大腸菌群檢測(cè)

1、曹雙：請(qǐng)綜合看看各種方法，比較一下，有些內(nèi)容是一致的，有些是每種方法不同于其他方法的，注意比較。第一篇（藍(lán)色部分為說明和附錄，去掉這部分剩下的為連續(xù)文件）大腸桿菌檢驗(yàn)方法SN0169-92出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法GB/T4789.61994食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)（這兩個(gè)檢驗(yàn)方法另有完全的PDF文件，見文件夾）以SN標(biāo)準(zhǔn)方法為例，進(jìn)行說明。樣品制備：以無(wú)菌操作取25g樣品，放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代替）。稀釋樣品勻液根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，用稀釋劑將樣品勻

2、液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，如10*-2、10*-3、10*-4。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不得超過15min。附：這是一種9管MPN法測(cè)定方法，什么是MPN法（最近似法）？MPN4簡(jiǎn)介發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：212TheMostProbableNumberMethodInthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediumisinocuTheMostProbableNumberMethodInthefollowingexample,asetof3tubesofanallpurposebrothmediu

3、misinoculatedfromeachoftheten-folddilutions,witheachtubebeinginoculatedwithoneml.Afterincubation,thenumberoftubesshowinggrowthisrecorded.Asthesucceedingdilutionsweremade,theorganismsweredilutedtosuchanextentthatnonewereintheinoculaofsevenofthetubes(markednegative).Inordertoestimatethenumberoforganis

4、mspermlofthesamplewhichwouldcausethiskindofgrowthresponse,welocatethethreesetsoftubeswhichshowdilutionoftheorganisms"toextinction"-i.e.,thosetubeswhichwereinoculatedfromthe102,10-3and10-4dilutions.附錄1g檢樣中最近似值（MPN/（補(bǔ)充件）以0.1、0.01、0.001g各用3管。陽(yáng)性管數(shù)II陽(yáng)性管數(shù)I1MPN|1MPN0.10.010.001|0.10.010.001|0001&

5、lt;3|20019.100113|20111400216I20212000319I203126010I3121011501116.1|21112001219.2|212127013112|2133402016.2|220121021I9.3|221128022I121222I35023I16122314203019.4|230129031I131231I36032I161232I440331I19112331I5310101I3.6|301012310117.2|301139102I111302I64103I151303I9511017.3|310143111I111311175112I15

6、1312I120113I191313I160120I111320I93121|15|321|150122|20|322|210123|24|323|290130|16|330|240131|20|331|460132|24I332|1100133|29I333|>1100LST和EC初步篩選：對(duì)每個(gè)樣品，選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯，每管接種1mL。將接種管置于36±1C培養(yǎng)48±2h0觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48±2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培

7、養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.5±0.5C水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)48±2h。附：LST肉湯、EC肉湯有些什么？LST肉湯和EC肉湯中有什么？(發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣)一EC肉湯月桂基硫酸鹽胰蛋白(月示)(LST)肉湯氯化鈉5.0g3號(hào)膽鹽或混合膽鹽1.5g乳糖5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀(K2HPO4)2.75g磷酸氫二鉀(K2HPO4)4.0g磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.75g磷酸二氫鉀(KH2PO4)1.5g月桂基硫酸氯化鈉5.0g鈉0.1g蒸儲(chǔ)胰蛋白(月示)或胰酪陳(Trypticase)20g胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g蒸儲(chǔ)水

8、1000.0mL1000.0mL將以上成分溶解于蒸儲(chǔ)水中，分裝將各成分溶解于蒸儲(chǔ)水中分裝到有倒立發(fā)酵管的16mrW150mm試管（管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵20mrW150mm試管中，每管10mL121c高壓滅菌15min。最終pH6.8±0.2。管），每管8mL121c高壓滅菌15min,最終H6.9+0.1EMB平板：取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB）平板,36±1C培養(yǎng)24±2ho檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。如有典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落；如無(wú)典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，

