn)移細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，即使百萬(wàn)分之一機(jī)率的也非常理想。細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞，即使百萬(wàn)分之一機(jī)率的也非常理想。（2）激光消除法，該方法亦基于細(xì)胞形態(tài)及熒光特性，用高能量）激光消除法，該方法亦基于細(xì)胞形態(tài)及熒光特性，用高能量激光自動(dòng)殺滅不需要的細(xì)胞，留下完整活細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，此激光自動(dòng)殺滅不需要的細(xì)胞，留下完整活細(xì)胞亞群繼續(xù)培養(yǎng)，此方法特別適于對(duì)數(shù)量較多細(xì)胞的選擇。方法特別適于對(duì)數(shù)量較多細(xì)胞的選擇。VWFCD31CD31 VWFVWF expressed in big vess

19、el.CD31 expressed in endothelial cell of capillary and big vessel.VWFCD34VWF CD34WKY 40X2SHR-SP 40X2GFAP and lectin double stainingGFAP lectinGFAP lectinGFAP lectinpAs we know, astrocytes composed the BBB.pAfter stroke, number of it becomes more and processes of it connected with BBB more closely th

20、an before.GFAPAstrocyte lectinVessleNG2 and lectin in double staining 3D3D3DNG2 lectin TOTO3A Mouse ModelRed, CD45; Green, Desmin and Blue, DAPI 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀 （Flow Cytometry,FCM)原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用1 1、流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer):是集光電子物理，光電測(cè)量，計(jì)算機(jī)，是集光電子物理，光電測(cè)量，計(jì)算機(jī)，細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。細(xì)胞熒光化學(xué)，單抗技術(shù)為一體的高科技細(xì)胞分析儀。2

21、、流式細(xì)胞術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry):利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)的細(xì)利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速（每秒可達(dá)1000-10000個(gè)）的定量分個(gè)）的定量分析和分選（純度可達(dá)析和分選（純度可達(dá)99%以上）的技術(shù)。以上）的技術(shù)。3.流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對(duì)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)）是一種可以對(duì)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測(cè)量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點(diǎn)是：進(jìn)行快速測(cè)量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點(diǎn)是：測(cè)量速度快，測(cè)量速度快，最快可在最快可在1秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；秒

22、種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；意義；是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；既既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。基本概念基本概念流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史 1.1934年，年，Moldavan首次提出了使懸

23、浮的單個(gè)血紅細(xì)胞等流過(guò)玻璃毛細(xì)管，首次提出了使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞等流過(guò)玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。2.1953年年Crosland Taylor根據(jù)雷諾對(duì)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律的研究認(rèn)根據(jù)雷諾對(duì)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律的研究認(rèn)識(shí)到：管中軸線流過(guò)的鞘液流速越快，載物通過(guò)的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流體識(shí)到：管中軸線流過(guò)的鞘液流速越快，載物通過(guò)的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流體動(dòng)力聚集作用。于是設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸動(dòng)力聚集作用。于是設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過(guò)，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在

24、作層液。這就奠定了現(xiàn)代線附近流過(guò)，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。 3.1956年，年，Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過(guò)一個(gè)小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過(guò)一個(gè)小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會(huì)影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號(hào)，測(cè)量電脈沖電性上的差異，便會(huì)影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號(hào)，測(cè)量電脈沖的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和

25、數(shù)目方面的信息。的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。4.1967年年Holm等設(shè)計(jì)了通過(guò)汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測(cè)設(shè)備等設(shè)計(jì)了通過(guò)汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測(cè)設(shè)備計(jì)數(shù)的裝置。計(jì)數(shù)的裝置。5.1973年年Steinkamp設(shè)計(jì)了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能設(shè)計(jì)了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計(jì)數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代分析計(jì)數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計(jì)數(shù)技術(shù)的主計(jì)數(shù)技術(shù)的主要?dú)v程。要?dú)v程。流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu) 激光光源及光束形成系統(tǒng)激光光源及光束形成系統(tǒng) 流動(dòng)室及液

26、流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng) 光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源，光學(xué)系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。收集不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào)。 信號(hào)檢測(cè)與分析：光電倍增管（信號(hào)檢測(cè)與分析：光電倍增管（PMT）、補(bǔ)償）、補(bǔ)償 電路。熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并將信號(hào)放電路。熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，并將信號(hào)放 大。大。 存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)。存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng)：計(jì)算機(jī)。 細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)EPICS XL 流式細(xì)胞分析儀流式細(xì)胞分析儀* * *工作原理工作原理 在一定的壓力下，鞘液帶著細(xì)胞或是微粒通過(guò)噴嘴中心在一定的壓力下，鞘液帶著細(xì)胞或是微粒通過(guò)噴嘴中心進(jìn)入到流式照

