生化分離技術總結

1、生化分離技術總結A. 蛋白質(zhì)相關氨基酸混合物的分析分離：為了測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成或從蛋白質(zhì)水解液中支取氨基酸，需要對氨基酸混合物進行分離分析工作。(考點不是很多)層析即色層分析也即色譜。主要是基于氨基酸的酸堿性質(zhì)和極性大小1. 分配柱層析：層析柱中的填充物或稱支持劑都是一些具有親水性的不溶物質(zhì)， 如纖維素、淀粉、硅膠等。其實質(zhì)就是流動相把各成分從固定相中連續(xù)提取出來， 并向下移動，結果分配系數(shù)大的成分移動速度大，分配系數(shù)小的成分移動速度小， 因而彼此分離。2. 紙層析：以濾紙為載體用來代替層析柱，利用紙上吸附的水為固定相，與水不 想混合的有機溶劑為流動相從紙上流過，達到液 -液連續(xù)萃取的目的

2、，使物質(zhì)得 到純化或分離。3. 離子交換層析：以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上 的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。4. 薄層層析：快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要實驗技術， 屬固-液吸附色 譜，兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點，一方面適用于少量樣品的分離，另一方面在 制作薄層板時，把吸附層加厚加大，因此，可用來精制樣品，適用于揮發(fā)性較小 或較高溫度易發(fā)生變化而不能用氣相色譜分析的物質(zhì)。5. 氣液層析6. 高效液相層析：高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等

3、流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測， 從而實現(xiàn)對試樣的分析。該方法已成為化學、醫(yī)學、工業(yè)、農(nóng)學、商檢和法檢等 學科領域中重要的分離分析技術。蛋白質(zhì)相關研究方法1. 蛋白質(zhì)相對分子量的測定(1) 滲透壓法測定相對分子質(zhì)量(2) 沉降分析法測定相對分子質(zhì)量(3) 凝膠過濾法測定相對分子質(zhì)量(4) SDS-PAGE法測定相對分子質(zhì)量2. 蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)混合物純化方法性質(zhì)方法規(guī)模大小和體積離心大或小凝膠過濾一般小的透析、超濾*股小的電荷島子交換匿折大或小1離子交換聚焦-般小的極性一 1»小的等電聚焦般小的疏水世廣硫水層析IK小的-股大的離子強度変化

4、一般小的介電常數(shù)變化一般大的特殊結合位點或 結構位點親和層折一般小的Die hgand 層折大或小親和洗脫'大戒小免疫吸附般小的共價層析一般小的3. 蛋白質(zhì)的沉淀：主要是通過引起水化層和電勢的變化，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀.(1) 鹽析法(首推，不易引起蛋白質(zhì)變性)：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性 鹽,使其脫去水化層而聚集沉淀.一般不引起蛋白質(zhì)變性，出去鹽后，可復 溶.(2) 有機溶劑沉淀法：加入一定量的極性有機溶劑，使其脫去水化層以及降低 介電常數(shù)而增加帶電質(zhì)點間的相互作用，致使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉 淀.(3) 重金屬沉淀法：當溶液pH大于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，易于與重 金屬結合成不

5、溶性鹽而沉淀。(4) 生物堿試劑和某些酸類沉淀法：如鞣酸(單寧酸)、苦味酸、鎢酸等。(5) 加熱變性沉淀法：幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固。4. ?？迹?整理資料上)等電點沉淀凝膠過濾層析B. 糖類相關糖鏈的結構分析1. 步驟2. 方法a. 化學方法：（1）高碘酸氧化（2）甲基化分析（3）寡糖順序降解b. 酶學方法：糖苷酶c. 儀器測定方法：紅外光譜IR、激光拉曼光譜、質(zhì)譜 MS核磁共振NMR FAB-MS FAB快速原子轟擊，是一項測定寡糖乃至復雜糖一級結構的有用方 法。C. 脂類相關A.脂質(zhì)的有機溶劑提?。悍菢O性脂質(zhì)（三酰甘油、蠟、色素）用乙醚、氯 仿或苯等從組織中提?。荒ぶ字?、糖