9、移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上,36±1C培養(yǎng)1824h。附：怎樣進(jìn)行平板劃線分離？平板劃線分離的方法發(fā)布日期：2010-09-01瀏覽次數(shù)：2021.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法CufmPlaiAMeUnodiScml-quancllDllva4sMinllMrve品3日wwmpiMl曲曲nFoifl裾*1EHH1"平板劃線示例平板劃線示例發(fā)布日期：2010-09-01瀏覽次數(shù)：612平板戈U線示例Thisisanexampleofagoodstre平板劃線示例Thisisanexampleofagoodstrea

10、kforisolationusingthe"fourcorners"method.ThesmallcolonieshereareofStaphylococcusepidermidisThisisnotagreatstreakplatebutitisserviceable,asthereareafewisolatedcolonies.Thisplatewouldhavebeenbetteriftheloophadbeenflamedbetweeneachsector.ThisisanexampleofhowNOTtostreakforisolation.Scribblingi

11、snotstreaking,andmostlikelywillnotresultinisolatedcoloniesThisplateisolatestwodifferentcolonies:Escherichiacoli(thecream-colored)colonies,andSerratiamarcescens(theredcolonies).(粘質(zhì)沙雷菌)ThisisaplatewithMicrococcusluteus滕黃微球菌，theyellowcolonies.Whilethisisagoodstreakforisolation,theplatehasbeencontaminat

12、ed.Thelarge"fuzzy"coloniesarefungalcolonies.Thelidmayhavebeenliftedtoofarawayfromtheplatewhilestreaking,oradraftmayhavecausedthesporestofallintotheplate.EMB平板原理及照片EMBF板照片及原理發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：238Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethylenebl

13、ue(Thisimageillustratesthegrowthofgram-negativebacteriathatcannotfermentlactoseoneosinmethyleneblue(EMB)agar.EMBagarcontainsbilesaltsanddyeswhichinhibitgrowthofgram-positivebacteria.GrowthonEMBagarisausefuldiagnostictooltodistinguishbetweenlactosefermentersandnonfermenterswhichwillappearcolorless.Th

14、isimagecanbeusedtodescribetheuseofmetabolisminidentificationofbacteria.SalmonellaandShigella,bothnonlactosefermentingpathogens,canbedistinguishedfromthemorecommonintestinalflorawhichfermentlactose.Growthofdaclo&enan-fftrnienterASMMicrobeLibrafy.ckrgJohnsonlnfemb-an.jpgLactoseNonfermenteronEMBPat

15、Johnson,PalmBeachCommunityCollege,LakeWorth,Fla.,USA生化試驗(yàn)：將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。1色氨酸肉湯：在36±1C培養(yǎng)24±2h后，加Kovacs氏試齊1J0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。附：靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片靛基質(zhì)試驗(yàn)原理及照片發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：290靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn)：某些細(xì)菌能分解蛋白陳中的色氨酸，生成口引噪?？谝氲拇嬖诳捎蔑@色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)?？谝肱c對(duì)二甲基氨基靛基質(zhì)（Indole）試驗(yàn)：某些細(xì)菌能分解蛋白月東中的色氨酸，生成口引喋?？谝┑拇嬖诳捎?/p>

16、顯色反應(yīng)表現(xiàn)出來(lái)?？谝┡c對(duì)二甲基氨基苯醛結(jié)合，形成玫瑰口引喋，為紅色化合物。試驗(yàn)方法：將待試純培養(yǎng)物小量接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基管，于36±1C培養(yǎng)24h時(shí)后，取約2ml培養(yǎng)液，加入Kovacs氏試劑23滴，輕搖試管，呈紅色為陽(yáng)性，或先加少量乙醛或二甲苯，搖動(dòng)試管以提取和濃縮靛基質(zhì)，待其浮于培養(yǎng)液表面后，再沿試管壁徐緩加入Kovacs氏試劑數(shù)滴，在接觸面呈紅色，即為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)證明靛基質(zhì)試劑可與17種不的靛基質(zhì)化合物作用而產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)，若先用二甲苯或乙醛等進(jìn)行提取，再加試劑，則只有靛基質(zhì)或5-甲基靛基質(zhì)在溶劑中呈現(xiàn)紅色，因而結(jié)果更為可靠。口班1Ht”Eliaainle|Hilrveladfl

