超敏乙肝詳解

1、附件二項(xiàng)目編號(hào)口上海市醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用能力技術(shù)審核申請(qǐng)書技術(shù)名稱：高靈敏度HBVDNAW毒載量檢測(cè)（PCR法）申請(qǐng)單位：上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院主管部門：上海市普陀區(qū)衛(wèi)生局申請(qǐng)時(shí)間：2015年J月9日上海市醫(yī)學(xué)會(huì)二0年月申請(qǐng)須知一、本申請(qǐng)表的內(nèi)容均為真實(shí)信息；二、嚴(yán)格按照醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法的有關(guān)規(guī)定，建立和完善技術(shù)應(yīng)用的規(guī)章制度和操作規(guī)范，確保醫(yī)療安全；三、注意病例資料的整理和分析，及時(shí)總結(jié)臨床應(yīng)用信息，按期接受評(píng)估；四、如應(yīng)用期間發(fā)生醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法第四十一條所規(guī)定情形的，立即暫停臨床應(yīng)用并上報(bào)市衛(wèi)生局；五、如應(yīng)用期間發(fā)生醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用管理辦法第四十四條所規(guī)定情形的，報(bào)請(qǐng)市衛(wèi)生局

2、決定是否需要重新進(jìn)行醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用能力技術(shù)審核。六、申請(qǐng)的醫(yī)療技術(shù)距上次同一醫(yī)療技術(shù)未通過臨床應(yīng)用能力技術(shù)審核時(shí)間未滿12個(gè)月的不得申請(qǐng)。項(xiàng)目負(fù)責(zé)人閱知并簽章日期填表說明一、本市轄區(qū)內(nèi)凡申請(qǐng)醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，均應(yīng)填報(bào)本表。二、申請(qǐng)書各項(xiàng)內(nèi)容，必須實(shí)事求是，內(nèi)容真實(shí)，表達(dá)要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡要清晰易辨。三、所有填寫入表格的技術(shù)人員必須是取得執(zhí)業(yè)資格，經(jīng)衛(wèi)生行政部門注冊(cè)在本單位的在編或正式聘用人員。四、本申請(qǐng)書一式八份，用A4紙打印。五、電子版申請(qǐng)書一份（刻錄成光盤）。六、本申請(qǐng)書應(yīng)附如下資料：1. 醫(yī)療機(jī)構(gòu)執(zhí)業(yè)許可證副本及其復(fù)印件（加蓋單位公章）2. 醫(yī)療機(jī)構(gòu)醫(yī)學(xué)倫理審查報(bào)告（附：倫理

3、委員會(huì)成員姓名、專業(yè)、職務(wù)、職稱等情況）3. 該技術(shù)的相關(guān)管理制度和風(fēng)險(xiǎn)防范預(yù)案4. 與本項(xiàng)目相關(guān)的醫(yī)療器械或藥品注冊(cè)證書、經(jīng)營(yíng)廠商營(yíng)業(yè)執(zhí)照及經(jīng)營(yíng)許可證復(fù)印件（加蓋公司及醫(yī)療機(jī)構(gòu)公章）5. 國(guó)內(nèi)外有關(guān)該項(xiàng)技術(shù)研究和使用情況的檢索報(bào)告及技術(shù)資料6. 衛(wèi)生行政部門要求的其他相關(guān)文件。七、項(xiàng)目編號(hào)由上海市醫(yī)學(xué)會(huì)填寫。、醫(yī)療機(jī)構(gòu)基本情況名稱上海廿普陀區(qū)中心醫(yī)院性質(zhì)，綜合性醫(yī)院口?？漆t(yī)院其它：醫(yī)院等級(jí)三4及乙等其它：總占地面積27163平方米床位數(shù)1000張?jiān)诰幦藛T1352人單位地址上海市蘭溪路164號(hào)郵政編碼200062醫(yī)療機(jī)構(gòu)主管部門普陀區(qū)衛(wèi)生局醫(yī)療機(jī)構(gòu)聯(lián)系人聯(lián)系電話（手機(jī)

4、目聯(lián)系人康向東聯(lián)系電話（手機(jī)子郵箱pzxywk傳應(yīng)診療科目登記情況HBVDNA定量檢測(cè)相應(yīng)科室設(shè)置情況檢驗(yàn)科分為：生化室、免疫室、細(xì)菌室、分子生物學(xué)室、臨檢室（門診、急診）二、申請(qǐng)單位相關(guān)學(xué)科基本情況（一）項(xiàng)目負(fù)責(zé)人姓名康向東性別男出生年月1959.2所在科室檢驗(yàn)科執(zhí)業(yè)醫(yī)師資格證書編號(hào)畢業(yè)學(xué)校上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)歷博士學(xué)位博士專業(yè)檢驗(yàn)專長(zhǎng)腫瘤免疫工作年限29相應(yīng)技術(shù)工作年限12職稱主任技師獲得職稱時(shí)間20041 .何時(shí)何地開始從事本項(xiàng)目的專業(yè)工作2003年上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科2 .本項(xiàng)目專業(yè)培訓(xùn)（進(jìn)修）情況時(shí)間地點(diǎn)指導(dǎo)醫(yī)師操作例數(shù)參與

