關(guān)于巨細(xì)胞病毒特異性IgG抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

1、關(guān)于巨細(xì)胞病毒特異性IgG抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用    The peacock has fair feathers, but foul.                     作者：張萌 安利莎 侯林浦 牛向蘭 谷學(xué)英 何歡 馬旭Silence in times of sufferin

2、g is the best.  【摘要】  目的 為了建立一種快速、簡(jiǎn)便、實(shí)用的可用于育齡婦女血清中巨細(xì)胞病毒(CMV)IgG抗體的篩查方法，并初步探索其應(yīng)用價(jià)值。 方法 建立重組CMV(pp150+52)抗原;以國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所(簡(jiǎn)稱本所)建立的重組CMV(pp150+52)抗原作為包被抗原，700 IU/L作為臨界值，用間接ELISA方法，對(duì)深圳寶安區(qū)1 024例血清標(biāo)本進(jìn)行CMVIgG抗體的檢測(cè)。 結(jié)果 該方法靈敏度為13 IU/L，批內(nèi)變異系數(shù)4.7

3、60;%7.0 %，批間變異系數(shù)7.6 %14.4 %，并與SORIN公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行了比較，2種方法呈最度相關(guān)，Kappa值為0.82;深圳寶安區(qū)1 024例血清標(biāo)本CMVIgG抗體陽(yáng)性率為93.3 %(955 /1 024)，陰性率為6.7 %( 69/1 024)。 結(jié)論 本所建立的ELISA方法快速、簡(jiǎn)便和實(shí)用，可用于育齡婦女CMVIgG抗體的篩查()。 God sends fortune to fools.  【關(guān)鍵詞】  

4、;巨細(xì)胞病毒;IgG抗體;ELISA;篩查;育齡婦女You never know what you can do till you.  【Abstract】 Objective To establish a rapid, serum and convenient method for the screening of cytomegalovirus (CMV) specific IgG antibody&#

5、160;in sera samples of women of childbearing age, and to evaluate the preliminary significance of application.MethodsThe measurement of CMVIgG was conducted by indirect enzyme link

6、ed immunosorbent assay using recombinant CMVAg (pp150+52) as coating antigen, and 700 IU/L as Cutoff value. ResultsThe specific CMVIgG antibodies in sera were detected in 1

7、60;024 women of childbearing age in Shenzhen, by using the method established by our study and the ELISA assay kid provided by Diasorin Co. The positive rate, negati

8、ve rate, sensitivity of our method was 93.3 %, 6.7 %, and 13 IU/L, respectively. The intraassay coefficient of variation was between 4.7 %-7.0 % and the interassay&#

9、160;coefficient of variation was between 7.6%-14.4 %. The Kappa value between our method and ELISA assay kid provided by Diasorin Co. was 0.82, indicating a good relativi

10、ty.ConclusionOur ELISA assay is a rapid, easy and convenient method and could be used for screening the CMV-IgG specific antibodies among premarital women.Manners make the man.  【Key

11、60;words】 Cytomegalovirus; IgG antibody; ELISA; Screening; Women of childbearing ageSilence in times of suffering is the best.  孕婦巨細(xì)胞病毒(cytomegaloviurs, CMV)原發(fā)感染有32 %可感染胎兒，繼發(fā)或再感染只有1.4 %感染胎兒1。有嚴(yán)重臨床癥狀的先天性CMV感染兒多為孕婦原發(fā)感染造成2,3。Fowler等4的研究表明

12、，母親感染過(guò)CMV后再妊娠，先天性CMV感染的危險(xiǎn)性可降低69 %。因此，對(duì)準(zhǔn)備妊娠的育齡婦女進(jìn)行CMVIgG抗體的篩查，通過(guò)這種安全無(wú)害、且簡(jiǎn)便便宜的檢測(cè)，了解育齡婦女的免疫狀況，可使約90 %以上的CMVIgG陽(yáng)性者不必?fù)?dān)心孕后會(huì)發(fā)生原發(fā)CMV感染，也可使小于10 %的CMVIgG陰性者孕后作為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。對(duì)于妊娠的育齡婦女進(jìn)行CMVIgG篩查是預(yù)防先天性CMV感染一級(jí)預(yù)防措施，這對(duì)防止和減少有嚴(yán)重出生缺陷的先天性CMV感染兒的降生有重要意義。It is right to put everything in its proper use.  盡管檢