27、射室，在流式照射室的分析點(diǎn)，激光照射到進(jìn)入到流式照射室，在流式照射室的分析點(diǎn)，激光照射到細(xì)胞發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光；同時(shí)，細(xì)胞所攜帶細(xì)胞發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光；同時(shí)，細(xì)胞所攜帶的熒光素被激光激發(fā)并發(fā)射出熒光。前向散射光（的熒光素被激光激發(fā)并發(fā)射出熒光。前向散射光（FSC)FSC)和和側(cè)向散射光（側(cè)向散射光（SSC)SSC)檢測(cè)器把散射光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，熒光則檢測(cè)器把散射光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，熒光則被激光器收集，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的被激光器收集，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的光電倍增器，把熒光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。散射光信號(hào)和熒光信光電倍增器，把熒光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)。散射光信號(hào)和熒

28、光信號(hào)經(jīng)過(guò)放大后，再經(jīng)數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲(chǔ)存，根據(jù)細(xì)號(hào)經(jīng)過(guò)放大后，再經(jīng)數(shù)據(jù)化處理輸入電腦并儲(chǔ)存，根據(jù)細(xì)胞的散射光和熒光進(jìn)行分析或分選。胞的散射光和熒光進(jìn)行分析或分選。Flow CellInjector TipSheath fluid 液體在高壓下形成一個(gè)圓柱形的液流，樣品從液流的中心流入，液體就像一個(gè)鞘液體在高壓下形成一個(gè)圓柱形的液流，樣品從液流的中心流入，液體就像一個(gè)鞘一樣包在樣品的外面。流動(dòng)的鞘液和流動(dòng)的細(xì)胞在噴嘴處匯合，并且在噴嘴處被加一樣包在樣品的外面。流動(dòng)的鞘液和流動(dòng)的細(xì)胞在噴嘴處匯合，并且在噴嘴處被加速，使細(xì)胞精確列隊(duì)依次通過(guò)激光束。在噴嘴處細(xì)胞進(jìn)入鞘液并且一直保持在中心速，使細(xì)

29、胞精確列隊(duì)依次通過(guò)激光束。在噴嘴處細(xì)胞進(jìn)入鞘液并且一直保持在中心位置，這個(gè)技術(shù)被稱為流體動(dòng)力聚焦。流體動(dòng)力聚焦使細(xì)胞限制并保持在液流的中位置，這個(gè)技術(shù)被稱為流體動(dòng)力聚焦。流體動(dòng)力聚焦使細(xì)胞限制并保持在液流的中心。樣品在液流中心的流動(dòng)稱之為軸流。心。樣品在液流中心的流動(dòng)稱之為軸流。Forward Angle Light Scatter前向散射光（前向散射光（FSC)FALS SensorLaser透鏡安裝在分析點(diǎn)周圍，用于收集細(xì)胞被照射時(shí)出現(xiàn)的光信號(hào)，信號(hào)傳透鏡安裝在分析點(diǎn)周圍，用于收集細(xì)胞被照射時(shí)出現(xiàn)的光信號(hào)，信號(hào)傳想光電二極管或光電倍增器，光電管再把接收的信號(hào)轉(zhuǎn)換成電脈沖，電想光電二極管或光

30、電倍增器，光電管再把接收的信號(hào)轉(zhuǎn)換成電脈沖，電脈沖的強(qiáng)度與光強(qiáng)度成正比。脈沖的強(qiáng)度與光強(qiáng)度成正比。FSC反映細(xì)胞的大小與體積反映細(xì)胞的大小與體積。前向散射角傳感器 90 Degree Light Scatter（side scatter,SSC)直角光散射（側(cè)向散射光）直角光散射（側(cè)向散射光）FALS Sensor90LS SensorLaser 在照射點(diǎn)的側(cè)向（在照射點(diǎn)的側(cè)向（90度）有一個(gè)光電二極管接收細(xì)胞散射的光信號(hào)，細(xì)胞表面度）有一個(gè)光電二極管接收細(xì)胞散射的光信號(hào)，細(xì)胞表面越粗糙、越不規(guī)則或內(nèi)部的顆粒越多，散射到側(cè)向的光信號(hào)越大。越粗糙、越不規(guī)則或內(nèi)部的顆粒越多，散射到側(cè)向的光信號(hào)越大

31、。SSC的強(qiáng)度與細(xì)的強(qiáng)度與細(xì)胞的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其大小和形狀有關(guān)，也成為粒度信號(hào)或直角光散射信號(hào)。胞的表面結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其大小和形狀有關(guān)，也成為粒度信號(hào)或直角光散射信號(hào)。側(cè)向散射角傳感器側(cè)向散射角傳感器LaserFluorescence Detectors（熒光檢測(cè)器）（熒光檢測(cè)器）FreqFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.) 光電倍增管（光電倍增管（PMT)可以用來(lái)檢測(cè)從細(xì)胞發(fā)出的不同顏色的熒光信號(hào)?？梢杂脕?lái)檢測(cè)從細(xì)胞發(fā)出的不同顏色的熒光信號(hào)。細(xì)胞熒光包括自身的熒光和熒光素發(fā)出的不同顏色的熒光信號(hào)。細(xì)