5、例數(shù)其他需說明情況個(gè)人專業(yè)工作簡(jiǎn)述含主要科技成就:康向東，男，主任技師，醫(yī)學(xué)（內(nèi)科學(xué)）博士學(xué)位，碩士生導(dǎo)師?，F(xiàn)任上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院檢驗(yàn)科主任兼實(shí)驗(yàn)中心副主任，上海市核學(xué)會(huì)理事，上海醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)分會(huì)委員、上海市免疫學(xué)會(huì)第十屆理事會(huì)免疫技術(shù)專業(yè)委員會(huì)委員，上海市科委2011年度“科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”生物醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)學(xué)研醫(yī)合作項(xiàng)目專家委員會(huì)委員，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)編委會(huì)委員。已在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)7條新基因。主要從事自身免疫性疾病及腫瘤的發(fā)病機(jī)理、診斷及實(shí)驗(yàn)治療的研究，在腫瘤標(biāo)志物的篩選、抗腫瘤抗體的制備上已取得初步研究成果。曾今主持完成了國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、衛(wèi)生部科學(xué)研究課

6、題，上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目等多項(xiàng)課題研究，目前在研課題為上海市科委課題。長(zhǎng)期從事分子生物學(xué)、免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究。近期發(fā)表論著30余篇，SCI論文4篇。擔(dān)任系統(tǒng)性紅斑狼瘡及實(shí)用風(fēng)濕病學(xué)等書的編委。帶教碩士研究生5名，主要研究方向?yàn)橹兴幵谀[瘤治療中的作用機(jī)制研究，其中一篇獲得上海市中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀畢業(yè)論文二等獎(jiǎng)。其他近三年內(nèi)是否發(fā)生與同類技術(shù)有關(guān)的醫(yī)療事故：是（）否（V）（二）學(xué)科人員學(xué)歷結(jié)構(gòu)總計(jì)人數(shù)博士碩士本科?？萍耙韵?0120人員情況姓名性別年齡學(xué)歷職稱專業(yè)從事本專業(yè)年限康向東男56博士教授免疫學(xué)12吳蓉女45本科主任技師微生物學(xué)23鄭瑾女42本科副主任技師免疫學(xué)20相芥芥女28碩士技師分子生

7、物學(xué)3（三）項(xiàng)目所在科室的專用設(shè)備、設(shè)施及工作基礎(chǔ)場(chǎng)所情況獨(dú)立病區(qū)_個(gè)獨(dú)立病床張其他場(chǎng)所情況（包括專用實(shí)驗(yàn)室等）場(chǎng)所名稱面積（平方米）上海臨床檢驗(yàn)中心批準(zhǔn)的臨床基因打增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室120專用設(shè)備情況設(shè)備名稱型號(hào)及產(chǎn)地臺(tái)數(shù)必備設(shè)備全自動(dòng)核酸檢測(cè)工作站QIAsymphonyRGQ,德國(guó)1套應(yīng)有設(shè)備采血管離心機(jī)目刖已開展向類技術(shù)應(yīng)用情況已開展項(xiàng)目（具體名稱）開展時(shí)間（年）工作量（例/年）手術(shù)成功率（%）生存率（%）HBVDNA12000三、開展該項(xiàng)技術(shù)的目的、意義和實(shí)施方案（一）目的和意義（需包括醫(yī)院的總體業(yè)務(wù)量與此項(xiàng)技術(shù)相關(guān)醫(yī)療需求等）：1、實(shí)施項(xiàng)目的意義：（1）項(xiàng)目背景及意義中國(guó)是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，

