基因克隆與表達(dá)分享資料

1、1蛋白原核表達(dá) 衛(wèi)文強(qiáng) 2015.122 目的基因-T 表達(dá)載體 酶切， 膠回收，連接 轉(zhuǎn)化到克隆用細(xì)胞（Top10) 提質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證 轉(zhuǎn)化到表達(dá)用細(xì)胞（BL21（DE3)） 誘導(dǎo)表達(dá) SDS-PAGE3DNA中的雜質(zhì)如中的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、醇、SDS、EDTA等都會(huì)影響酶的活性。等都會(huì)影響酶的活性。 1）. DNA的純度的純度 影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素影響限制性?xún)?nèi)切酶活性的因素2）. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾GATC中的中的A）；）； dcm甲基化酶（修飾甲基化酶（修飾CCA/TGG的的C）。）。43）. 溫度 不同的限制性?xún)?nèi)

2、切酶的最適反應(yīng)溫度不不同的限制性?xún)?nèi)切酶的最適反應(yīng)溫度不同。同。大多數(shù)是大多數(shù)是37 oC，少數(shù)要求，少數(shù)要求40-65 oC。是影響限制酶活性的重要因素。是影響限制酶活性的重要因素。4）. 緩沖液(Buffer) 商品化的限制酶一般都帶有專(zhuān)用緩沖液。商品化的限制酶一般都帶有專(zhuān)用緩沖液。MgCl2、NaCl/KCl： 提供提供Mg2+ +和離子強(qiáng)度；和離子強(qiáng)度； Tris-HCl： 維持維持pH； 二硫蘇糖醇（二硫蘇糖醇（DTT）：保持酶穩(wěn)定性；）：保持酶穩(wěn)定性； 牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的穩(wěn)定；等：有助于酶的穩(wěn)定；巰基乙醇巰基乙醇：保持酶的穩(wěn)定性，防止酶失活。5 用時(shí)在冰上操

3、作； 取酶用干燥、滅菌、新的槍頭 酶用量不能超過(guò)酶切總體積的10%； 多種酶進(jìn)行酶切時(shí)，先低鹽后高鹽先低鹽后高鹽緩沖液；關(guān)心小關(guān)心小貼士告貼士告訴你訴你 使用時(shí)注意事項(xiàng)：使用時(shí)注意事項(xiàng)：6連接、轉(zhuǎn)化與重組子鑒定連接、轉(zhuǎn)化與重組子鑒定1、連接、連接7（1）必須是兩條）必須是兩條雙鏈雙鏈DNA。（2）DNA 3 端有游離的端有游離的-OH， 5端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（端有一個(gè)磷酸基團(tuán)（P）。）。（3）需要）需要能量能量動(dòng)物或噬菌體中：動(dòng)物或噬菌體中：ATP 大腸桿菌中：大腸桿菌中： NAD+ +（2）. 連接條件連接條件8 ATP：反復(fù)凍熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，連接緩沖液宜分裝； 單價(jià)離子

4、：150-200mM NaCl，提高連接效果； PEG：5%以下可以提高連接效率連接效果最好在37 ，但形成的互補(bǔ)不穩(wěn)定;最佳連接溫度：最佳連接溫度：12-16 ，較好的連接效果，互補(bǔ)又較穩(wěn)定;2）連接）連接溫度：溫度：3）反應(yīng)液中的成分：反應(yīng)液中的成分：9目的或作用：目的或作用：4）插入片段與載體的濃度比例）插入片段與載體的濃度比例 載體載體DNA與外源與外源DNA的分子摩爾比通的分子摩爾比通常為常為13左右，甚至左右，甚至110 或更高或更高。增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減增加插入片段與載體的接觸機(jī)會(huì)，減少載體自我連接的現(xiàn)象。少載體自我連接的現(xiàn)象。10 化學(xué)法（化學(xué)法（CaClCaCl2