32、胞熒光包括自身的熒光和熒光素發(fā)出的不同顏色的熒光信號(hào)。PMT只接只接收一定波長(zhǎng)的熒光，為了收一定波長(zhǎng)的熒光，為了PMT只檢測(cè)一個(gè)波長(zhǎng)的光，一般在只檢測(cè)一個(gè)波長(zhǎng)的光，一般在PMT之前安裝之前安裝雙色反光鏡和不同顏色的濾光片。雙色反光鏡和不同顏色的濾光片。Standard Band Pass Filter（帶通濾波器）（帶通濾波器）Transmitted LightWhite Light Source630 nm BandPass Filter620 -640 nm LightDichroic Filter/Mirror at 45 deg（雙色反光鏡）直角形信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)（雙色反光鏡）直角形信號(hào)檢

33、測(cè)系統(tǒng)Reflected lightTransmitted LightLight Source雙色反光鏡是通過(guò)反射一定波長(zhǎng)范圍的光，透過(guò)其余光來(lái)實(shí)現(xiàn)分離作用的。雙色反光鏡是通過(guò)反射一定波長(zhǎng)范圍的光，透過(guò)其余光來(lái)實(shí)現(xiàn)分離作用的。短通反光鏡短通反光鏡-605nm短通反光鏡（短通反光鏡（605DSP)允許短于允許短于605nm的光透過(guò)，長(zhǎng)于的被反射。的光透過(guò)，長(zhǎng)于的被反射。長(zhǎng)通反光鏡長(zhǎng)通反光鏡- 605nm長(zhǎng)通反光鏡（長(zhǎng)通反光鏡（605DLP)允許長(zhǎng)于允許長(zhǎng)于605nm的光透過(guò)，短于的被反射的光透過(guò)，短于的被反射 流式細(xì)胞術(shù)常用熒光素流式細(xì)胞術(shù)常用熒光素 流式細(xì)胞儀測(cè)定常用的熒光染料有多種流式細(xì)胞儀

34、測(cè)定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)他們分子結(jié)構(gòu)不同，激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備光譜和發(fā)射光譜也各異，選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(zhǎng)（如氬離子氣體激光管的激光光源的發(fā)射光波長(zhǎng)（如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波它的發(fā)射光波488nm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長(zhǎng)氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長(zhǎng)633nm）。）。488nm激光光源常用的熒激光光源常用的熒光染料有光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、（藻紅蛋白）、PI（碘化丙（碘化丙啶）、啶）、CY5（化青素）、（化青素）、preCP(葉

35、綠素蛋白葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白藻紅蛋白-得克薩得克薩斯紅斯紅)等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別是：等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別是： 激發(fā)光波長(zhǎng)（激發(fā)光波長(zhǎng)（ nm） 發(fā)射光峰值（發(fā)射光峰值（ nm） FITC 488 525（綠）（綠） PE 488 575（橙紅）（橙紅） PI 488 630（橙紅）（橙紅） ECD 488 610（紅）（紅） CY5 488 675（深紅）（深紅） PreCP 488 675（深紅）（深紅）FL3(PE-TX Red)FL5(PE-Cy7)FL2(PE)FL1(FITC)SSCFL4(PE-Cy5)630/30488/10670/30740LP

36、530/40580/30通道通道1熒光和熒光和SSC650DSP718DSP605DSP555DLP505DSP直角形信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)直角形信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)示意圖示意圖510550nm帶通濾光片帶通濾光片565595nm長(zhǎng)通濾光片長(zhǎng)通濾光片740nm665685nm605650nm 525 575FCM的主要測(cè)定指標(biāo)的主要測(cè)定指標(biāo) FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4)其中：其中：FSC：反映細(xì)胞的大?。悍从臣?xì)胞的大小SSC：反映細(xì)胞內(nèi)顆粒性：反映細(xì)胞內(nèi)顆粒性外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖FCM標(biāo)記方法標(biāo)記方法單標(biāo)：?jiǎn)螛?biāo)：一種單抗一種單抗/tube: FL

37、1, FSC, SSC（三參數(shù)）（三參數(shù)）雙標(biāo)：雙標(biāo)：（兩種單抗（兩種單抗/tube）：）：FL1, FL2, FSC, SSC（四（四參數(shù)）參數(shù)）三三/四標(biāo)：四標(biāo)：（三種單抗（三種單抗/tube）（四種單抗）（四種單抗/tube）：）：FL1-FL3/4, FSC, SSCq PE最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原q FITC最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，適用范圍廣最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原，適用范圍廣q biotin-avidin不適合弱抗原的檢測(cè)不適合弱抗原的檢測(cè)抗體的選擇抗體的選擇 散點(diǎn)圖 密度圖二維等高圖直方圖圖圖 報(bào)告中常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖報(bào)告中常見(jiàn)的幾種流式細(xì)胞圖Dot pl

