代謝控制發(fā)酵考試試卷及答案

1、20032004年度生物工程專業(yè)代謝控制發(fā)酵考試試卷及答案（2004年6月）班級姓名得分一、名詞解釋（20分）：1 .Catabolitrepression（2分）分解代謝物阻遏：在培養(yǎng)基中有多種營養(yǎng)物質(zhì)時，微生物先選擇利用易分解利用的營養(yǎng)物質(zhì)，而這種營養(yǎng)物質(zhì)的分解，對分解利用其它營養(yǎng)物物質(zhì)所需酶的合成起阻遏作用。其實質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)cAMP少了。2 Pasteureffect（2分）巴斯德效應(yīng)：微生物細(xì)胞的有氧呼吸抑制了發(fā)酵作用。酵母發(fā)酵酒精時，由于供氧使TCA循環(huán)加快，ATP增加，細(xì)胞內(nèi)能荷增大，反饋抑制和阻遏EMP途徑中關(guān)鍵酶FPK酶，使酒精產(chǎn)量下降。3 .Energycharge（2分）能荷

2、：是細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的一個認(rèn)為假設(shè)參數(shù)，指細(xì)胞內(nèi)含有的核苷酸中相當(dāng)于ATP的數(shù)量百分比。能荷=ATP+1/2ADP/ATP+ADP+AMPX100%4 .Concertedfeedbackinhibition協(xié)同反饋抑制：在代謝途徑中，會產(chǎn)生兩個以上的代謝產(chǎn)物，任何一種代謝產(chǎn)物的積累都不會對代謝途徑的第一步反應(yīng)得酶起抑制作用，只有當(dāng)代謝產(chǎn)物同時過量積累時，才會對代謝途徑的第一步反應(yīng)得酶起抑制作用。5 .Cooperte（synergistic）feedbackinhibition增效性反饋抑制：在代謝途徑中，每種代謝產(chǎn)物只能單獨地、部分地抑制第一步反應(yīng)的酶。當(dāng)它們均過量積累時，對反應(yīng)第一步酶起強

3、烈的抑制作用。此時，抑制作用大于兩種代謝產(chǎn)物單獨抑制作用之和。6 .Metabolicinterlock代謝互鎖：在代謝途徑中，前端反應(yīng)的酶受到與其看似無關(guān)的代謝產(chǎn)物的抑制（阻遏）作用。7 .Analogue-resistentmutant抗代謝結(jié)構(gòu)類似物突變株：對于代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類似物的抗性突變株。代謝產(chǎn)物對代謝途徑有抑制（阻遏作用），使其酶不能合成，而代謝結(jié)構(gòu)類似物存在時，與代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似，起相同作用，使反應(yīng)的酶無法合成，但結(jié)構(gòu)類似物并不減少（因為它不參與蛋白質(zhì)代謝）。其抗性菌株就是在代謝結(jié)構(gòu)類似物存在的情況下，仍能合成代謝產(chǎn)物，使產(chǎn)物大量積累。8 .Antigencarrierlipi

4、d(ACL)抗原載體脂（antigencarrierlipid）簡稱ACL。它是細(xì)菌菇醇，其結(jié)構(gòu)式為：含有11個異戊二烯單位的醇。ACL存在于細(xì)胞膜上，它的長長的非極性燒鏈插在脂肪質(zhì)雙分子層的非極性區(qū)，而分子的極性末端（磷酸根一端）則是游離狀態(tài)，作為細(xì)胞質(zhì)水相中的多糖裝配單位的受體，并且象手臂一樣把它共價結(jié)合著，已在細(xì)菌胞膜內(nèi)側(cè)形成的多糖單位轉(zhuǎn)運到膜的外面，組成肽聚糖脂多糖等細(xì)胞表層的聚糖復(fù)合物。9 .Preferencedsynthsis填空（10分）在下列營養(yǎng)條件下填寫1、2、3、4、當(dāng)無葡萄糖、當(dāng)無葡萄糖、當(dāng)有葡萄糖、當(dāng)有葡萄糖、細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞畫圖并簡述（cAMPK平高、cAMPK平高