8、根據(jù)衛(wèi)生部2002年統(tǒng)計(jì)資料顯示，我國(guó)乙型肝炎的現(xiàn)患率為277/萬(wàn)，是美國(guó)的40多倍（年發(fā)病率為95/萬(wàn)）。流行病學(xué)調(diào)查表明，我國(guó)至少有8億人感染過乙型肝炎，人群中的乙肝表面抗原的攜帶率高達(dá)10.34%,即約有1.3億人為乙肝病毒攜帶者，幾乎占全世界總數(shù)的一半，這些乙肝病毒攜帶者中的四分之一最終將發(fā)展成慢性肝炎、肝硬化或原發(fā)性肝癌。全國(guó)1200多萬(wàn)的慢性肝炎病人中，每年死亡人數(shù)達(dá)30萬(wàn)之多，其中約半數(shù)為肝癌。在傳統(tǒng)的慢性乙型肝炎?B療中，通常以HBVDNA<2,000IU/ml作為治療結(jié)束的標(biāo)準(zhǔn)之一，在停藥以后，往往會(huì)出現(xiàn)病毒反跳的狀況，并沒有真正達(dá)到預(yù)期治療的效果，同時(shí)也容易導(dǎo)致病毒變

9、異和耐藥的發(fā)生。由于受常規(guī)的HBV-DNA檢測(cè)靈敏度所限，無(wú)法真正反應(yīng)治療終點(diǎn)病人的狀況。慢性乙型肝炎的治療急需要一個(gè)更靈敏的病毒載量檢測(cè)方法，用于確定治療的終點(diǎn)，最大程度降低治療后病毒反跳以及發(fā)生變異耐藥的可能。（2）項(xiàng)目需求A.臨床需求：“329n=250A HBV DNA 濃度越低.藥物更容易應(yīng)答.治療效果a）高靈敏度HBVDNA定量檢測(cè)對(duì)抗病毒治療的預(yù)后監(jiān)測(cè)：2001-2005年，不斷有學(xué)者在肝病專業(yè)雜志中發(fā)表文章，指出慢性乙肝藥物治越好.耐藥率亦更低。*LaiCL,etal.Hepatology2005;42(suppl1):232AW33A(Abstract92)作者將HBeAg(

10、+)、經(jīng)LdT或LVD治療24周時(shí)不同HBVDNA水平的患者在52周時(shí)做了四項(xiàng)評(píng)估，從上圖可以看出：病毒濃度：24周時(shí)HBVDNA濃度<300copies/ml時(shí)，在52周時(shí)有91%的病人仍然維持在<300copies/ml，但是隨著濃度區(qū)間的升高，在52周HBVDNA濃度能夠下降到300copies/ml的病人比例卻逐漸減少，尤其24周濃度高于104copies/ml的病人只有6%f歸夠下B至300copies/ml以下；HBeAg轉(zhuǎn)換：情況與24周時(shí)HBVDNA的濃度有顯著相關(guān)性，濃度越低，轉(zhuǎn)陰比例越高。<300copies/ml時(shí)，有約47%W人HBeAg轉(zhuǎn)陰，濃度&g

11、t;104copies/ml時(shí)，只有約5%W人的HBeAg轉(zhuǎn)陰；ALT復(fù)常：24周時(shí)濃度越高，ALT復(fù)常率越低；病毒反彈：24周時(shí)病毒濃度低于300copies/ml的病人只有1%發(fā)生反跳，隨著濃度區(qū)間的上升，反跳率逐漸升高，當(dāng)濃度>104copies/ml時(shí)，反彈率達(dá)到14%。綜合以上數(shù)據(jù)，可以看出，治療24周時(shí)，如果病毒載量越低(<300copies/ml),病人的抗病毒治療預(yù)后效果越好。b)高靈敏度HBVDNA定量檢測(cè)在抗病毒治療過程中對(duì)耐藥突變的預(yù)防：在慢性HBAa-positiv«patients (n=159BO -64<200 <3 log &l

12、t;4 log >4 logHBV DNIA level at week 24, copies/mL阿德福韋144周耐藥vs 48周病毒載量HBV DNA lev«l at week 48n copies/mL乙肝治療過程中最大的難題是耐藥的產(chǎn)生,而與治療耐藥相比，預(yù)防耐藥則顯拉夫定明月耐藥行冽周病赤餞董得尤為重要?？焖僖种撇《緩?fù)制至不可測(cè)水平，會(huì)有效降低耐藥的發(fā)生。*YuenMF,etal.Hepatology2001;34(4):785-791*LocarniniS,etal.JHepatol2005;42(Suppl2):17(Abstract36)研究對(duì)24周病毒載量不

13、同濃度分布的HBeAg陽(yáng)性病人進(jìn)行跟蹤，發(fā)現(xiàn)在第29個(gè)月時(shí)，濃度低于檢出限(<200copies/ml)的病人耐藥發(fā)生率只有8%,而濃度高于104copies/ml的病人發(fā)生耐藥的機(jī)率高達(dá)64%。研究同時(shí)對(duì)48周病毒載量1000copies/ml分界的HBeAg陰性病人隨訪，發(fā)現(xiàn)在144周時(shí)耐藥率分別為6%(<1000copies/ml)和49%(>1000copies/ml)。結(jié)果表明，抗病毒治療后病人體內(nèi)病毒濃度越低，發(fā)生耐藥的機(jī)率越低。c)高靈敏度HBVDNA定量檢測(cè)對(duì)肝硬化及肝癌的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：2006年，一項(xiàng)前瞻性研究，跟蹤調(diào)查了臺(tái)灣地區(qū)從1991年到2004年，大約3