13、測(cè)CMVIgG抗體的ELISA方法在實(shí)驗(yàn)室中早已建立5，1995年WHO也建立了IgG的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，但至今，中國(guó)國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的臨界值，中國(guó)也未有國(guó)家批準(zhǔn)的可供篩查用的試劑盒。為此，本研究建立了用重組CMVAg的ELISA檢測(cè)方法，并提出了以700 IU/L作為國(guó)內(nèi)育齡婦女CMVIgG抗體篩查的臨界值的建議。The small courtesies sweeten life; the greater ennoble it.  材料與方法一、材料Answer a fool according to his folly.  1.標(biāo)本來(lái)源： 1 024

14、例血清標(biāo)本，2008年1月至5月，來(lái)源于深圳市寶安區(qū)和深圳市計(jì)劃生育?？崎T診的2040歲的育齡婦女。Throw away the apple because of the core.  2.抗原來(lái)源：8種CMV抗原分別來(lái)源于下列機(jī)構(gòu)及個(gè)人(醫(yī)藥學(xué)/臨床醫(yī)學(xué)論文 )。(1)國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所(簡(jiǎn)稱本所)制備的CMV重組抗原。(2)本所制備的CMV全病毒純化抗原。(3)購(gòu)自Fitzgerald公司的全病毒純化抗原。(4)購(gòu)自深圳菲鵬公司的CMVpp150+pp52重組抗原。(5)購(gòu)自深圳菲鵬公司的CMVpp150重組抗原。(6)購(gòu)自深圳菲鵬公司的CMVpp52重組抗原

15、。(7)購(gòu)自Devatal公司的CMVpp65重組抗原。(8)李欣老師贈(zèng)送的CMVpp65+pp52+pp150重組抗原。3.主要試劑和儀器：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗人IgG(丹麥DAKO公司)，TMB底物;Thermo Labsystems酶標(biāo)儀(MultiskanAscent, Thermo Fisher Scientific公司)。4.實(shí)驗(yàn)條件的選擇：經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)固相載體(國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口Costar板)、抗原濃度、封閉條件(脫脂奶粉，小牛血清，BSA，PEG)、標(biāo)本稀釋液、穩(wěn)定性試驗(yàn)等的試驗(yàn)，確定了應(yīng)用吸附力強(qiáng)而均勻的進(jìn)口Coning Cost

16、ar板作為固相載體，本批抗原為12000，用3 %脫脂奶粉封閉，采用本所特制的有血清指示劑的變色標(biāo)本稀釋液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋。該稀釋液加入血清前為黃色，加入血清后變?yōu)樗{(lán)色，可避免孔內(nèi)漏加標(biāo)本。本稀釋液與國(guó)外(意大利Sorin和德國(guó)試劑)試劑盒提供的標(biāo)本稀釋液比較無(wú)差異。二、本所重組CMVAg(pp150+52)的制備  由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成的3種嵌合DNA(CMVCG1 pp150氨基酸495691;CMVCG2 pp150氨基酸695854，gp52氨基酸297433;CMVCG3 pp150氨基酸595616， 100610

17、48，gp52氨基酸202433)并構(gòu)建于pMD19T克隆載體中，將此構(gòu)建好的3個(gè)克隆載體和pET24a(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞中，然后重新抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶XhoI和NdeI進(jìn)行雙酶切，得到線性化的pET24 a(+)質(zhì)粒載體和3個(gè)嵌合DNA片段。再將DNA片段接入質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，再將克隆于37 培養(yǎng)8 h后，經(jīng)由聚合酶鏈反應(yīng)，polymerase chain reaction，PCR)和測(cè)序(由北京三博公司完成)的工程菌按150接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再經(jīng)1 mmol/L的IP

18、TG誘導(dǎo)8 h，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSpolyacrylamide gel electrophoresis,SDSPAGE)考染和蛋白質(zhì)印跡(western blot)的方法確定蛋白的表達(dá)。將富集誘導(dǎo)表達(dá)的重組CMVAg(pp150+52)抗原菌體超聲破碎、離心得上清后，通過(guò)PVDF膜分別收集主峰，再經(jīng)Amicon 15YM10超濾脫鹽濃縮后，貯存于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中。三、檢驗(yàn)程序None but a wise man can em

19、ploy leisure well.  1.8種CMVAg敏感性比較與選擇：各種抗原按常規(guī)方法包被于固載體，經(jīng)封閉洗滌后應(yīng)用。用1份混合血清經(jīng)濃縮后作為檢測(cè)樣品，從1100開(kāi)始倍比稀釋至16 400。取100 l標(biāo)本稀釋液加入包被孔內(nèi)，再加1 l待測(cè)血清混勻，37 孵育1 h;洗液清洗5次，再加入100 l酶結(jié)合物37 孵育1 h;再次清洗5次，加入顯色劑TMBH2O2 100 l，室溫顯色30 min;加入終止液200 l，于酶標(biāo)儀上(450 nm