5、、cAMPK平高、cAMPK平高、30分）又無乳糖時,有乳糖時，又無乳糖時,有乳糖時，不表達(dá)。大量表達(dá)不表達(dá)。少量表達(dá)1、原核生物細(xì)胞和真核生物細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)的部位。（6分）.UXA優(yōu)先合成：代謝途徑中，產(chǎn)生E,G兩種代謝產(chǎn)物。酶a的活性大于酶bo所以優(yōu)先合成E。E積累后，酶a活性受抑制，C流向G,G積累后又抑制了酶每空白點2.5分。E.coli的乳酸操縱子的表達(dá)方式:圖21原核微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)部位（模式圖）1-可溶性營養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物的跨膜傳送2-代謝途徑的酶催化作用3-酶和載體蛋白的合成圖22真核微生物細(xì)胞的代謝調(diào)節(jié)部位1-可溶性營養(yǎng)物質(zhì)或代謝產(chǎn)物的跨膜傳送2-代謝途徑的酶的催化3-核中

6、進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄4-細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行的翻譯5-細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的跨膜傳送2、阿拉伯糖對E.coli利用阿拉伯糖的酶系合成的誘導(dǎo)機制（10分）A-正調(diào)拄-2S0Pc"aC位點+11_A2_JImRNa闔方淺白阿拉伯糜一加g以arC也點I2勿覆勿彳力勿必以勿畛如UJ當(dāng)沒有阿拉伯籍時,AhC蛋白與一蒲。區(qū)相情合*造或口NA的扭曲.不儺超始而RNA的轉(zhuǎn)錄/阿拉伯靜與謁節(jié)蚩白相結(jié)合，而扁才能與Piw上蕭啟動區(qū)縊臺.活牝RNA*含的圖2-12阿拉伯糖對ara操縱子araC位點的調(diào)控作用當(dāng)大腸桿菌細(xì)胞以阿拉伯糖作為生長所需碳源和能源時，它們產(chǎn)生三種將阿拉伯糖轉(zhuǎn)化為木酮糖的酶。L-AraU1>L-Ru<

7、z3>L-Ru-5-CP-3二D-Xu-5-®1L-阿拉伯糖異構(gòu)酶2核酮糖酸酶35-CP核酮糖差向異構(gòu)酶它們分別是三個基因（B.A.D）編碼的產(chǎn)物。這三個基因在E.coli中是屬于阿拉伯糖操縱子中的一個基因簇，稱為araB.A.D,另外兩個基因araE和araF位于基因簇araB.A.D遠(yuǎn)離的地方，負(fù)責(zé)阿拉伯糖的跨膜運輸?shù)?，araE編碼一種膜蛋白，araF編碼一種位于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜之間的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。與araB.A.D相鄰的是一個復(fù)合的啟動子區(qū)和一個調(diào)節(jié)基因araC,這個調(diào)節(jié)基因的性質(zhì)和我們前邊介紹Lac.operon中的調(diào)節(jié)基因性質(zhì)全然不同。araC的蛋白同時顯示正、負(fù)調(diào)

8、節(jié)因子的功能。3、普通酶和變構(gòu)酶反應(yīng)動力學(xué)性質(zhì)的不同。（6分）天冬氨酸濃度f51圖2-32變構(gòu)酶的典型動力學(xué)曲線ATCase的反應(yīng)動力學(xué)曲線如下：（1Asp和CTP對ATCase酶的激活和抑制作用從S形曲線上可知，都有一個閾值，即Asp濃度超過某個閾值時才顯示抑制作用。隨Asp濃度的增加，ATC酶與底物的親和力協(xié)同性增大。半飽和（飽和速度的一半）所需底物濃度因CTP的存在而增加。CTP能抑制ATC酶活性，但不能全部抑制，增加Asp濃度可以恢復(fù)酶的全部活力,這說明CTP與底物是分別與酶結(jié)合，而不是競爭同一個活性中心。底物濃度飽和而達(dá)到最大反應(yīng)速度Vmax時，不受抑制劑的影響，即當(dāng)顯著提高底物濃度