14、600名HBsAg-positive的乙肝感染者，分析了HBVDNA,HBeAg,ALT等一系列指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)HBVDNA的水平與肝硬化和肝癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)，是最具有價(jià)值的指標(biāo)，且HBVDNA水平越低，則肝硬化和肝癌風(fēng)險(xiǎn)越低。HBVDNA基線肝硬化相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值肝癌相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)值(copies/ml)(n=3582)(n=3653)<3001.01.0300-9.9x1031.4(0.9-2.2)1.1(0.5-2.3)41.0-9.9x102.5(1.6-3.8)2.3(1.1-4.9)51.0-9.9x105.6(3.7-8.5)6.6(3.3-13.1)，一，一6>1.0x106.5

15、(4.1-10.2)6.1(2.9-12.7)1.IloejeUHetal.Gastroenterology.2006;130:678686.2.ChenCJetal.JAMA.2006;295:6573.d)高靈敏度HBVDNA定量檢測(cè)對(duì)抗病毒治療終點(diǎn)的確認(rèn)：2007年由美國(guó)斯坦福大學(xué)和全球多個(gè)醫(yī)學(xué)院和肝病研究中心共同制訂了“核昔類藥物治療慢性乙型肝炎路線圖”，發(fā)表在臨床腸胃及肝臟病學(xué)雜志，強(qiáng)調(diào)了：定期檢測(cè)血清HBVDNA是評(píng)價(jià)治療療效的基礎(chǔ)定義了不同治療應(yīng)答和監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)(完全應(yīng)答為HBVDNA僉測(cè)為陰性(<60IU/ml)高靈敏HBVDNA定量檢測(cè)試劑對(duì)于治療評(píng)估具有重要的臨床價(jià)值1

16、9乙肝曙磐學(xué)合作盥普?學(xué)叁(AASLD)治打指南"The primary aim of antiviral therapy should be to f白due白a門d maintain 如白rum HBV 口琳 Ht，the lowest 口白呂甘ibl號(hào) 1匕丫已1片慢性乙肝治療 的總體目標(biāo)是 最大限度地長(zhǎng) 期抑能HB% 減輕肝細(xì)胞炎 癥壞死及肌纖 維化，延緩和 減少肝臟失代 償、肝硬化、 HCC及其并發(fā) 癥的發(fā)生The primary airn cf chronic hepat i t i s B treatment i s to 口日 nnanently ssu口口res m

17、 HEV 了金口 Licatiori.A maintained v irological remi sslon （und白t整ct&bl 它HBV DPI伊匕 a sensitive PCR assay） under longterm antiviral therapy in HBeAg- positive 隨著國(guó)際上慢性乙型肝炎(CHB)治療手段和檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，以及相關(guān)臨床研究的不斷深入，高敏的HBVDNA定量檢測(cè)在治療預(yù)后和藥物療效評(píng)價(jià)方面的臨床價(jià)值被越來(lái)越多的臨床醫(yī)生所重視，并被相繼寫入了美國(guó)和歐盟的慢性乙型肝炎治療的指南，用于指導(dǎo)個(gè)體化的治療方案。在國(guó)內(nèi)，越來(lái)越多的臨床醫(yī)

18、生也開始重視高敏HBV病毒載量檢測(cè)的臨床價(jià)值。以上關(guān)于慢性乙肝治療指南中均指出：治療慢性乙肝的目標(biāo)是持續(xù)性抑制HBV病毒的復(fù)制，直至HBVDNA水平減少到未檢出(高敏熒光定量PCR法)。2、醫(yī)院現(xiàn)有總體業(yè)務(wù)量目前我院常規(guī)乙肝DNA檢測(cè)每月有800例，其中低于檢測(cè)水平(500IU/ml)即當(dāng)前意義的“陰性”樣本約占整體樣本的2030%左右，這部份樣本都需要通過更高敏感性的檢測(cè)試劑進(jìn)行測(cè)定，以幫助判定這些樣本中有多少可以滿足臨床指南要求。2012年6月份的中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY-T1182-2010核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑盒規(guī)定了需要使用全程參與的內(nèi)標(biāo)、對(duì)核酸進(jìn)行提取和純化、要求加樣體積不少于2