20、60;/620 nm)測(cè)樣品OD值。選擇CMV重組抗原pp52+pp150作為包被抗原。最佳變異系數(shù)(coefficient of variation, CV)分別為3.3 %5.4 %。2.CMVIgG的最低檢出量：以400 IU/L和0 IU/L兩份標(biāo)本，分別重復(fù)檢測(cè)12次和16次，分別取其平均值減去和加上2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為最低稀釋度標(biāo)準(zhǔn)。3.精密度：任意選擇不同抗體含量的3份標(biāo)本(10 800 IU/L、3 600 IU/L、1 200 IU/L)，每份標(biāo)

21、本重復(fù)12次試驗(yàn)，計(jì)算其變異系數(shù)。Know thyself.  4.穩(wěn)定性試驗(yàn)：將同一批試劑分別放37 存放3、5、7 d后，取出與存放4 的試劑比較其檢測(cè)所得的OD。Curiosity killed the cat.  5.對(duì)比試驗(yàn)：以Sorin公司生產(chǎn)的CMVIgG ELISA方法為參比方法，與本法進(jìn)行比較，計(jì)算2種方法的相關(guān)性Kappa值。K=N(a+b)-(r1·c1+r2·c2)N2-(r1c1+r2c2)a為真陽(yáng)性，b為假陽(yáng)性，c為假陰性，d為真陰性，a+c=c1，b+d=c2，N=a+b+c+d，a+

22、b=r1，c+d=r2Quality is better than quantity.  6.CMVIgG抗體臨界值的確定：用意大利Sorin公司生產(chǎn)的CMVIgG抗體檢測(cè)試劑盒，篩出38份CMVIgG抗體陰性血清，再用本所研制的CMVIgG抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。以的2.1倍、+2SD、+4SD、+0.3作為臨界值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得CMVIgG的IU/L值。結(jié) 果一、本所重組CMVAg(pp150+52)的制備本所重組CMVAg(pp150+52)經(jīng)由PCR和測(cè)序，再經(jīng)SDSPAGE考染和WESTERN確定蛋白的表達(dá)，證明工程菌重組CMVAg(pp150+52)構(gòu)建成功

23、。二、重組CMVAg(pp150+52)的質(zhì)量檢測(cè)1.8種CMVAg敏感性比較與選擇：第4和第5種CMVAg，即CMV重組抗原pp150+pp52和pp150的敏感性較好。同時(shí)對(duì)8種抗原作了精密性分析，結(jié)果顯示，第4和第5種抗原的CV %值分別為3.3 %和5.4 %，優(yōu)于其他6種抗原(CV %值為6.1 %11.3 %),見(jiàn)表1。表1 8種抗原檢測(cè)不同稀釋度血清學(xué)OD值He that runs fastest gets the ring.  2.最低檢出量：最低檢出量為13290 IU/L。 

24、 3.精密度：批內(nèi)變異系數(shù)為4.7 %7.0 %，批間變異系數(shù)則為7.6 %14.4 %，符合ELISA試驗(yàn)<15 %的要求。When love puts in, friendship is gone.  4.穩(wěn)定性試驗(yàn)：將同一批試劑分別放37 存放3、5、7 d后，取出與存放4 的試劑用24份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，比較所測(cè)OD值變化均在10 %以內(nèi)。One ploughs, another sow; who will reap  5.對(duì)比試驗(yàn)：本研究建立的方法與意大利Sorin公司生產(chǎn)

25、的CMVIgG檢測(cè)試劑盒比較，其敏感性為92.3 %，特異性為82.2 %，診斷效率為97 %， Kappa值為0.82，2種方法呈高度相關(guān)。按內(nèi)容性質(zhì)和研究方法的不同可以把論文分為理論性論文、實(shí)驗(yàn)性論文、描述性論文和設(shè)計(jì)性論文.  6.CMVIgG抗體臨界值的確定：38份CMVIgG抗體陰性血清平均OD值為0.199，SD為0.076。若用的2.1倍作為臨界值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得CMVIgG抗體含量為440 IU/L;若以+2SD作為臨界值，則為340 IU/L;若以+4SD則臨界值為700 IU/L;若以+0.3為

26、臨界值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的結(jié)果為700 IU/L。根據(jù)本所建立CMVIgG抗體檢測(cè)的目的是對(duì)育齡婦女進(jìn)行篩查，要求一個(gè)不漏的篩查出陰性者，認(rèn)為用700 IU/L作為臨界值比用400 IU/L作臨界值效果更好。表2 本研究建立的方法與參比方法檢測(cè)結(jié)果比較本研究方法Sorin方法(參比方法)陽(yáng)性 陰性陽(yáng)性444(a)7(b)陰性8(c)37(d)Wine and judgement mature with age.  三、臨床應(yīng)用深圳育齡婦女血清中CMVIgG抗體檢測(cè)，不同的Cutoff值標(biāo)準(zhǔn)，其CMVIgG()和(+)的比例，見(jiàn)表3。表3