9、時，看不到抑制作用。5、簡述細(xì)菌二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)（信號傳導(dǎo)）如何調(diào)控基因表達(dá)？（8分）月動子操孤區(qū)塞因位于細(xì)胞質(zhì)膜上的傳感蛋白（sensorprotein）該蛋白質(zhì)具有激酶活性，又稱傳感激酶。應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein）位于細(xì)胞質(zhì)中。傳感激酶在與膜外環(huán)境的信號反應(yīng)過程中本身磷酸化，磷酰基因被轉(zhuǎn)移到應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白上。磷酸化的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白即成為阻遏蛋白，該阻遏蛋白再通過操縱子的阻遏作用進(jìn)行調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。四、請論述和回答（40分）1、如果你分離到一株啤酒酵母，其生長速率是已知生產(chǎn)菌株的二倍，因此你將其用于生產(chǎn)酒精的試驗，但結(jié)果表明，該酵母菌株發(fā)酵葡萄糖的產(chǎn)物是

10、酒精和其他產(chǎn)物的混合物，并且酒精的產(chǎn)量只有現(xiàn)有生產(chǎn)菌株的50%請你根據(jù)本課程所學(xué)過的知識、并結(jié)合微生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)等有關(guān)知識，簡要寫出你將打算如何改進(jìn)你新分離酵母菌株，使其優(yōu)于現(xiàn)有的生產(chǎn)菌株的方案？（10分）答：呼吸抑制發(fā)酵在低糖0.2%酵母比生長速率0.1/h時，還是進(jìn)行呼吸和生長的，而使其生長速率大大提高，因此可以篩選呼吸缺陷型突變株。分離獲得的啤酒酵母活化*接一環(huán)，30c培養(yǎng)24h,5mL酵母完全培養(yǎng)基YEPD30C,16h,5mL酵母完全培養(yǎng)基YEPD對數(shù)生長期一1mL適當(dāng)稀釋100個菌落/平板0.1mLYEPD澳化乙口丫咤黃2030科g/mL處理，致死率達(dá)99%突變頻率為10-3

11、左右YEPD平板上挑選小酵母菌落含有三苯基四氮陛鹽（TTC）和YEPN板上A挑選白色小菌落（正常的和呼吸強的酵母菌，因有細(xì)胞色素酶可還原TTC使菌落變紅，而呼吸缺陷型突變株，不能還原TTC使菌落不變色為白色）A含甘油培養(yǎng)基平板上（不長），丫EPD平板（長出菌落）再進(jìn)行酒精發(fā)酵A挑選高產(chǎn)菌株2、論述代謝控制發(fā)酵的基本思想（路）。（10分）答：（1）黑曲霉生物合成檸檬酸機制wr匐相力?曲.他I而便創(chuàng).入般限修-內(nèi)麗例他物鞠一1-'現(xiàn)務(wù)拙掂隙酸'FJ油畫TB）幻I;舄醒精仙式山”儂;.一Ti用而晚1口？前4池產(chǎn)科AliMm.I產(chǎn),Ajwnw«aaid1BaarBVtBBB!