38、ot細(xì)胞分選細(xì)胞分選1. 1. 液滴形成液滴形成液滴沿著一個(gè)軸振動(dòng)，液流會(huì)斷開(kāi)形成液滴液滴沿著一個(gè)軸振動(dòng)，液流會(huì)斷開(kāi)形成液滴2. 2. 延遲時(shí)間延遲時(shí)間 當(dāng)細(xì)胞從振動(dòng)的噴嘴流出到分析點(diǎn)時(shí)被激光照射，同時(shí)被檢當(dāng)細(xì)胞從振動(dòng)的噴嘴流出到分析點(diǎn)時(shí)被激光照射，同時(shí)被檢測(cè)器檢測(cè)。在分析點(diǎn)下方，液流流出一定的距離才開(kāi)始斷開(kāi)形成單個(gè)的液滴，測(cè)器檢測(cè)。在分析點(diǎn)下方，液流流出一定的距離才開(kāi)始斷開(kāi)形成單個(gè)的液滴，細(xì)胞包含在某些液滴的內(nèi)部。流式細(xì)胞儀在液滴的斷點(diǎn)對(duì)含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴細(xì)胞包含在某些液滴的內(nèi)部。流式細(xì)胞儀在液滴的斷點(diǎn)對(duì)含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴充電。分析點(diǎn)和充電點(diǎn)不在同一時(shí)間，存在時(shí)間差，這就是延遲時(shí)間。充電。分

39、析點(diǎn)和充電點(diǎn)不在同一時(shí)間，存在時(shí)間差，這就是延遲時(shí)間。流式分選的重要技巧是只給含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴進(jìn)行充電。流式分選的重要技巧是只給含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴進(jìn)行充電。3. 3. 液滴充電和偏轉(zhuǎn)液滴充電和偏轉(zhuǎn)在液滴的斷點(diǎn)處，對(duì)含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴進(jìn)行充電，使其帶上正或負(fù)電荷，在在液滴的斷點(diǎn)處，對(duì)含有目標(biāo)細(xì)胞的液滴進(jìn)行充電，使其帶上正或負(fù)電荷，在液流的兩側(cè)放置偏轉(zhuǎn)電極板，不同正負(fù)電荷的液滴分別偏向兩側(cè)，最后落到收液流的兩側(cè)放置偏轉(zhuǎn)電極板，不同正負(fù)電荷的液滴分別偏向兩側(cè)，最后落到收集容器中?，F(xiàn)在可以四路的分選。集容器中。現(xiàn)在可以四路的分選。4.4.液滴的收集液滴的收集488 nm laser+-Fluores

40、cence Activated Cell Sorting(細(xì)胞分選）細(xì)胞分選）Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector+85v+190v- 85v- 190v廢廢 液液流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用 分析群體細(xì)胞分析群體細(xì)胞 所需時(shí)間短所需時(shí)間短 多參數(shù)分析多參數(shù)分析 定性或定量定性或定量流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍流式應(yīng)用常見(jiàn)范圍 細(xì)胞大小細(xì)胞大小 細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞的顆粒度 細(xì)胞表面分子：細(xì)胞表面分子：CD 系列系列 細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子 細(xì)胞

41、核內(nèi)分子：細(xì)胞核內(nèi)分子：P53 細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備流式細(xì)胞儀標(biāo)本的制備一、新鮮實(shí)體瘤單細(xì)胞懸液的制備一、新鮮實(shí)體瘤單細(xì)胞懸液的制備（一）酶消化法（一）酶消化法（二）機(jī)械法：（二）機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法（三）化學(xué)法：（三）化學(xué)法：作用原理除去細(xì)胞之間起到粘連的鎂離子和作用原理除去細(xì)胞之間起到粘連的鎂離子和鈣離子，而使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)一般用鈣離子，而使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)一般用EDTA胰酶消化液。胰酶消化液。（四）低滲法（四）低滲法利用低滲的原理使細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核逸出稱為分散的單細(xì)利用低滲的原理使細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞核逸出稱

42、為分散的單細(xì)胞核的懸液。該法適用于由新鮮的實(shí)體瘤組織直接脫核做核胞核的懸液。該法適用于由新鮮的實(shí)體瘤組織直接脫核做核酸染色、酸染色、DNA倍體和細(xì)胞周期分析。避免脫核時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而并倍體和細(xì)胞周期分析。避免脫核時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而并沒(méi)有用乙醇固定，則易造成核膨脹或破裂。沒(méi)有用乙醇固定，則易造成核膨脹或破裂。（一）酶消化法（一）酶消化法 0.5% pH 1.5胃蛋白酶、胃蛋白酶、0.25% 胰蛋白酶、胰蛋白酶、0.05%膠原酶膠原酶 主要是水解組織間的膠原纖維和多糖物質(zhì)、分開(kāi)細(xì)胞間主要是水解組織間的膠原纖維和多糖物質(zhì)、分開(kāi)細(xì)胞間的緊密連接。的緊密連接。1. 切除的組織應(yīng)馬上放入預(yù)冷的組織培養(yǎng)液或生理鹽水中，切