27、 1 024例育齡婦女血清中CMVIgG抗體檢測(cè)結(jié)果First try, and then trust.  討 論在用ELISA方法檢測(cè)相應(yīng)抗體時(shí)應(yīng)用的相應(yīng)的包被抗原是決定方法的敏感性和特異性最重要的因素。Weber等6,通過(guò)不同的CMV重組抗原與全病毒純化抗原對(duì)CMVIgG抗體檢測(cè)的比較發(fā)現(xiàn)，其敏感性和特異性沒(méi)有差別。但是，國(guó)內(nèi)外也有報(bào)告79認(rèn)為，重組抗原要比全病毒純化抗原效果好。因?yàn)椋烊坏娜《炯兓乖嬖陔y于標(biāo)準(zhǔn)化和培養(yǎng)中潛在細(xì)胞蛋白污染和與其他病毒交叉污染等問(wèn)題，而且多個(gè)重組抗原組合比單一的重組抗原效果好。本所的試驗(yàn)結(jié)果也顯示，用CMV重組抗原

28、效果比全病毒純化抗原要好。因此，本所選擇了CMV重組抗原pp150+pp52作為包被抗原。Money is the root of all evil.  關(guān)于檢測(cè)CMVIgG抗體時(shí)所用的臨界值，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，盡管1995年WHO已發(fā)布了CMVIgG的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，但至今尚未提供有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，各國(guó)實(shí)驗(yàn)室仍是用自己的標(biāo)準(zhǔn)。如，意大利Sorin公司的產(chǎn)品用400 IU/L作為臨界值;而羅氏公司則定為700 IU/L，把500700 IU/L作為可疑;而B(niǎo)iotest公司則將臨界值定為陰性平均OD值加0.3作為臨界值;而國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室則多用陰性平均OD值加2SD

29、或均值的2.1倍。國(guó)外尚有將陰性平均OD值加4個(gè)SD作為臨界值的，本所認(rèn)為，選擇700 IU/L作為中國(guó)育齡婦女篩查時(shí)的臨界值較好。因?yàn)?，這種篩查是盡量不要漏掉陰性者而不是篩查陽(yáng)性者，所以用700 IU/L比用400 IU/L更好。本所建立的方法應(yīng)用意大利Sorin公司(FDA認(rèn)證)的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定本所的標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)對(duì)檢測(cè)方法各個(gè)環(huán)節(jié)的優(yōu)化選擇，特別是采用了獨(dú)特的變色稀釋液和用濾紙片保存標(biāo)準(zhǔn)品，使其保存更加穩(wěn)定。本研究檢測(cè)的結(jié)果與用Sorin試劑對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)的1 879例育齡婦女檢測(cè)結(jié)果比較，若以400 IU/L作臨界值，則陰性檢出率為2.9

30、0;%，本法為3.8 %;若以700 IU/L作臨界值，陰性檢出率為4.9 %，本法為6.7 %。本法陰性率略高。該方法經(jīng)與FDA認(rèn)證的DiaSorin公司CMVIgG ELISA方法比較呈高度相關(guān)，方法的精密性、靈敏度、穩(wěn)定性均符合ELISA方法的要求。目前，由于進(jìn)口試劑價(jià)格較昂貴，限制了在人群中推廣應(yīng)用，本研究建立的方法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便適宜大人群的育齡婦女中進(jìn)行CMVIgG抗體的篩查之用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Kenneson A, Cannon MJ. Review an

31、d metaanalysis of the epidemiology of congenital cytomegalovirus (CMV) infectionJ. Rev Med Virol， 2007,17(4):253276.2Ornoy A, Diavcitrin O. Fetal effects of primary and secondary cytome

32、galovirus infection in pregnancyJ. Reproductive Toxicology， 2006,21: 399409.3Adler SP, Nigro G, Pereira L. Recent advances in the prevention and treatment of congenital cytomegalovirus 

33、infectionsJ. Semin Perinatol， 2007, 31(1):1018.4Fowler KB, Stagno S, Pass RF. Maternal immunity and prevention of congenital cytomegalovirus infectionJ. JAMA， 2003, 289(8):10081011.5Booth JC,

34、0;Hannington G, Aziz TA, et al. Comparison of enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) technique and complementfixation test for estimation of cytomegalovirus IgG antibodyJ. J Clin 