5、 2法法) )：轉(zhuǎn)化原理：是Ca2+2+與細(xì)菌外膜磷脂在低溫下形成液晶結(jié)構(gòu)液晶結(jié)構(gòu)，后者經(jīng)熱脈沖經(jīng)熱脈沖發(fā)生收縮作用，使細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙細(xì)胞膜出現(xiàn)空隙，質(zhì)?；駾NA重組分子便可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)（感受態(tài)細(xì)胞）。2、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化11影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素影響轉(zhuǎn)化率的主要影響因素: : 載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺載體本身的性質(zhì)及其空間構(gòu)象：超螺旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高；旋構(gòu)象轉(zhuǎn)化率最高； 插入片段的大?。翰迦肫卧酱螅D(zhuǎn)插入片段的大小：插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低；化效率越低； 受體細(xì)胞的類(lèi)型及預(yù)處理；受體細(xì)胞的類(lèi)型及預(yù)處理； 轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。轉(zhuǎn)化方法：電擊法高于化學(xué)法。12ROPROISal IB

6、amH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR3224363 bpori 限制性酶切圖譜法限制性酶切圖譜法3、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定13質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的提取的提取基因組DNA質(zhì)粒DNA 質(zhì)粒具有自主復(fù)制質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能在子和轉(zhuǎn)錄能力，能在子代細(xì)胞中保持恒定的代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜拷貝數(shù)，并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。帶的遺傳信息。 質(zhì)粒質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小從因子，大小從1-200kb不等，為雙鏈、閉環(huán)不等，為雙鏈、閉環(huán)

7、的的DNA分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)分子，并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。胞中。14質(zhì)粒質(zhì)粒DNA提取方法：提取方法：堿裂解法堿裂解法、煮沸法、煮沸法、 SDS法等法等 堿裂解法堿裂解法原理：原理： 在堿性堿性條件下，雙連DNA氫鍵斷裂，結(jié)構(gòu)破壞變性，環(huán)狀超螺旋質(zhì)粒不充分不充分變性變性。在中性條件下變性質(zhì)?；謴?fù)原來(lái)構(gòu)型，而線(xiàn)性大分子細(xì)菌DNA不能復(fù)性呈不溶物而經(jīng)離心除去。15 抽提出質(zhì)粒的構(gòu)型：抽提出質(zhì)粒的構(gòu)型：1 1）超螺旋質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA: :在提取質(zhì)粒過(guò)程中，在提取質(zhì)粒過(guò)程中，超螺旋超螺旋DNADNA占大部分。占大部分。2 2）開(kāi)環(huán)質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA：如果質(zhì)粒：如果質(zhì)粒DNA

8、DNA兩條鏈中兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，形成松馳型的環(huán)狀分子，稱(chēng)開(kāi)環(huán)分子，稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNADNA。3 3）線(xiàn)狀質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA：如果質(zhì)粒：如果質(zhì)粒DNADNA的兩條鏈在的兩條鏈在同一處斷裂，則形成線(xiàn)狀同一處斷裂，則形成線(xiàn)狀DNADNA。16抽提出的質(zhì)粒三種構(gòu)型電泳結(jié)果： 1）開(kāi) 環(huán) 2）線(xiàn) 狀 3）超螺旋+-電泳方向電泳方向17凝膠電泳技術(shù)凝膠電泳技術(shù)電泳目的：對(duì)核酸分子進(jìn)行分離和檢測(cè)電泳目的：對(duì)核酸分子進(jìn)行分離和檢測(cè)18 凝膠分辨DNA的能力： 瓊脂糖 聚丙烯酰胺凝膠 濃度 分辨范圍

9、(kb) 濃度 分辨范圍(bp) 0.3% 5-60 3.5 1000-2000 0.6% 1-20 5 90-500 0.7% 0.8-10 8.0 60-400 0.9% 0.5-7 12 40-200 1.2% 0.4-6 15 25-160 1.5% 0.2-3 20 6-100凝膠濃度凝膠濃度: 濃度濃度大大，篩孔小，適合，篩孔小，適合小小分子電泳；分子電泳； 濃度濃度小小，篩孔大，適合，篩孔大，適合大大分子電泳分子電泳凝膠濃度的選擇：取決于待檢測(cè)的凝膠濃度的選擇：取決于待檢測(cè)的DNA的大小的大小原來(lái)如此！19電泳緩沖液電泳緩沖液 pH值：偏堿性，帶負(fù)電荷值：偏堿性，帶負(fù)電荷 離子濃