43、除的組織應(yīng)馬上放入預(yù)冷的組織培養(yǎng)液或生理鹽水中，清洗血跡及其他污染物清洗血跡及其他污染物2. 除去的組織塊上的壞死成分、纖維、脂肪以及血管等組織除去的組織塊上的壞死成分、纖維、脂肪以及血管等組織3. 將組織塊剪成約將組織塊剪成約1cm大小的小塊，用冷的生理鹽水洗去剪大小的小塊，用冷的生理鹽水洗去剪碎的細(xì)胞碎片碎的細(xì)胞碎片4. 一般來(lái)說(shuō)取一般來(lái)說(shuō)取1.0g組織加入適當(dāng)?shù)拿赶航M織加入適當(dāng)?shù)拿赶?0ml5. 37的恒溫水箱消化的恒溫水箱消化20-30min，消化期間要振蕩或吹打，消化期間要振蕩或吹打 用冷的培養(yǎng)液終止消化，收集單細(xì)胞懸液用冷的培養(yǎng)液終止消化，收集單細(xì)胞懸液 先后用先后用200

44、目和目和350目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去凝聚的細(xì)胞團(tuán)塊，目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾除去凝聚的細(xì)胞團(tuán)塊，收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)、收集細(xì)胞一般不小于收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)、收集細(xì)胞一般不小于106細(xì)胞用乙醇固定，留用。細(xì)胞用乙醇固定，留用。（二）機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法（二）機(jī)械法：剪碎法、網(wǎng)搓法、研磨法 使細(xì)胞由緊密聯(lián)結(jié)的組織中釋放出來(lái)，這種使細(xì)胞由緊密聯(lián)結(jié)的組織中釋放出來(lái)，這種方法的缺點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞的損傷比較大，導(dǎo)致細(xì)胞碎方法的缺點(diǎn)是對(duì)細(xì)胞的損傷比較大，導(dǎo)致細(xì)胞碎片多和細(xì)胞團(tuán)塊多，影響流式細(xì)胞儀的測(cè)試的準(zhǔn)片多和細(xì)胞團(tuán)塊多，影響流式細(xì)胞儀的測(cè)試的準(zhǔn)確性和精密度，當(dāng)樣本中的細(xì)胞碎片超過(guò)確性和精密度，當(dāng)樣本中的細(xì)胞碎片超過(guò)20%時(shí)時(shí)

45、測(cè)試的誤差就很大。測(cè)試的誤差就很大。（三）化學(xué)法（三）化學(xué)法 作用原理除去細(xì)胞之間起到粘連的鎂離子和鈣離作用原理除去細(xì)胞之間起到粘連的鎂離子和鈣離子，而使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)一般用子，而使細(xì)胞分散開(kāi)來(lái)一般用EDTA胰酶消化液。胰酶消化液。1.將組織剪成小塊放入試管將組織剪成小塊放入試管2.先加入先加入EDTA液液5ml，室溫下半個(gè)小時(shí)棄去。，室溫下半個(gè)小時(shí)棄去。3.加入加入EDTA胰酶消化液胰酶消化液510ml，37水浴中水浴中 30min，間斷振蕩，間斷振蕩3-5次次4.加入加入350目尼龍網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，離心沉淀目尼龍網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，離心沉淀1000rpm，5min，生理鹽水沖洗，生理鹽水沖洗2-3次，離

46、心次，離心800rpm5-8min。5.收集細(xì)胞懸液再離心棄上清，管底細(xì)胞打勻吸入吸收集細(xì)胞懸液再離心棄上清，管底細(xì)胞打勻吸入吸 管內(nèi)，總體積管內(nèi)，總體積0.1-0.2ml，用，用70%乙醇進(jìn)行固定，乙醇進(jìn)行固定， 放置放置4冰箱待檢。冰箱待檢。二、新鮮實(shí)體瘤單細(xì)胞核懸液的制備二、新鮮實(shí)體瘤單細(xì)胞核懸液的制備：用用于細(xì)胞核內(nèi)的成分分析，特別是做于細(xì)胞核內(nèi)的成分分析，特別是做DNA定量核定量核細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí)測(cè)定方便實(shí)用。細(xì)胞周期檢測(cè)時(shí)測(cè)定方便實(shí)用。三、石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備三、石蠟包埋組織單細(xì)胞懸液的制備可用于既往實(shí)驗(yàn)材料的回顧性研究可用于既往實(shí)驗(yàn)材料的回顧性研究原理：將石蠟包埋組織經(jīng)二甲