35、;Pathol， 1979,32(2):122127.6Weber B, Berger A, Rabenau H. Human cytomegalovirus infection: diagnostic potential of recombinant antigens for cytomegalovirus antibody detectionJ. J Virol Methods，&#

36、160;2001，96(2):15770.7GrangeotKeros L, Cointe D. Diagnosis and prognostic markers of HCMV infectionJ. J Clin Virol， 2001,21(3):213221.8孫立人. 人巨細(xì)胞病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展J. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)， 2005, 20(3):284286.9Landini MP, L

37、azzarotto T, Maine GT, et al. Recombinant mono and polyantigens to detect cytomegalovirusspecific immunoglobulin M in human sera by enzyme immunoassayJ. J Clin Microbiol， 1995，33(1

38、0):25352542.【摘要】  目的 為了建立一種快速、簡(jiǎn)便、實(shí)用的可用于育齡婦女血清中巨細(xì)胞病毒(CMV)IgG抗體的篩查方法，并初步探索其應(yīng)用價(jià)值。 方法 建立重組CMV(pp150+52)抗原;以國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所(簡(jiǎn)稱本所)建立的重組CMV(pp150+52)抗原作為包被抗原，700 IU/L作為臨界值，用間接ELISA方法，對(duì)深圳寶安區(qū)1 024例血清標(biāo)本進(jìn)行CMVIgG抗體的檢測(cè)。 結(jié)果 該方法靈敏度為13 IU/L，批內(nèi)變異系數(shù)4.7 %7.0&#

39、160;%，批間變異系數(shù)7.6 %14.4 %，并與SORIN公司生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行了比較，2種方法呈最度相關(guān)，Kappa值為0.82;深圳寶安區(qū)1 024例血清標(biāo)本CMVIgG抗體陽(yáng)性率為93.3 %(955 /1 024)，陰性率為6.7 %( 69/1 024)。 結(jié)論 本所建立的ELISA方法快速、簡(jiǎn)便和實(shí)用，可用于育齡婦女CMVIgG抗體的篩查。 【關(guān)鍵詞】  巨細(xì)胞病毒;IgG抗體;ELISA;篩查;育齡婦女The peacock has fai

40、r feathers, but foul.  Establishment and application of novel method for detecting specific cytomegalovirus IgG antibody ZHANG Meng, AN Lisha, HOU Linpu, et al. NingXia Medical Universi

41、ty, Yinchuan 750004, China【Abstract】 Objective To establish a rapid, serum and convenient method for the screening of cytomegalovirus (CMV) specific IgG antibody in sera samples

42、60;of women of childbearing age, and to evaluate the preliminary significance of application.MethodsThe measurement of CMVIgG was conducted by indirect enzyme linked immunosorbent assay

43、 using recombinant CMVAg (pp150+52) as coating antigen, and 700 IU/L as Cutoff value. ResultsThe specific CMVIgG antibodies in sera were detected in 1 024 women of c

44、hildbearing age in Shenzhen, by using the method established by our study and the ELISA assay kid provided by Diasorin Co. The positive rate, negative rate, sensitivity&#

45、160;of our method was 93.3 %, 6.7 %, and 13 IU/L, respectively. The intraassay coefficient of variation was between 4.7 %-7.0 % and the interassay coefficient of var

46、iation was between 7.6%-14.4 %. The Kappa value between our method and ELISA assay kid provided by Diasorin Co. was 0.82, indicating a good relativity.ConclusionOur ELISA 

47、;assay is a rapid, easy and convenient method and could be used for screening the CMV-IgG specific antibodies among premarital women.【Key words】 Cytomegalovirus; IgG antibody; 

48、;ELISA; Screening; Women of childbearing ageIf you run after two heares, you will ca.  孕婦巨細(xì)胞病毒(cytomegaloviurs, CMV)原發(fā)感染有32 %可感染胎兒，繼發(fā)或再感染只有1.4 %感染胎兒1。有嚴(yán)重臨床癥狀的先天性CMV感染兒多為孕婦原發(fā)感染造成2,3。Fowler等4的研究表明，母親感染過(guò)CMV后再妊娠，先天性CMV感染的危險(xiǎn)性可降低69 %。因此，對(duì)準(zhǔn)備妊娠的育齡婦女進(jìn)行CMVIgG抗