12、r行心應(yīng)j-A丁一兄衿橫橫尸.-足肌戊一微*內(nèi)概|橙圖3-11黑曲霉自蔗糖生物合成檸檬酸代謝調(diào)節(jié)圖(2)代謝控制育種耐高糖、耐高濃度葡萄糖、a-脫氧葡萄糖R耐高檸檬酸且不利用檸檬酸?？筂nZn、Fe等金屬離子的突變株?？筍HA般變株，增加倒呼吸鏈解除高濃度的ATP的PFK反饋抑制。在葡萄糖為唯一碳源上抱子長得少的HMP弋謝流減弱。挑選形成菌球體系多而小的突變株。耐高溫突變株。(3)發(fā)酵條件溫度35-370C嚴(yán)格控制培養(yǎng)基中的MnZn、Fe,我國的菌株是金屬離子抗性突變株，無需控制。控制低P。氮源、蛋白質(zhì)量控制在0.45%,適量補充(NH4)2SO控制前期長菌pH4.0左右，后期產(chǎn)酸pH2.0以

13、下。溶解氧要高(溶氧分壓90劑足率)3、試設(shè)計篩選高產(chǎn)L-賴氨酸的科研方案（包括出發(fā)菌株的選擇、生物合成途徑的調(diào)節(jié)機制、遺傳標(biāo)記的篩選、發(fā)酵條件的控制等）。（20分）答：1.切斷或減弱支路代謝1 1）切斷支路代謝，Homi或Met-+Thr-。（北微所AS1.299-Hom-As1563,1568,2.5%;上微所黃色短桿菌2305-Hom-H-2,3%;日本黃色短桿菌No2247-Hom-H1013,4.2%）2 2）變換優(yōu)先合成降低HD酶活性O(shè)增強代謝流轉(zhuǎn)向合成LysHom減少，Thr合成減少，解降Thr+Lys的協(xié)同反饋抑制。例：日本.黃色短桿菌No2247NTGA獲得一批Thrs,Me

14、ts突變株，其中一株所產(chǎn)25g/L（2.5%）,此突變株HD僅為野生菌株的1/30。這樣低的HD酶比活性下，不添加Thr和Met也能生長，但若單獨過量添加一種Thr和Met,反而由于過剩的Thr或Met能以致或阻遏本來活力已經(jīng)很低的HD使Thr和Met合成不足而抑制生長，即呈現(xiàn)Thrs或Mets2.解除反饋調(diào)節(jié)選育抗結(jié)構(gòu)類似物突變株Lys的結(jié)構(gòu)類似物：S-2氨基乙基-L-半胱氨酸（簡稱AE。，“氯己內(nèi)酰胺（CCL,廠氟己內(nèi)酰胺（FCD,聚酯基Lys（CBD，甲基賴氨酸（MD,一氨基月桂基內(nèi)酰胺（ALL）,青霉素，桿菌素等。Thr的結(jié)構(gòu)類似物：氨基-3-羥基戊酸（AHr）,鄰甲基蘇氨酸（OMT等

15、Leu結(jié)構(gòu)類似物：.曝陛丙氨酸（a-TA）等（1）解除AK酶的反饋調(diào)節(jié)ThrHxr、Allr、AEC、LysHxr、AHV、ML、CCL、CBL等。（2）解除PS酶的代謝調(diào)節(jié)解除代謝互鎖dLeu-Naa-LeulC2S-Leur2-TarLeuHxr苯酉Is、唾咻s是Leu合成酶（或某酶）抑制劑3 .增加前體Asp反饋抑制（調(diào)節(jié)）并不意味著完全阻止合成反應(yīng)，通過受控制反應(yīng)物的底物積累能拮抗性地克服這種抑制，關(guān)鍵酶AK所催化的底物Asp,AK酶的反應(yīng)速度與底物Asp濃度間的關(guān)系曲線呈S型，隨著Asp的增多，AK酶和Asp親和力協(xié)同性的增大，根據(jù)變構(gòu)酶S型動力學(xué)性質(zhì)，存在底物對反應(yīng)速度發(fā)生影響的閾