47、苯脫蠟，采用梯度原理：將石蠟包埋組織經(jīng)二甲苯脫蠟，采用梯度酒精到水，使組織逐漸分級(jí)水化，使組織恢復(fù)到酒精到水，使組織逐漸分級(jí)水化，使組織恢復(fù)到甲醛固定前的狀態(tài)，應(yīng)用相應(yīng)的酶消化液、解聚甲醛固定前的狀態(tài)，應(yīng)用相應(yīng)的酶消化液、解聚組織細(xì)胞間的聯(lián)結(jié)物并使細(xì)胞從組織片中釋放而組織細(xì)胞間的聯(lián)結(jié)物并使細(xì)胞從組織片中釋放而制成單細(xì)胞懸液。制成單細(xì)胞懸液。四、其他單細(xì)胞懸液的制備四、其他單細(xì)胞懸液的制備（一）血單細(xì)胞懸液的制備（一）血單細(xì)胞懸液的制備用淋巴細(xì)胞分離液分離血中的單個(gè)核細(xì)胞。用淋巴細(xì)胞分離液分離血中的單個(gè)核細(xì)胞。（二）細(xì)胞培養(yǎng)液中的單細(xì)胞懸液的制備（二）細(xì)胞培養(yǎng)液中的單細(xì)胞懸液的制備 EDTA胰酶

48、進(jìn)行消化胰酶進(jìn)行消化（三）胸腹水標(biāo)本單細(xì)胞懸液的制備（三）胸腹水標(biāo)本單細(xì)胞懸液的制備離心洗滌，如果胸腹水中蛋白濃度過(guò)高的話，加入肝素抗凝。離心洗滌，如果胸腹水中蛋白濃度過(guò)高的話，加入肝素抗凝。（四）膀胱灌洗液?jiǎn)渭?xì)胞懸液的制備（四）膀胱灌洗液?jiǎn)渭?xì)胞懸液的制備膀胱癌細(xì)胞，不從尿液中收集，尿液中細(xì)胞容易死亡和變性。膀胱癌細(xì)胞，不從尿液中收集，尿液中細(xì)胞容易死亡和變性。（五）細(xì)針穿刺物單細(xì)胞懸液的制備（五）細(xì)針穿刺物單細(xì)胞懸液的制備 與新鮮實(shí)體瘤組織細(xì)胞制備相同與新鮮實(shí)體瘤組織細(xì)胞制備相同（六）脫落細(xì)胞樣品中單細(xì)胞懸液的制備（六）脫落細(xì)胞樣品中單細(xì)胞懸液的制備 食道拉網(wǎng)法，胃鏡。支氣管鏡食道拉網(wǎng)法，胃

49、鏡。支氣管鏡流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（一）流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（一）細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞生物學(xué)：細(xì)胞凋亡研究細(xì)胞凋亡研究；定量定量分析細(xì)胞周期并分選分析細(xì)胞周期并分選不同不同細(xì)胞周期細(xì)胞周期時(shí)相的細(xì)胞；分析生物大分子如時(shí)相的細(xì)胞；分析生物大分子如DNADNA、RNARNA、抗原、癌基因表達(dá)產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系，進(jìn)抗原、癌基因表達(dá)產(chǎn)物等物質(zhì)與細(xì)胞增殖周期的關(guān)系，進(jìn)行染色體核型分析，并可純化行染色體核型分析，并可純化X X或或Y Y染色體。染色體。腫瘤學(xué)：腫瘤學(xué)：DNADNA倍體含量測(cè)定是鑒別良、惡性腫瘤的特異倍體含量測(cè)定是鑒別良、惡性腫瘤的特異指標(biāo)。近年來(lái)已應(yīng)用指標(biāo)。近年來(lái)已應(yīng)用DNADNA倍體測(cè)定技

50、術(shù)，對(duì)白血病、淋巴倍體測(cè)定技術(shù)，對(duì)白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)。瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤細(xì)胞進(jìn)行探測(cè)。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細(xì)胞。用單克降抗體技術(shù)清除血液中的腫瘤細(xì)胞。免疫學(xué)：免疫學(xué)：研究細(xì)胞周期或研究細(xì)胞周期或DNADNA倍體與細(xì)胞表面受體及抗倍體與細(xì)胞表面受體及抗原表達(dá)的關(guān)系；進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的分型與純化；分析淋原表達(dá)的關(guān)系；進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的分型與純化；分析淋巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；巴細(xì)胞亞群與疾病的關(guān)系；免疫缺陷病如艾滋病的診斷；器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)等。器官移植后的免疫學(xué)監(jiān)測(cè)等。流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（二）