49、體的篩查，通過(guò)這種安全無(wú)害、且簡(jiǎn)便便宜的檢測(cè)，了解育齡婦女的免疫狀況，可使約90 %以上的CMVIgG陽(yáng)性者不必?fù)?dān)心孕后會(huì)發(fā)生原發(fā)CMV感染，也可使小于10 %的CMVIgG陰性者孕后作為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)對(duì)象。對(duì)于妊娠的育齡婦女進(jìn)行CMVIgG篩查是預(yù)防先天性CMV感染一級(jí)預(yù)防措施，這對(duì)防止和減少有嚴(yán)重出生缺陷的先天性CMV感染兒的降生有重要意義。Death when it comes will have no denial.  盡管檢測(cè)CMVIgG抗體的ELISA方法在實(shí)驗(yàn)室中早已建立5，1995年WHO也建立了IgG的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，但至今，中國(guó)國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一的臨界值，中國(guó)

50、也未有國(guó)家批準(zhǔn)的可供篩查用的試劑盒。為此，本研究建立了用重組CMVAg的ELISA檢測(cè)方法，并提出了以700 IU/L作為國(guó)內(nèi)育齡婦女CMVIgG抗體篩查的臨界值的建議。材料與方法He who would search for pearls must dive below(or deep).  一、材料Answer a fool according to his folly.  1.標(biāo)本來(lái)源： 1 024例血清標(biāo)本，2008年1月至5月，來(lái)源于深圳市寶安區(qū)和深圳市計(jì)劃生育專科門診的2040歲的育齡婦女。2.抗原來(lái)源：8種CMV抗原分別來(lái)源于下列

51、機(jī)構(gòu)及個(gè)人。(1)國(guó)家人口和計(jì)劃生育委員會(huì)科學(xué)技術(shù)研究所(簡(jiǎn)稱本所)制備的CMV重組抗原。(2)本所制備的CMV全病毒純化抗原。(3)購(gòu)自Fitzgerald公司的全病毒純化抗原。(4)購(gòu)自深圳菲鵬公司的CMVpp150+pp52重組抗原。(5)購(gòu)自深圳菲鵬公司的CMVpp150重組抗原。(6)購(gòu)自深圳菲鵬公司的CMVpp52重組抗原。(7)購(gòu)自Devatal公司的CMVpp65重組抗原。(8)李欣老師贈(zèng)送的CMVpp65+pp52+pp150重組抗原。The love of money is the root of all evil.  3.主要試劑和儀器：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗

52、人IgG(丹麥DAKO公司)，TMB底物;Thermo Labsystems酶標(biāo)儀(MultiskanAscent, Thermo Fisher Scientific公司)。4.實(shí)驗(yàn)條件的選擇：經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)固相載體(國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口Costar板)、抗原濃度、封閉條件(脫脂奶粉，小牛血清，BSA，PEG)、標(biāo)本稀釋液、穩(wěn)定性試驗(yàn)等的試驗(yàn)，確定了應(yīng)用吸附力強(qiáng)而均勻的進(jìn)口Coning Costar板作為固相載體，本批抗原為12000，用3 %脫脂奶粉封閉，采用本所特制的有血清指示劑的變色標(biāo)本稀釋液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行稀釋。該稀釋液加入血清前為黃色，加入血清

53、后變?yōu)樗{(lán)色，可避免孔內(nèi)漏加標(biāo)本。本稀釋液與國(guó)外(意大利Sorin和德國(guó)試劑)試劑盒提供的標(biāo)本稀釋液比較無(wú)差異。二、本所重組CMVAg(pp150+52)的制備A clear conscience is a sure card.  由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成的3種嵌合DNA(CMVCG1 pp150氨基酸495691;CMVCG2 pp150氨基酸695854，gp52氨基酸297433;CMVCG3 pp150氨基酸595616， 10061048，gp52氨基酸202433)并構(gòu)建于pMD19T克隆載體中，將此構(gòu)建好的3個(gè)克隆載體和pET

54、24a(+)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化入JM109感受態(tài)細(xì)胞中，然后重新抽提質(zhì)粒，分別用限制性內(nèi)切酶XhoI和NdeI進(jìn)行雙酶切，得到線性化的pET24 a(+)質(zhì)粒載體和3個(gè)嵌合DNA片段。再將DNA片段接入質(zhì)粒載體并轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，再將克隆于37 培養(yǎng)8 h后，經(jīng)由聚合酶鏈反應(yīng)，polymerase chain reaction，PCR)和測(cè)序(由北京三博公司完成)的工程菌按150接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再經(jīng)1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h，經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSpolyacrylamide 

55、;gel electrophoresis,SDSPAGE)考染和蛋白質(zhì)印跡(western blot)的方法確定蛋白的表達(dá)。將富集誘導(dǎo)表達(dá)的重組CMVAg(pp150+52)抗原菌體超聲破碎、離心得上清后，通過(guò)PVDF膜分別收集主峰，再經(jīng)Amicon 15YM10超濾脫鹽濃縮后，貯存于pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中。三、檢驗(yàn)程序One cannot be in two place at once.  1.8種CMVAg敏感性比較與選擇：各種抗原按常規(guī)方法包被于固載體