17、leASMMErobuUbiiry.ang&JohnsonMargaret(Peg)Johnson,MesaCommunityCollege,Mesa,Ariz.,USAThisimagedepictstheresultsofnegativeandpositiveindoletests.TheindoletestisfrequentlyemployedtodistinguishKlebsiellaorEnterobacterbacteria(indolenegative)fromEscherichiacoli(indolepositive).ThepresenceofE.coliisu

18、sedbypublichealthofficialsasanindicatoroffecalcontaminationoffoodandwatersupplies.Priortothistest,Enterobacteraerogeneswasusedtoinoculateonetryptonebroth,whileanothertryptonebrothwasinoculatedwithEscherichiacoli.Thetwobrothswerethenincubatedfor24handmixedwithKovasreagent(p-dimethylamino-benzaldehyde

19、).Tryptonebrothisrichintheaminoacidtryptophan.Tryptophanase,anenzyme,iscapableofcleavingtryptophanandproducingindole,pyruvicacid,andammonia.IndolecanbedetectedbythedevelopmentofaredcolorafteraddingKovasreagent.Organismsthatdonotproducetryptophanasewillbeindolenegative,asnoindolewillbepresenttoreactw

20、iththeKovasreagent2MR-VP培養(yǎng)基：在36土1C培養(yǎng)48±2h。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13m由100mm試管中，力口5%蔡酚乙醇溶液0.6mL,40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MR-VP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。附：MR-VP試驗(yàn)原理及照片MR-VFU驗(yàn)原理及照片發(fā)布日期：2010-05-13瀏覽次數(shù)：224甲基紅(MethylRed)試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖

21、代謝的途徑甲基紅(MethylRed)試驗(yàn)?zāi)c桿菌科各菌屬都能發(fā)酵葡萄糖，在分解葡萄糖過程中產(chǎn)生丙酮酸，進(jìn)一步分解中，由于糖代謝的途徑不同，可產(chǎn)生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性產(chǎn)物，可使培養(yǎng)基PH值下降至pH4.5以下，使甲基紅指示劑變紅。V-P試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌在葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中能分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸縮合，脫竣成乙酰甲基甲醇，后者在強(qiáng)堿環(huán)境下，被空氣中氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白豚中的魔基生成紅色化合物，稱VP(+)反應(yīng)。大腸桿菌：MR+/VP-3Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36土1c培養(yǎng)96h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。附：枸椽酸鹽利用試驗(yàn)原理及斜面顯色照片枸椽酸鹽試驗(yàn)原理及斜面照片發(fā)布日期：

22、2010-05-13瀏覽次數(shù)：136枸椽酸鹽試驗(yàn)：某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸錢作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于枸椽酸鹽試驗(yàn)：某些細(xì)菌能利用枸椽酸鹽作為碳源，及磷酸錢作為氮源，將枸椽酸鹽分解為二氧化碳，培養(yǎng)基反應(yīng)后成堿性，由于指示劑的作用，培養(yǎng)基變?yōu)樘m色。說明：SN標(biāo)準(zhǔn)所用培養(yǎng)基是肉湯培養(yǎng)基，且不加指示劑，因此，只能觀察是否渾濁生長(zhǎng)。Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫鏤鈉（NaNH4HPO44H2O）1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g硫酸鎂（MgSO47H2O）0.2g枸椽酸鈉（含2H2O）3.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分溶解于蒸儲(chǔ)水中，分裝試管