19、0ul/反應(yīng)體積不低于40ul的要求。2013年5月發(fā)布的乙肝定量檢測(cè)試劑注冊(cè)指導(dǎo)原則也明確了高靈敏HBVDNA檢測(cè)試劑的檢測(cè)下限不得高于30IU/ml。這些要求的提出將高靈敏度HBV檢測(cè)的平臺(tái)提升到一個(gè)前所未有的水平。由于新行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提出HBVDNA核酸需要經(jīng)過提取和純化才能夠被使用，且檢測(cè)下限不能高于30IU/ml,這意味著傳統(tǒng)的煮沸方法已不再適用。目前核酸純化的方法主要有硅膠膜柱提取法和磁珠吸附法，這兩種方法相比較煮沸法而言，操作步驟更為復(fù)雜，一方面增加了人工操作的難度，耗時(shí)較長(zhǎng)，另一方面也容易出錯(cuò)并導(dǎo)致污染的機(jī)率增加，考慮到報(bào)告的及時(shí)性和結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性，需要采用全自動(dòng)方案來(lái)進(jìn)行高靈

20、敏度乙肝病毒的檢測(cè)。（二）實(shí)施方案：1、從臨床應(yīng)用的角度而言，綜合2007年由美國(guó)斯坦福大學(xué)和全球多個(gè)醫(yī)學(xué)院和肝病研究中心共同制訂了核昔類藥物治療慢性乙型肝炎路線圖：2009年美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)（AASLD）,2012年亞太地區(qū)肝病研究協(xié)會(huì)（APASL）,2012年歐洲肝病學(xué)會(huì)（EASL）發(fā)布的慢性乙肝治療指南，我室計(jì)劃在以下幾個(gè)節(jié)點(diǎn)對(duì)病人實(shí)施高靈敏度HBVDNA定量檢測(cè)：抗病毒治療第24周，用于判定治療的應(yīng)答情況及后續(xù)處理方案。對(duì)常規(guī)HBVDNA檢測(cè)結(jié)果為“小于檢出限”的樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)，用于對(duì)病人樣本進(jìn)行精確定量，幫助對(duì)后續(xù)的HBeAg轉(zhuǎn)換、病毒耐藥、ALT復(fù)常進(jìn)行預(yù)后。對(duì)治療結(jié)束后的病人進(jìn)行動(dòng)

21、態(tài)監(jiān)測(cè)，提前預(yù)警病毒的反跳。2、從操作層面來(lái)看，以目前的標(biāo)本量情況，每周開展1-2次檢測(cè)，每次檢測(cè)時(shí)，直接將病人的原始采血管離心后推送到全自動(dòng)核酸提取工作站上，機(jī)器會(huì)自動(dòng)進(jìn)行核酸的提取及體系構(gòu)建，隨后人工把反應(yīng)管安放到熒光定量PCR儀中進(jìn)行檢測(cè)。每次檢測(cè)都需要帶上陰性對(duì)照品、弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品、強(qiáng)陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品、四個(gè)定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品，所有這些樣品都需要經(jīng)歷與臨床標(biāo)本一致的提取和檢測(cè)過程。四、該項(xiàng)醫(yī)療技術(shù)的基本概況（衛(wèi)生行政部門公布的技術(shù)目錄內(nèi)的技術(shù)除外）（一）技術(shù)路線（包括技術(shù)方法、所采用的儀器設(shè)備及技術(shù)的科學(xué)性等）：1 .技術(shù)方法：本項(xiàng)目采用磁珠法核酸純化技術(shù)、PCR熒光探針法、內(nèi)標(biāo)技術(shù)，用于對(duì)臨

22、床血清和血漿中乙型肝炎病毒核酸（DNA）的定量檢測(cè)。其中核酸提取采用磁珠法核酸純化技術(shù)實(shí)現(xiàn)病毒核酸的提取及純化。樣本中加入蛋白酶使病毒裂解并將病毒DNA釋放出來(lái)，磁珠表面包裹有一層二氧化硅，二氧化硅在高離液鹽條件下牛I異性吸附核酸DNA,接著通過洗滌步驟有效去除二價(jià)陽(yáng)離子和蛋白質(zhì)等PCR反應(yīng)抑制物，最后用洗脫液（低鹽）將病毒DNA從磁珠上洗脫下來(lái)，完成純化。經(jīng)過純化的病毒DNA不含蛋白質(zhì)、核酸酶和其他雜質(zhì)。檢測(cè)分析采用臨床上應(yīng)用最為成熟的熒光定量PCR法。通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增HBV基因組目的片段，擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)將特異性熒光探針?biāo)舛尫虐l(fā)光基團(tuán)，通過檢測(cè)及分析自由發(fā)光基團(tuán)受激發(fā)產(chǎn)生的熒光信號(hào)可實(shí)現(xiàn)