56、，經(jīng)封閉洗滌后應(yīng)用。用1份混合血清經(jīng)濃縮后作為檢測(cè)樣品，從1100開(kāi)始倍比稀釋至16 400。取100 l標(biāo)本稀釋液加入包被孔內(nèi)，再加1 l待測(cè)血清混勻，37 孵育1 h;洗液清洗5次，再加入100 l酶結(jié)合物37 孵育1 h;再次清洗5次，加入顯色劑TMBH2O2 100 l，室溫顯色30 min;加入終止液200 l，于酶標(biāo)儀上(450 nm /620 nm)測(cè)樣品OD值。選擇CMV重組抗原pp52+pp150作為包被抗原。最佳變異系數(shù)(co

57、efficient of variation, CV)分別為3.3 %5.4 %。  2.CMVIgG的最低檢出量：以400 IU/L和0 IU/L兩份標(biāo)本，分別重復(fù)檢測(cè)12次和16次，分別取其平均值減去和加上2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差為最低稀釋度標(biāo)準(zhǔn)。3.精密度：任意選擇不同抗體含量的3份標(biāo)本(10 800 IU/L、3 600 IU/L、1 200 IU/L)，每份標(biāo)本重復(fù)12次試驗(yàn)，計(jì)算其變異系數(shù)。4.穩(wěn)定性試驗(yàn)：將同一批試劑分別放37 存放3、5、7&#

58、160;d后，取出與存放4 的試劑比較其檢測(cè)所得的OD。Still waters have deep bottoms.  5.對(duì)比試驗(yàn)：以Sorin公司生產(chǎn)的CMVIgG ELISA方法為參比方法，與本法進(jìn)行比較，計(jì)算2種方法的相關(guān)性Kappa值。Quality is better than quantity.  K=N(a+b)-(r1·c1+r2·c2)N2-(r1c1+r2c2)a為真陽(yáng)性，b為假陽(yáng)性，c為假陰性，d為真陰性，a+c=c1，b+d=c2，N=a+b+c+d，a+b=r1，c+d=r26.CMVIgG抗體臨界值的確

59、定：用意大利Sorin公司生產(chǎn)的CMVIgG抗體檢測(cè)試劑盒，篩出38份CMVIgG抗體陰性血清，再用本所研制的CMVIgG抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)。以的2.1倍、+2SD、+4SD、+0.3作為臨界值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得CMVIgG的IU/L值。結(jié) 果Great winds blow upon high hills.  一、本所重組CMVAg(pp150+52)的制備本所重組CMVAg(pp150+52)經(jīng)由PCR和測(cè)序，再經(jīng)SDSPAGE考染和WESTERN確定蛋白的表達(dá)，證明工程菌重組CMVAg(pp150+52)構(gòu)建成功。二、重組CMVAg(pp150+52)的質(zhì)量檢測(cè)

60、Know thyself.  1.8種CMVAg敏感性比較與選擇：第4和第5種CMVAg，即CMV重組抗原pp150+pp52和pp150的敏感性較好。同時(shí)對(duì)8種抗原作了精密性分析，結(jié)果顯示，第4和第5種抗原的CV %值分別為3.3 %和5.4 %，優(yōu)于其他6種抗原(CV %值為6.1 %11.3 %),見(jiàn)表1。表1 8種抗原檢測(cè)不同稀釋度血清學(xué)OD值2.最低檢出量：最低檢出量為13290 IU/L。The peacock has fair feathers, but foul.  3.精密度：

61、批內(nèi)變異系數(shù)為4.7 %7.0 %，批間變異系數(shù)則為7.6 %14.4 %，符合ELISA試驗(yàn)<15 %的要求。What I have done is due to patient thought.  4.穩(wěn)定性試驗(yàn)：將同一批試劑分別放37 存放3、5、7 d后，取出與存放4 的試劑用24份標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，比較所測(cè)OD值變化均在10 %以內(nèi)。5.對(duì)比試驗(yàn)：本研究建立的方法與意大利Sorin公司生產(chǎn)的CMVIgG檢測(cè)試劑盒比較，其敏感性為92.3 %，特異性為82.2 %，