51、流式細(xì)胞儀的應(yīng)用（二）血液學(xué)：血液學(xué)：血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血液細(xì)胞的分類、分型，造血細(xì)胞分化的研究，血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過(guò)氧化物酶、非特異性酯酶血細(xì)胞中各種酶的定量分析，如過(guò)氧化物酶、非特異性酯酶等；用等；用NBT及及DNA雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)雙染色法可研究白血病細(xì)胞分化成熟與細(xì)胞增殖周期變化的關(guān)系，檢測(cè)母體血液中胞增殖周期變化的關(guān)系，檢測(cè)母體血液中Rh(+)或抗或抗D抗原陽(yáng)抗原陽(yáng)性細(xì)胞，以了解胎兒是否可能因性細(xì)胞，以了解胎兒是否可能因Rh血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血；血型不合而發(fā)生嚴(yán)重溶血；檢測(cè)血液中循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅檢測(cè)血液中

52、循環(huán)免疫復(fù)合物可以診斷自身免疫性疾病，如紅斑狼瘡等。斑狼瘡等。藥物學(xué)：藥物學(xué)：檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥的作用機(jī)制，檢測(cè)藥物在細(xì)胞中的分布，研究藥的作用機(jī)制，亦可用于篩選新藥，如化療藥物對(duì)腫瘤的凋亡機(jī)制，可通過(guò)亦可用于篩選新藥，如化療藥物對(duì)腫瘤的凋亡機(jī)制，可通過(guò)測(cè)測(cè)DNA凋亡峰，凋亡峰，Bcl-2凋亡調(diào)節(jié)蛋白等凋亡調(diào)節(jié)蛋白等 細(xì)胞熒光染色定量技術(shù)細(xì)胞熒光染色定量技術(shù)一、細(xì)胞內(nèi)抗原定量技術(shù)一、細(xì)胞內(nèi)抗原定量技術(shù)（一）（一）原理原理 二抗上帶有熒光標(biāo)記。用標(biāo)記已知數(shù)量的熒光素分子的標(biāo)準(zhǔn)微球作參照，二抗上帶有熒光標(biāo)記。用標(biāo)記已知數(shù)量的熒光素分子的標(biāo)準(zhǔn)微球作參照，可以計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞抗原決定簇的數(shù)量

53、可以計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞抗原決定簇的數(shù)量（二）（二）方法方法1.首先設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素標(biāo)記抗體首先設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素標(biāo)記抗體2.設(shè)定好流式的各種參數(shù)，保持不變?cè)O(shè)定好流式的各種參數(shù)，保持不變3.測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素的強(qiáng)度，做出熒光分子數(shù)與熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化的熒光素的強(qiáng)度，做出熒光分子數(shù)與熒光強(qiáng)度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線4.測(cè)定待測(cè)細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度測(cè)定待測(cè)細(xì)胞上的熒光強(qiáng)度5.根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞的熒光素的分子數(shù)。根據(jù)熒光強(qiáng)度計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞的熒光素的分子數(shù)。流式細(xì)胞流式細(xì)胞儀應(yīng)用舉儀應(yīng)用舉例例1（三）（三）測(cè)定的意義測(cè)定的意義1.PCNA及及Ki67核抗原的測(cè)定核抗原的測(cè)定2.C-erb-2抗凋亡

54、基因測(cè)定抗凋亡基因測(cè)定3.Myc基因家族基因家族4.P535.檢測(cè)特征性的標(biāo)記物檢測(cè)特征性的標(biāo)記物6.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)巨細(xì)胞病毒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)巨細(xì)胞病毒二二. DNA定量技術(shù)定量技術(shù)（一）（一）DNA定量方法定量方法1.DNA熒光染料定量法熒光染料定量法根據(jù)熒光染料如根據(jù)熒光染料如PI、EB等對(duì)細(xì)胞核等對(duì)細(xì)胞核DNA的親和能力，使其染色，用流式細(xì)胞儀分析的親和能力，使其染色，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞中細(xì)胞中DNA的含量。與的含量。與DNA結(jié)合的熒光染料越多，熒光強(qiáng)度愈強(qiáng)。結(jié)合的熒光染料越多，熒光強(qiáng)度愈強(qiáng)。DNA含量增多證含量增多證實(shí)有腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)異倍體細(xì)胞即為惡性腫瘤實(shí)有腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)。如果發(fā)現(xiàn)異倍

55、體細(xì)胞即為惡性腫瘤2.溴化乙啶嘧啶核苷定量法溴化乙啶嘧啶核苷定量法3.吖啶橙定量法吖啶橙定量法（二）對(duì)臨床腫瘤的指導(dǎo)意義（二）對(duì)臨床腫瘤的指導(dǎo)意義 軟組織腫瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和軟組織腫瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌和宮頸癌。宮頸癌。（三）對(duì)癌前病變（三）對(duì)癌前病變DNA倍體分析倍體分析 細(xì)胞不典型增生的程度愈明顯，則細(xì)胞不典型增生的程度愈明顯，則DNA異倍體出現(xiàn)率也增高。異倍體出現(xiàn)率也增高。（四）在腫瘤治療中的作用（四）在腫瘤治療中的作用 腫瘤存在異質(zhì)性，同一種腫瘤細(xì)胞對(duì)同一化療藥物也可能存在不同程度的反應(yīng)。腫瘤存在異質(zhì)性