23、對(duì)HBV病毒DNA的定量檢測(cè)。操作過程中，將內(nèi)對(duì)照參入到每個(gè)樣本中，通過內(nèi)對(duì)照對(duì)整個(gè)工作流程進(jìn)行監(jiān)控，包括病毒核酸純化步驟、PCR反應(yīng)體系構(gòu)建步驟、核酸擴(kuò)增與檢測(cè)步驟等，可有效防止產(chǎn)生假陰性檢測(cè)結(jié)果。2 .設(shè)備：QIAsymphonySP/AS全自動(dòng)樣本處理工作站：可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)病毒核酸純化、PCR反應(yīng)液配制及上樣Rotor-GeneQ熒光定量PCR儀：實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增3 .先進(jìn)性、科學(xué)性：I自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)核酸提取和PCR反應(yīng)體系構(gòu)建，減少人為誤差，提高核酸純度 標(biāo)準(zhǔn)化的工作流程，消除了檢測(cè)平臺(tái)差異導(dǎo)致的結(jié)果偏差 提供從樣本到結(jié)果完整解決方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)現(xiàn)可靠溯源 原始樣品管直接上機(jī)，節(jié)省時(shí)間I預(yù)裝試

24、劑盒，減少人為操作，防止交叉污染 最低檢出限：20IU/ml,符合新的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 試劑盒配備內(nèi)標(biāo)，全程監(jiān)控核酸純化、擴(kuò)增及檢測(cè)，可有效防止假陰性4 .性能指標(biāo)：適用樣本類型：血清、血漿上樣量：200ulI最低檢測(cè)限：20IU/ml 線性范圍：40-1.1E8IU/mlI可檢測(cè)基因型：A-H,8個(gè)基因型I精密度CV:<5% 適用平臺(tái)：QIAsymphonyRGQI通量：一次運(yùn)行72份檢測(cè)，7小時(shí)完成144份檢測(cè)結(jié)果（二）該項(xiàng)技術(shù)的國(guó)內(nèi)外應(yīng)用情況（包括該項(xiàng)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外的應(yīng)用時(shí)間、范圍、例數(shù)及獲得相關(guān)監(jiān)督管理部門的準(zhǔn)入情況）I臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)早在2009年已被衛(wèi)生部列為醫(yī)療二類技術(shù)目錄中，因

25、此在中國(guó)應(yīng)用已非常成熟。I超敏乙肝檢測(cè)的項(xiàng)目，早在2007年由美國(guó)斯坦福大學(xué)和全球多個(gè)醫(yī)學(xué)院和肝病研究中心共同制訂了“核昔類藥物治療慢性乙型肝炎路線圖”后各大指南就已經(jīng)要求乙肝檢測(cè)限需實(shí)現(xiàn)高精度，如2009年美國(guó)肝病學(xué)會(huì)就指出：清除HBV的診斷標(biāo)準(zhǔn)其中之一，是采用敏感的PCR試劑，HBVDNA未檢出； 中國(guó)在2013年國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委關(guān)于印發(fā)醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床檢驗(yàn)項(xiàng)目目錄中，就將高敏度乙型肝炎病毒DNA定量檢測(cè)列入了該目錄中。Mn i ttc-nIWliBElftt««Mfflztuxa£131電，ttfffundAA>ItWElMAD'J ” “ '

26、;ClfflNIMM4*工&tl中華人民A和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)一 Nation卸 Heaflh arnd Family Plwiiwig 6mm49ion 卅 w Poafrie1 Republic Off 1cllmafiiWt：f + DHfl i| rimi htbtfliHriDI-P生計(jì)生基JEF琲費(fèi)用M網(wǎng)發(fā)出檢機(jī)%111錄刈M版J -*lili|l.|b|SBn：I 1 Eal'mitat JHULi111£版原20L3 9If芾看,Fi附，克鞘/工生h'Lj 衛(wèi)士計(jì)生專：-備川生/下世異川衛(wèi)生日為詁點(diǎn)鬟語(yǔ)瓶成物肋次F,構(gòu)* t厭，評(píng)L種曲