6、脂、固醇）用極性有機溶劑如乙醇 或甲醇提取。B脂質(zhì)的色譜分離：高效液相色譜（HPLC和薄層層析（TLC），二者分辨 率較咼。C.分析：專一性水解及其產(chǎn)物的氣液色譜（GLC或薄層層析（TLC）相結 合的技術常用來測定一個脂的結構。 用質(zhì)譜分析來確定烴鏈長度和雙鍵的位D. 核酸相關核酸的分離.提純和定量測定L DNA的分離核蛋白DNP染色體DNA+組蛋白破碎細胞-i濃鹽溶液抽提一-0. 14mol/L鹽溶液使DNP沉淀 有機溶劑法：氯仿和酚是蛋白質(zhì)變性劑，使蛋白質(zhì)沉淀而與核酸分開； 苯酚抽提，去番白，用乙醛和乙醇沉淀得到純DNA用氯仿-辛醇(或異丙醇)抽提，方法同苯酚.離心后分為兩相：上層水相含D

7、NA冬中層為蛋白質(zhì)，下層有 機相含變性蛋白質(zhì). 蛋白酶水解法：制備大分子DNA,比較溫和，常用蛋白酶水 解后苯酚提取細胞懸液2倍體積SDS (1%)f廣譜蛋白聲降解蛋白底-苯酚抽提去蛋白RNAase去除RNA2. RNA的分離(1)為防止RNA的降解要注意 器皿要經(jīng)過特殊處理如高溫.焦碳酸二乙酯處理等 加入強變性劑和RNAase抑制劑分離方法 酸性脈鹽/苯酚/氯仿抽提 脈鹽氯化艷密度梯度離心 分離po 1 y (A) +mRNA常用寡聚胸腺喀唉:核昔酸 (oligo (dT)親和層析法。3. 測定方法(1) 定磷法樣品灰化：濃硫酸或過氯酸處理生成無機磷，在酸性條件下 正磷酸與相酸作用生成磷韜酸

8、，還原劑還原成相藍，一定范 圍內(nèi)A価與磷含量成正比，計算核酸含量(2) 定糖法RNA戊糖糠醉+地衣酚+三氯化鐵綠色A670DNA脫氧戊糖宛基酮醛+二苯朕藍色鼠盯紫外吸收法：a260核酸的超速離心1、核酸密度的測定氯化艷在離心場中形成線性密/ 當DNA樣品的沉降速度與擴散孩區(qū)帶漂浮于密度樓度的一定位一2、測定DNA中G-C的含量G-C對多的DNA浮力密度大；G-I G-C百分含量與浮力密度呈正H3、溶液中核酸的構象DMA開環(huán)冕域 型UWAp = 0 lx15-；盪軒矗軟花抱囪度梯廢鮮喜心后J»K D7&及魯科親質(zhì)的分粘4. 用于核酸的制備應用決化乙錠-氯化鎧密度梯度平衡超離心，

9、很客易將不同 構象的DNA, RNA和蛋白質(zhì)分開核酸的凝膠電泳1.瓊脂糖凝膠(1)影響遷移率的因素分子大小與分子量的對數(shù)成反比膠濃度反比構象：超螺旋最快線性次之開環(huán)最慢電壓溫度核酸的凝膠電泳1. 瓊脂糖凝膠電泳 染色：熒光染料渙化乙錠插 入堿基對，紫外光照，橙色 熒光。(3) 分子量測定：加標準分子量 對照(4) 樣品回收：切膠條透析袋，電泳，倒置方向，丟棄膠條, 苯酚提取乙醇沉淀.2. 聚丙烯酰胺凝膠電泳孔徑小分析小于一千對堿基不含RNA酶重要名詞解釋1. PCR聚合酶鏈式反應，DNA勺體外擴增技術，包括高溫變性、低溫裂解、適溫延伸三個步驟（利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變

10、成單鏈，低溫（經(jīng)常是 60°C左右）時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合，再調(diào)溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成互補鏈?；?聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。）2. SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。聚丙烯酰胺 凝膠為網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應。電泳過程中，依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量將其 分離開來。3. Western-blot :免疫印跡，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，用抗體作為探針檢測 蛋白質(zhì)的技術。4. Southern blot :進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射 固定，再與相對應結構的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應顯色， 從而檢測特定DNA分子的含量。5. Northern blot :是一種通過檢測RNA勺表達水平來檢測基因表達的方法，通過northern blot的方法可以檢測到細胞在生長發(fā)育特