人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯免疫分析試劑盒使用方法

1、人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶聯免疫分析試劑盒使用方法檢測范圍：96T0.3U/L - 16U/L使用目的：本試劑盒用于測定人血清、血漿及相關液體樣本中磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶含量。實驗原理本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶水平。用純化的人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶抗體包被微孔板，制成固相抗體， 往包被單抗的微孔中依次加入AMPK ，再與 HRP 標記的 AMPK 抗體結合，形成抗體 -抗原 -酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物 TMB 顯色。 TMB 在 HRP 酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的AMPK 呈正相關。用酶標儀在4

2、50nm 波長下測定吸光度 （ OD值），通過標準曲線計算樣品中人磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶濃度。試劑盒組成130 倍濃縮洗滌液20ml× 1 瓶7終止液6ml ×1 瓶2酶標試劑6ml × 1 瓶8標準品（ 32U/L ）0.5ml × 1 瓶3酶標包被板12孔× 8條9標準品稀釋液1.5ml × 1 瓶4樣品稀釋液6ml × 1 瓶10說明書1 份5顯色劑 A液6ml × 1 瓶11封板膜2 張6顯色劑 B液6ml × 1/瓶12密封袋1 個標本要求1標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應

3、盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20保存，但應避免反復凍融2不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。操作步驟1. 標準品的稀釋： 本試劑盒提供原倍標準品一支， 用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。16U/L5 號標準品150l 的原倍標準品加入150l 標準品稀釋液8U/L4 號標準品150l 的 5 號標準品加入150l 標準品稀釋液4U/L3 號標準品150l 的 4 號標準品加入150l 標準品稀釋液2U/L2 號標準品150l 的 3 號標準品加入150l 標準品稀釋液1U/L1 號標準品150l 的 2 號標準品加入150l 標準品

4、稀釋液2.加樣： 分別設空白孔 （空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同） 、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50l，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40l，然后再加待測樣品 10l（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3.溫育：用封板膜封板后置37溫育 30 分鐘。4.配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復 5 次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標試劑50l，空白孔除外。7. 溫育：操作同 3。8. 洗滌：操作同 5。9. 顯色：

5、每孔先加入顯色劑 A50 l，再加入顯色劑 B50l，輕輕震蕩混勻， 37避光顯色15 分鐘.10. 終止：每孔加終止液 50l，終止反應（此時藍色立轉黃色） 。11.測定：以空白空調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（液后 15 分鐘以內進行。操作程序總結：OD值）。 測定應在加終止計算以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值代入方程式， 計算出樣品濃度， 再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。注意事項1試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在

6、室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。2濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。3各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在 5 分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。4 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（ n 倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數（× n× 5）。5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6底物請避光保存。7嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準