27、出*勢(shì)*管理胭打衛(wèi)去戲 ；MMI年號(hào)5，良里雄杷專家甘麗年蟲布的醫(yī)H機(jī)構(gòu)性或世帽SFIFIW送卜/博訐.心中/ 幽/乩的性出檢tut月目錄t劭碑荒】，tea st r生計(jì)生£Htt«nEirE目f極3 mit處你力.自*h執(zhí)療，息衛(wèi)生篙印龍的長(zhǎng)擰利村第為帶管好nn京t :已內(nèi)發(fā)二%： IB0 弘 HltRt-SLFiUff巾劃的同屬國(guó)園E近看愧就出ft珀和衛(wèi)豐蓄翰床H總中心.身躥和.!王王 1:'Ll.Hliaik1高昭物炎睛痛鯽幽鮮檢測(cè)za肝炎病翡因分型勃Z型肝炎艇前山變熊泅一乙型肝炎痛鄙HMYMg變異檢斑乙型肝氏病毒iHM核小區(qū)啟動(dòng)子（酢）變舁碗Z型布腦基因黑瞅

28、一丙型肝霹毒網(wǎng)撼護(hù)增定性威一丙跚炎耦耐核窗護(hù)增定鱷澧:!£生訃生費(fèi)初福日觸H（三）適應(yīng)癥：1 .慢性乙型肝炎抗病毒治療第24周病毒學(xué)完全應(yīng)答狀態(tài)（HBV-DNA<60IU/ml）的確定：以評(píng)估抗病毒藥物的療效和選擇正確的后續(xù)治療方案。2 .慢性乙型肝炎抗病毒治療白終點(diǎn)判定：依據(jù)HBV-DNA定量結(jié)果不可測(cè)（高敏PCR方法）來(lái)判定患者停止治療。3 .慢性乙型肝炎抗病毒治療的預(yù)后：對(duì)常規(guī)HBVDNA檢測(cè)結(jié)果為“小于檢出限”的樣本進(jìn)行復(fù)測(cè)，用于對(duì)病人樣本進(jìn)行精確定量，幫助對(duì)后續(xù)的HBeAg轉(zhuǎn)換、病毒耐藥、ALT復(fù)常進(jìn)行預(yù)后。4 .慢性乙型治療結(jié)束后期的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)：及時(shí)發(fā)現(xiàn)低水平HBVD

29、NA病毒的突破和反彈。現(xiàn)有國(guó)內(nèi)傳統(tǒng)乙肝DNA檢測(cè)的試劑盒最低只能檢測(cè)至500-1000IU/ml,無(wú)法真正確定治療治療第6個(gè)月病毒學(xué)完全應(yīng)答狀態(tài)（HBV-DNA<60IU/ml）和準(zhǔn)確判定治療終點(diǎn)和停藥時(shí)機(jī)，從而使患者耐藥及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加。用該方法監(jiān)測(cè)乙肝DNA濃度在1000IU/ml以下的病人用藥后的療效評(píng)估，確定慢性乙肝治療達(dá)到真正終點(diǎn)。（四）禁忌癥:無(wú)（五）不良反應(yīng):無(wú)（六）該項(xiàng)技術(shù)的療效判定標(biāo)準(zhǔn)及評(píng)估方法：1 .判定標(biāo)準(zhǔn)：1）內(nèi)標(biāo)：從提取開始向每個(gè)樣本中加入大自然中不存在的、與HBVDNA目標(biāo)序列相近似的一段基因序列，競(jìng)爭(zhēng)性的參與核酸提取、純化、加樣和擴(kuò)增的整個(gè)過程，監(jiān)測(cè)并防止擴(kuò)

30、增結(jié)果假陰性的發(fā)生。2）室內(nèi)質(zhì)控：每次實(shí)驗(yàn)中加入相同批次的陰性對(duì)照、弱陽(yáng)性質(zhì)控、強(qiáng)陽(yáng)性質(zhì)控，三個(gè)質(zhì)控品結(jié)果均需要符合質(zhì)控體系結(jié)果要求。當(dāng)其中某一個(gè)結(jié)果不符合時(shí)，需要暫停發(fā)放報(bào)告，并對(duì)實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行檢查與確認(rèn)，解決問題后重新檢測(cè)。3）室間質(zhì)評(píng)：每年參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心或者上海市臨床檢驗(yàn)中心組織的兩次室間質(zhì)評(píng)，結(jié)果達(dá)標(biāo)2 .評(píng)估方法：參考上海市臨床檢驗(yàn)中心的新項(xiàng)目申請(qǐng)要求，驗(yàn)證包括：正確度、靈敏度、批內(nèi)精密度、批間精密度、檢測(cè)下限、線性范圍等。1）精密度：a）實(shí)驗(yàn)方案：批內(nèi)和批間精密度：取兩個(gè)臨床樣本（5次方與3次方），實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)儀器運(yùn)轉(zhuǎn)正常，質(zhì)控在控。批內(nèi)精密度為一天內(nèi)在儀器上重復(fù)檢測(cè)20次；批