56、，同一種腫瘤細(xì)胞對(duì)同一化療藥物也可能存在不同程度的反應(yīng)。通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì)DNA含量、含量、S期比率分析，有助于對(duì)化療藥物的選擇或放射線有效照射量及期比率分析，有助于對(duì)化療藥物的選擇或放射線有效照射量及時(shí)間的決定。時(shí)間的決定。*細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)凋亡的方法檢測(cè)凋亡的方法（一）形態(tài)學(xué)檢測(cè)（一）形態(tài)學(xué)檢測(cè) FS,SS,反映了細(xì)胞體積縮小，胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)反映了細(xì)胞體積縮小，胞核和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，但是不可以對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量。變化，但是不可以對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量。流式細(xì)胞流式細(xì)胞儀應(yīng)用舉儀應(yīng)用舉例例2（二）根據(jù)細(xì)胞膜通透性的染色法（二）根據(jù)細(xì)胞膜通透性的染色法 凋亡細(xì)胞膜透性有一定程度的增

57、加，染料凋亡細(xì)胞膜透性有一定程度的增加，染料Hoechst 33342透性增加，透性增加，PI透性不增加可以用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、凋透性不增加可以用來(lái)區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞。亡細(xì)胞和死細(xì)胞。Hoechst 33342/PI 雙染色法：低藍(lán)色雙染色法：低藍(lán)色/低紅光低紅光 正常細(xì)胞正常細(xì)胞 高藍(lán)光高藍(lán)光/低紅光低紅光 凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞 低藍(lán)光低藍(lán)光/高紅光高紅光 死亡細(xì)胞死亡細(xì)胞（三）凋亡細(xì)胞的（三）凋亡細(xì)胞的TUNEL和和ISNT法法1.直接標(biāo)記法直接標(biāo)記法DNA斷點(diǎn)測(cè)定：斷點(diǎn)測(cè)定：3羥基末端，羥基末端，DNA聚合酶聚合酶-1催催化的原位缺口轉(zhuǎn)移法，缺口標(biāo)記的是生物素化化的原位缺口轉(zhuǎn)移法，缺口

58、標(biāo)記的是生物素化的脫氧三磷酸尿苷或地高辛配體脫氧三磷酸尿的脫氧三磷酸尿苷或地高辛配體脫氧三磷酸尿苷；后者標(biāo)記的為苷；后者標(biāo)記的為FITC-dUTP.2.間接標(biāo)記法、用鏈霉素親和素間接標(biāo)記法、用鏈霉素親和素-FITC或抗地或抗地高辛高辛-FITC，使其靈敏度高。，使其靈敏度高。 無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞。無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞。流式流式“TUNEL”脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化FITC-dUTP和和3OH末端末端結(jié)合，結(jié)合，DNA破裂的斷端被破裂的斷端被FITC-dUTP結(jié)合。結(jié)合。（四）用熒光染料對(duì)降解的（四）用熒光染料對(duì)降解的DNA進(jìn)行測(cè)定進(jìn)行測(cè)定 細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞凋亡后，DNA斷裂，斷裂，DNA

59、斷裂生成的小片段斷裂生成的小片段易于釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的易于釋放到細(xì)胞外，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的DNA含量減少。用含量減少。用親親DNA的染料的染料PI對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)流式細(xì)對(duì)固定后的細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞位于正常細(xì)胞的胞儀分析凋亡細(xì)胞位于正常細(xì)胞的G0/G1期峰之前出期峰之前出現(xiàn)凋亡細(xì)胞峰。不能檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞?，F(xiàn)凋亡細(xì)胞峰。不能檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞周期不能區(qū)分凋亡與死亡細(xì)胞細(xì)胞周期不能區(qū)分凋亡與死亡細(xì)胞 Sub-G0/G1 peaks - PI staining（五）（五）FITC-AnnexinV / PI雙染色法雙染色法 細(xì)胞凋亡早期是膜表面的磷脂酰絲氨酸（細(xì)胞

60、凋亡早期是膜表面的磷脂酰絲氨酸（PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，因此細(xì)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到膜外，因此細(xì)胞膜上磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使胞膜上磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在膜外。暴露在膜外。AnnexinV是一種鈣離子是一種鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，易與依賴的磷脂結(jié)合蛋白，易與PS結(jié)合，由此充當(dāng)了檢測(cè)結(jié)合，由此充當(dāng)了檢測(cè)PS的探針。的探針。 R1File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03QuadEvents% Gated X MeanY MeanUL2542.4037.47461.36UR106710.08816.86468.89LL529149.9819.574.4