16、值，Asp既是反應(yīng)底物，又是反應(yīng)的激活劑，必須控制在閾值以上。當(dāng)濃度飽和而達(dá)到最大反應(yīng)速度時，就不在受反饋抑制，因此為了高產(chǎn)Lys應(yīng)設(shè)法增加前體物Asp濃度以抵消抑制物的影響。（1）選育丙氨酸（Ala-）缺陷（2）選育Asp結(jié)構(gòu)類似物抗性，AspHx（3）設(shè)法增強PC酶活性d采用200-500科g生物素/mL激活PC酶選擇在琥珀酸為唯一碳源生長快速的突變株。FFs選擇丙酮酸?t酶缺陷FFs檸檬酸合成酶活性降低用乙酰CoA激活PC酶（因為乙酰CoA與Asp之間存在平衡合成）采用低糖（4-5%）添加方法可激活PC酶（4）設(shè)法增加（強化）Glu的反饋控制，使Glu優(yōu)先合成4 .選育溫度敏感突變株選育

17、溫度敏感突變株也應(yīng)是Lys發(fā)酵代謝控制育種的有效途徑。其突變位置發(fā)生在亮氨酸合成酶系，高絲氨酸脫氫酶或丙酮酸-L-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶編碼的基因中，均有利于積累Lys。缺陷型。日本戶扳修等人，以乳糖發(fā)酵短桿菌AJll082(AECR+CCL+A1a)為出發(fā)菌株，30c下250dg/mLMNNG誘變處理30分鐘，分離選育30c下生長良好，而在34c不能生長的溫度敏感突變株一一乳糖發(fā)酵短桿菌AJll093(AECR+CCL+A1a-+tems)。同法從已獲得谷氨酸棒桿菌AJ109043株(AECR+A1a)誘變選育AJl099(AECR+A1a+tems),這兩株菌都是34c以上高溫培養(yǎng)時表現(xiàn)為Leu-,

18、添加2.5mg/mLLeu可恢復(fù)正常生長，使用此兩株溫度敏感突變株29-30C培養(yǎng)，發(fā)酵24-48小時期間將溫度提高到34c以上，抑制菌體多余生長，并解除了Leu對PS酶的反饋阻遏，解除代謝互鎖，結(jié)果兩株菌分別積累賴氨酸45g/L和39g/L,對糖轉(zhuǎn)化率分別為45%和39%。5 .Lys生產(chǎn)菌株的定向選育標(biāo)記以谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌、北京棒桿菌、鈍齒棒桿菌等Glu生產(chǎn)菌株為出發(fā)菌，通過誘變定向選育獲得遺傳標(biāo)記應(yīng)為：Hom+A1a+AE&CCLR+CBL+AspHxR+Leu+TAR+Thr-+Met-+tems例如：乳糖發(fā)酵短桿菌AJ11274Lys菌株選育過程如下乳糖發(fā)酵短桿菌AJ

19、15111野生型產(chǎn)Lys0AJ3445TAEC1R產(chǎn)Lys11.6g/LAJ3424tAEC1R+A1a-產(chǎn)Lys33g/LAJ3796tAEC1R+A1a-+CCLR產(chǎn)Lys39g/LAJ3991tAEC1R+A1a-+CCLR+MIR產(chǎn)Lys43g/LAJ11274tAECR+A1a-+CCLR+MIR+FFs產(chǎn)Lys48g/L(四)細(xì)胞融合選育高產(chǎn)Lys菌株Glu產(chǎn)生菌AJ11638DEC（德夸香素）KM（酮丙二酸r）LogphasecellA蛋白月東1%酵母1%NaCl0.5%、蔗糖PH7.0、31.5C0.5%Lys產(chǎn)生菌AJ11082(低葡萄糖消耗速率)aeC、clL、mL、fP5、一L-AlaLogphasecellB0.3g/mLPenicilian（31C,90分鐘）Centrifugation收集菌體，高滲洗滌后，懸浮于高滲溶液中300g/mLLysozyme（31.5C靜止21h）ProtoplantAProtoplantB等量混合centrifugationResuspensioninhypertonicsolution一（pH10.5,0.1MCaCl2）33%PEG6000+0.1MCaCl處理36C,15min進(jìn)行融合，融合反應(yīng)液離心后，收集融合原生質(zhì)體