31、間精密度為每次在儀器上檢測(cè)5次，4個(gè)工作日完成，上述實(shí)驗(yàn)均保留原始數(shù)據(jù)，并計(jì)算SD和CV值。b）結(jié)果判斷：批內(nèi)精密度v10%,批間精密度CV值v15%,則認(rèn)為該項(xiàng)目達(dá)到檢測(cè)要求。2）正確度（三選一）a）方法學(xué)比對(duì)實(shí)驗(yàn)方案：取20份其他醫(yī)院檢測(cè)過的樣本，重新提取檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與其他醫(yī)院的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。結(jié)果判斷：如果兩樣本檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值的差異在一個(gè)LOG值范圍內(nèi)，80%的樣本符合則認(rèn)為該項(xiàng)目正確度符合要求。b） 對(duì)已知靶值物質(zhì)的檢測(cè)（室間質(zhì)評(píng)樣本）實(shí)驗(yàn)方案：以最近兩次參加衛(wèi)生部臨檢中心或上海市臨檢中心EQA室間質(zhì)量回報(bào)的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)回饋的報(bào)告進(jìn)行相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。結(jié)果判斷：計(jì)算上報(bào)的數(shù)據(jù)與靶值的

32、偏倚，在規(guī)定的范圍內(nèi)；如果衛(wèi)生部或上海臨檢中心回饋的報(bào)告顯示相應(yīng)項(xiàng)目狀態(tài)為通過，則認(rèn)為該項(xiàng)目正確度符合要求。c） 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)（國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品或國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品）實(shí)驗(yàn)方案：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行提取檢測(cè)，將檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的靶值范圍進(jìn)行比較。結(jié)果判斷：檢測(cè)結(jié)果在靶值的規(guī)定范圍內(nèi)，則認(rèn)為該項(xiàng)目正確度符合要求。3）線性范圍（可報(bào)告范圍）驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)方案：樣本的選擇：病人樣本。系列濃度樣本：將高濃度（7次方）的樣本按照1:10倍比稀釋連續(xù)7個(gè)濃度（采用陰性血清稀釋至6次方、5次方、4次方、3次方、100IU、40IU、20IU）每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3、次。樣本保存條件：-20C。實(shí)驗(yàn)前確認(rèn)儀器運(yùn)轉(zhuǎn)正常，質(zhì)控在控，保

33、留原始數(shù)據(jù)。結(jié)果判斷：取三次檢測(cè)結(jié)果的平均值進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)性R2>0.98則認(rèn)為線性通過驗(yàn)證。4）最低檢出限（靈敏度）驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)方案：取一濃度為1-5X103iu/ml的樣本，將樣本稀釋到20,40IU/ml（采用陰性血清稀釋），分別檢測(cè)10次，10次都能檢出的最小濃度為該項(xiàng)目的最低檢出限。(七)與同種疾病的其他診療技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)、療效、費(fèi)用及療程比較：當(dāng)前高靈敏度HBVDNA檢測(cè)項(xiàng)目與常規(guī)的乙肝DNA定量檢測(cè)相比較如下：1、風(fēng)險(xiǎn)：高靈敏度HBVDNA檢測(cè)項(xiàng)目相比于常規(guī)HBVDNA檢測(cè)項(xiàng)目而言，增加了核酸提取與純化的步驟、增加了內(nèi)標(biāo)質(zhì)控品、提高了自動(dòng)化程度，在控制假陰性、人為誤差和實(shí)驗(yàn)室污染等方面具有更好的風(fēng)險(xiǎn)防范措施；2、療效與療程：常規(guī)HBVDNA檢測(cè)的主要用途在于對(duì)抗病毒治療前期病人體內(nèi)血液中HBVDNA濃度進(jìn)行測(cè)定，并在后續(xù)的第12周進(jìn)行動(dòng)態(tài)跟蹤。在第24周的病毒監(jiān)測(cè)中由于其靈敏度只能達(dá)到5001000IU/ml,無(wú)法正確給出是否達(dá)到治療終點(diǎn)(<60IU/ml)的評(píng)價(jià)。對(duì)于后續(xù)的預(yù)后，包才HBVDNA濃度的反跳、HBeAg轉(zhuǎn)陰、ALT復(fù)常、病毒耐藥預(yù)測(cè)、肝硬化及肝癌的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)都無(wú)法給出正確的評(píng)價(jià)。高靈敏度HBVDNA檢測(cè)突破了常規(guī)HBVDNA檢測(cè)的極限，可以有效判斷抗病毒治療終點(diǎn)并對(duì)病人的療效和預(yù)后給