23、，每管10mL,121c高壓滅菌15min。最終pH6.7±0.2。4LST肉湯：于36tC培養(yǎng)48±2h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。5革蘭氏染色：取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：靛基質(zhì)1IMR11VP|枸椽酸鹽|鑒定（型別）1II1111十1+典型大腸桿菌一1+111非典型大腸桿菌111II1111十1+I-|+|典型中間型一11+11|十|非典型中間型1II1111-I-I+I+I典型產(chǎn)氣腸桿菌+II+I+I非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型，表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線分離，必要時(shí)做重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果報(bào)

24、告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗(yàn)為十十或十，再根據(jù)LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查MPN表，報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。第二篇大腸菌群測(cè)定的操作細(xì)則（MPN法）大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。該菌主要來(lái)于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。食品中大腸菌群數(shù)系以100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示。1設(shè)備和材料1.1 溫箱：36±1Co1.2 冰箱:04C。1.3 恒溫水浴:44.585C。1.4 天平。1.5 顯微鏡。1.6 均質(zhì)器或乳

25、缽。1.7 平皿:直徑為90mm。1.8 試管。1.9 吸管。1.10 廣口瓶或三角燒瓶：容量為500mL。1.11 玻璃珠：直徑約5mm。1.12 載玻片。1.13 酒精燈。1.14 試管架。2培養(yǎng)基和試劑1.1 乳糖膽鹽發(fā)酵管：按GB4789.28中4.9規(guī)定。1.2 伊紅美藍(lán)瓊脂平板：按GB4789.28中4.25規(guī)定。1.3 乳糖發(fā)酵管：按GB4789.28中4.10規(guī)定。1.4 EC肉湯：按GB4789.28中4.11規(guī)定。1.5 磷酸鹽緩沖稀釋液：按GB4789.28中3.22規(guī)定。1.6 生理鹽水。1.7 革蘭氏染色液：按GB4789.28中2.2規(guī)定。3操作步驟5.1 檢樣稀釋

26、5.1.1 以無(wú)菌操作將檢樣25mL（或g）放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)（瓶?jī)?nèi)予置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000-10000r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。5.1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成1:100的稀釋液。5.1.3 另取1mL滅菌吸管，按上條操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。5.1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，

27、每個(gè)稀釋度，接種3管。5.2 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酉?管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進(jìn)行。5.3 分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36±1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18-24h,然后取出,觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。5.4 證實(shí)試驗(yàn)在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1-2個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置36±1C

28、溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。5.5 報(bào)告根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每100mL（g）大腸菌群的MPN值。4糞大腸菌群（faecalcoliform）5.1.0 用接種環(huán)將所有產(chǎn)氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物（見3.2條）轉(zhuǎn)種于EC肉湯管內(nèi)，置44.5M.2C水浴箱內(nèi)（水浴箱內(nèi)的水面應(yīng)高于EC肉湯液面，培養(yǎng)24±2h,經(jīng)培養(yǎng)后，如所有EC肉湯管均不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為陰性；如有產(chǎn)氣者，則將所有產(chǎn)氣的EC肉湯管分別轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置培養(yǎng)18-24h,凡平板上有典型菌落者，則證實(shí)為

29、糞大腸菌群陽(yáng)性。4.2結(jié)果報(bào)告根據(jù)證實(shí)為糞大腸菌群的陽(yáng)性管數(shù)，查MPN僉索表，報(bào)告每100mL（g）糞大腸菌群的MPNfi。第三篇由口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexportSN016992代替ZBX09002-861主題內(nèi)容與適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗(yàn)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于出口食品的檢驗(yàn)。2設(shè)備和材料2.1吸管：1mL,具0.1mL刻度；5mL和10mL,具1mL刻度。2水浴箱：44.585C。培養(yǎng)箱