10、度：離子濃度高離子濃度：離子濃度高 電流大電流大 發(fā)熱快發(fā)熱快膠溶解膠溶解 種類(lèi)：種類(lèi)：TAE （Tris+EDTA+醋酸）醋酸）:電流大，易產(chǎn)生離子富集電流大，易產(chǎn)生離子富集TBE （Tris+ EDTA+硼酸）硼酸）:緩沖能力最強(qiáng)緩沖能力最強(qiáng)TPE （Tris+ EDTA+磷酸）磷酸）:緩沖能力低緩沖能力低TNE （Tris+ EDTA+醋酸鈉）醋酸鈉）20pET表達(dá)載體表達(dá)載體21222324pET表達(dá)載體的啟動(dòng)子是表達(dá)載體的啟動(dòng)子是T7噬菌體基因噬菌體基因10啟動(dòng)子（啟動(dòng)子（T7啟動(dòng)啟動(dòng)子），需要子），需要T7RNA聚合酶才能轉(zhuǎn)錄。聚合酶才能轉(zhuǎn)錄。 T7RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制十分有效并具

11、有選擇性：充分誘導(dǎo)聚合酶轉(zhuǎn)錄機(jī)制十分有效并具有選擇性：充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；在非誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有的細(xì)胞資源都用于表達(dá)目的蛋白；在非誘導(dǎo)條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉(zhuǎn)錄。條件下，幾乎可以使目的基因完全處于沉默而不轉(zhuǎn)錄。 T7RNA聚合酶基因插入由大腸桿菌聚合酶基因插入由大腸桿菌lacUV5啟動(dòng)子控制、啟動(dòng)子控制、DE3溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上。溶原狀態(tài)下的大腸桿菌染色體上。25 T7 表達(dá)系統(tǒng) 轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)理 化學(xué)誘導(dǎo)型 噬菌體 DE3 是 l 噬菌體的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 啟 動(dòng)子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被

12、插入其 int 基因中 用噬菌體 DE3 的溶源菌作為表 達(dá)載體的宿主菌，調(diào)控方式為 化學(xué)誘導(dǎo)型，類(lèi)似于 Lac 表達(dá) 系統(tǒng)。 T7 RNA 聚合酶基因 lac 啟動(dòng)子E.Coli （DE3）T7 啟動(dòng)子 目的基因T7 RNA 聚合酶IPTG誘導(dǎo)2627基本原理 SDS-PAGESDS-PAGE技術(shù)是根據(jù)技術(shù)是根據(jù)SDSSDS能使蛋白質(zhì)變性解能使蛋白質(zhì)變性解聚成肽鏈并與肽鏈側(cè)鏈以一定比例結(jié)合成聚成肽鏈并與肽鏈側(cè)鏈以一定比例結(jié)合成SDSSDS肽鏈復(fù)合體，從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷肽鏈復(fù)合體，從而掩蓋了肽鏈本身所帶電荷（SDSSDS帶負(fù)電），并消除了蛋白質(zhì)分子間的形狀帶負(fù)電），并消除了蛋白質(zhì)分子間

13、的形狀差異，再結(jié)合差異，再結(jié)合PAGEPAGE技術(shù)（根據(jù)分子的形狀、電技術(shù)（根據(jù)分子的形狀、電荷、分子量綜合差異來(lái)分離不同分子的技術(shù)）荷、分子量綜合差異來(lái)分離不同分子的技術(shù)）來(lái)分離不同分子量蛋白質(zhì)或測(cè)定定蛋白質(zhì)分子來(lái)分離不同分子量蛋白質(zhì)或測(cè)定定蛋白質(zhì)分子量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。28基本步驟 制備分離膠 制備濃縮膠 上樣并電泳 凝膠板剝離與染色脫色 結(jié)果分析29出現(xiàn)明顯界面時(shí)，出現(xiàn)明顯界面時(shí)，分離膠凝聚完成分離膠凝聚完成（ minh）倒出水，并用濾紙倒出水，并用濾紙吸干吸干v制備分離膠制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。30加入濃縮膠溶加入濃縮膠溶液液 pH 6.8v制備濃縮膠制備濃縮膠樣梳需一次平穩(wěn)插入樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳梳口處不得有氣泡口處不得有氣泡,梳底需梳底需水平。水平。插入樣品梳插入樣品梳31v上樣及電泳上樣及電泳32凝膠板剝離與染色 電泳結(jié)束后，撬開(kāi)玻璃板，將凝