62、診斷效率為97 %， Kappa值為0.82，2種方法呈高度相關(guān)。6.CMVIgG抗體臨界值的確定：38份CMVIgG抗體陰性血清平均OD值為0.199，SD為0.076。若用的2.1倍作為臨界值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得CMVIgG抗體含量為440 IU/L;若以+2SD作為臨界值，則為340 IU/L;若以+4SD則臨界值為700 IU/L;若以+0.3為臨界值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的結(jié)果為700 IU/L。根據(jù)本所建立CMVIgG抗體檢測(cè)的目的是對(duì)育齡婦女進(jìn)行篩查，要求一個(gè)不漏的篩查出陰性者，認(rèn)為用700 IU/L作為臨界值比用400

63、 IU/L作臨界值效果更好。表2 本研究建立的方法與參比方法檢測(cè)結(jié)果比較本研究方法Sorin方法(參比方法)陽(yáng)性 陰性陽(yáng)性444(a)7(b)陰性8(c)37(d)God defend me from my friends; form my enemy I can defend myself.  三、臨床應(yīng)用  深圳育齡婦女血清中CMVIgG抗體檢測(cè)，不同的Cutoff值標(biāo)準(zhǔn)，其CMVIgG()和(+)的比例，見(jiàn)表3。表3 1 024例育齡婦女血清中CMVIgG抗體檢測(cè)結(jié)果討 論在用ELISA方法檢測(cè)相應(yīng)抗體時(shí)應(yīng)用

64、的相應(yīng)的包被抗原是決定方法的敏感性和特異性最重要的因素。Weber等6,通過(guò)不同的CMV重組抗原與全病毒純化抗原對(duì)CMVIgG抗體檢測(cè)的比較發(fā)現(xiàn)，其敏感性和特異性沒(méi)有差別。但是，國(guó)內(nèi)外也有報(bào)告79認(rèn)為，重組抗原要比全病毒純化抗原效果好。因?yàn)?，天然的全病毒純化抗原存在難于標(biāo)準(zhǔn)化和培養(yǎng)中潛在細(xì)胞蛋白污染和與其他病毒交叉污染等問(wèn)題，而且多個(gè)重組抗原組合比單一的重組抗原效果好。本所的試驗(yàn)結(jié)果也顯示，用CMV重組抗原效果比全病毒純化抗原要好。因此，本所選擇了CMV重組抗原pp150+pp52作為包被抗原。論文既是探討問(wèn)題進(jìn)行科學(xué)研究的一種手段，又是描述科研成果進(jìn)行學(xué)術(shù)交流的一種工具.  關(guān)于檢

65、測(cè)CMVIgG抗體時(shí)所用的臨界值，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，盡管1995年WHO已發(fā)布了CMVIgG的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，但至今尚未提供有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)品，各國(guó)實(shí)驗(yàn)室仍是用自己的標(biāo)準(zhǔn)。如，意大利Sorin公司的產(chǎn)品用400 IU/L作為臨界值;而羅氏公司則定為700 IU/L，把500700 IU/L作為可疑;而B(niǎo)iotest公司則將臨界值定為陰性平均OD值加0.3作為臨界值;而國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室則多用陰性平均OD值加2SD或均值的2.1倍。國(guó)外尚有將陰性平均OD值加4個(gè)SD作為臨界值的，本所認(rèn)為，選擇700 IU/L作為中國(guó)育齡婦女篩查時(shí)的臨界值較好。因?yàn)椋@種篩查是盡量不要漏掉

66、陰性者而不是篩查陽(yáng)性者，所以用700 IU/L比用400 IU/L更好。本所建立的方法應(yīng)用意大利Sorin公司(FDA認(rèn)證)的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定本所的標(biāo)準(zhǔn)品。通過(guò)對(duì)檢測(cè)方法各個(gè)環(huán)節(jié)的優(yōu)化選擇，特別是采用了獨(dú)特的變色稀釋液和用濾紙片保存標(biāo)準(zhǔn)品，使其保存更加穩(wěn)定。本研究檢測(cè)的結(jié)果與用Sorin試劑對(duì)長(zhǎng)春地區(qū)的1 879例育齡婦女檢測(cè)結(jié)果比較，若以400 IU/L作臨界值，則陰性檢出率為2.9 %，本法為3.8 %;若以700 IU/L作臨界值，陰性檢出率為4.9 %，本法為6.7 %。本法陰性率略高。該方法經(jīng)與FDA認(rèn)證的DiaSorin公司CMVIgG ELISA方法比較呈高度相關(guān)，方法的精密性、靈敏度、穩(wěn)定性均符合ELISA方法的要求。目前，由于進(jìn)口試劑價(jià)格較昂貴，限制了在人群中推廣應(yīng)用，本研究建立的方法價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便適宜大人群的育齡婦女中進(jìn)行CMVIgG抗體的篩查之用。If they say you are good, ask