HPLC測(cè)定紅曲中7種核苷類成分的含量

1、HPLC測(cè)定紅曲中7種核苷類成分的含量HPLC測(cè)定紅曲中7種核苷類成分的含量 1 儀器與試藥 1.1 儀器JA11002B電子分析天平0.011100 g上海周密科學(xué)儀器有限公司、BSA224S0.0001220 g和BT25S0.0000121 g型分析天平德國(guó)Sartorius公司、智能超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司、Agilent 1100型高效液相色譜儀美國(guó)Agilent、Avium 611VF超純水機(jī)德國(guó)Sartorius公司。1.2 試藥胞苷購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司批號(hào)：150515；肌苷、尿嘧啶、胸苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、腺苷購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定討論院批號(hào)分別為：14066

2、9-202106，100469-202102、101215-202101、140661-202103、110886-202102、110879-202103。檢測(cè)過(guò)程中使用的試劑均為色譜純及超純水。2 方法與結(jié)果2.1 色譜條件接受RP-HPLC法，色譜柱Shiseido C184.6 mm×250 mm，5 m；乙腈A-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀B二元線性梯度洗脫：09 min，0%A；940 min，0%8%A；流速1 mL/min；柱溫30；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；進(jìn)樣量20 L。接受超純水作為陰性對(duì)比溶液。見(jiàn)圖1。2.2 對(duì)比品溶液制備分別周密稱取核苷類對(duì)比品適量，加超純

3、水制備成尿嘧啶50 g/mL、胞苷61.4 g/mL、次黃嘌呤55.7 g/mL、腺嘌呤468.7 g/mL、肌苷114.3 g/mL、胸苷52.9 g/mL、腺苷111.4 g/mL的溶液，備用。2.3 供試品溶液制備粉碎紅曲，過(guò)40目篩，稱取粉末3 g，周密稱定，加入具塞錐形瓶中，周密加入超純水30 mL，超聲提取20 min，過(guò)濾。錐形瓶及紅曲殘?jiān)眠m量超純水洗滌，過(guò)濾，合并濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，超純水定容至容量瓶刻度，搖勻，0.45 m微孔濾膜過(guò)濾，備用。2.4 線性關(guān)系考察周密吸取尿嘧啶1 mL、胞苷2 mL、次黃嘌呤2 mL、腺嘌呤1 mL、肌苷1 mL、胸苷1 mL和腺苷

4、2 mL對(duì)比品溶液，制備成系列混合對(duì)比品溶液，其濃度范圍為尿嘧啶1.005.00 g/mL、胞苷3.0815.35 g/mL、次黃嘌呤2.7813.95 g/mL、腺嘌呤9.3746.87 g/mL、肌苷4.5822.86 g/mL、胸苷1.065.29 g/mL、腺苷4.4122.28 g/mL，周密吸取20 L混合對(duì)比品溶液注入高效液相色譜儀，按“2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以濃度為橫坐標(biāo)X，峰面積為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回來(lái)方程。結(jié)果顯示，對(duì)比品濃度在肯定范圍內(nèi)與峰面積的線性關(guān)系良好。見(jiàn)表1。2.5 周密度試驗(yàn)周密吸取20 L混合對(duì)比品溶液，其濃度為尿嘧啶5.00 g/mL、胞苷15.

5、35 g/mL、次黃嘌呤13.95 g/mL、腺嘌呤46.87 g/mL、肌苷22.86 g/mL、胸苷5.29 g/mL和腺苷22.28 g/mL，及同一供試品溶液，根據(jù)“2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)6次，記錄標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液、供試品中核苷色譜峰面積。尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷對(duì)比品溶液RSD為0.61%、1.47%、1.44%、0.51%、0.61%、0.77%、0.63%；供試品溶液RSD為1.46%、1.42%、1.24%、1.49%、1.08%、1.10%、1.52%。提示儀器周密度良好。2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)分別于0、2、4、6、8、10 h周密吸取20 L同一

6、供試品溶液，根據(jù)“2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。在10 h內(nèi)，供試品溶液中尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷峰面積RSD分別為1.73%、1.46%、1.16%、1.68%、1.11%、1.67%、0.89%。提示供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。2.7 重復(fù)性試驗(yàn)周密稱取同一批次樣品6份，根據(jù)“2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，并根據(jù)“2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄結(jié)果。尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷含量RSD分別為1.33%、1.62%、1.55%、1.47%、1.87%、1.56%、1.45%，提示重復(fù)性良好。2.8 加樣回收率周密稱取1.5 g已

7、知含量的紅曲樣品6份批號(hào)：170205，加入肯定量的核苷對(duì)比品，根據(jù)“2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，并根據(jù)“2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算含量及加樣回收率。加樣回收率結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果說(shuō)明該方法精確性良好。2.9 紅曲中7種核苷類成分含量測(cè)定取不同批次的紅曲樣品，根據(jù)“2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備紅曲供試品溶液，并根據(jù)“2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表3。3 商量本討論考察了Shiseido C184.6 mm×250 mm，5 m、Agilent TC184.6 mm×250 mm，5 m和Thermo C184.6 mm×250 mm，5 m色譜柱

8、，其中Shiseido C184.6 mm×250 mm，5 m色譜柱的分別效果及峰型最優(yōu)?？疾炝肆魈氏嘁译?、甲醇及水、甲酸水、磷酸水的不同組合和比例，結(jié)果乙腈-0.05mol/L磷酸二氫鉀作為流淌相組合的分別度及峰型最優(yōu)。本討論分別對(duì)超聲提取及回流提取進(jìn)行了考察，超聲提取法對(duì)紅曲樣品的所用提取時(shí)間最短，紅曲中提取出的核苷類含量高，因此本討論提取方法為超聲提取法。提取溶劑的選擇上，考察了不同體積比的甲醇-水系統(tǒng)，結(jié)果超純水作為提取溶媒時(shí)，核苷類化合物出峰多，且紅曲中所檢測(cè)的核苷含量高。 本討論紅曲中7種核苷尿嘧啶、胞苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、肌苷、胸苷和腺苷在肯定濃度范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系r 0.9995，方