30、：36±C,44.50.5C。冰箱：05c和-15-20C。均質(zhì)器。乳缽和研棒。平皿：直徑90mm。天平：感量0.1g。顯微鏡。稀釋并氏:100mL、200mL和500mL三角燒瓶及廣口瓶。玻璃珠：直徑約5mm。菌落計(jì)數(shù)器。3培養(yǎng)基及試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白(LST)肉湯。煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯。EC肉湯。伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。色氨酸肉湯。MR-VP培養(yǎng)基。Korser氏枸椽酸鹽肉湯。結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)。Butterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液。生理鹽水。革蘭氏染色液。Kovacs氏靛基質(zhì)試劑。甲基紅指示劑。Vogesproskauer(VP)試劑。

31、4樣品制備以無(wú)菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用75%乙醇在開口處擦拭后取樣。若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)將冷凍樣品置于-15C保存；非冷凍而易腐的食品，應(yīng)置于4c冰箱保存。檢驗(yàn)前冷凍樣品可于25c18h內(nèi)解凍，或在45c以下15min內(nèi)解凍。不同食品樣品勻液的制備液體食品以滅菌吸管取樣25mL放入裝有225mL稀釋劑的滅菌玻璃瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠),以30cm幅度、于7s內(nèi)振搖25次（或以機(jī)械振蕩器振搖）,制成1:10的樣品勻液。固體和半固體食品以無(wú)菌操作取25g樣品，放入裝有225mL稀釋劑的滅菌均質(zhì)杯內(nèi)，于8000r/min均質(zhì)12min,制成1:10樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代

32、替）。稀釋樣品勻液根據(jù)對(duì)樣品污染情況的估計(jì)，用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，如10-2、10-3、10-4.。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不得超過15min。5大腸菌群的測(cè)定大腸菌群MPN值的測(cè)定對(duì)每個(gè)樣品，選擇適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個(gè)稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯，每管接種1mL。將接種管置于36±C培養(yǎng)48=2ho觀察試管的產(chǎn)氣情況：檢查倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。如所有LST肉湯管均未產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)一步作證實(shí)試驗(yàn)。大腸菌群的證實(shí)試驗(yàn)將所有產(chǎn)氣管用直徑為3mm

33、的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。置BGLB肉湯管于36tC培養(yǎng)48i2h。記錄所有BGLB肉湯管的產(chǎn)氣管數(shù)。結(jié)果報(bào)告：按BGLB肉湯產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表（見附錄B（補(bǔ)充件）報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。6糞大腸菌群測(cè)定用直徑為3mm的接種環(huán)將所有48i2h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管培養(yǎng)物移種于EC肉湯管中。將所有接種的EC肉湯管在30min內(nèi)放入帶蓋44.585C水浴箱內(nèi)，培養(yǎng)24i2h。水浴箱的水平面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面。應(yīng)以已知為44.5C產(chǎn)氣陽(yáng)性的大腸桿菌和44.5C不產(chǎn)氣的產(chǎn)氣腸桿菌或其他大腸菌群細(xì)菌作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。記錄EC肉湯管的產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試

34、驗(yàn)陽(yáng)性；不產(chǎn)氣管為糞大腸菌群試驗(yàn)陰性。結(jié)果報(bào)告：按產(chǎn)氣管數(shù)，查MPN表報(bào)告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的MPN值。7大腸桿菌測(cè)定將6.3條中的EC肉湯管繼續(xù)培養(yǎng)24h,取其產(chǎn)氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍(lán)（EMB）平板，36±1C培養(yǎng)24+2ho檢查平板上有無(wú)具黑色中心有光澤或無(wú)光澤的典型菌落。如有典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)典型菌落；如無(wú)典型菌落，則從每個(gè)平板上至少挑取2個(gè)可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，36+C培養(yǎng)1824h。將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進(jìn)行生化試驗(yàn)。色氨酸肉湯：在36±C培養(yǎng)24i2h后，力口Kovacs氏試劑0.2

35、0.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質(zhì)陽(yáng)性反應(yīng)。MRVP培養(yǎng)基；在36±1C培養(yǎng)48i2h。以無(wú)菌操作移取培養(yǎng)物1mL至13mm<l00mm試管中，力口5%a蔡酚乙醇溶液0.6mL,40%氫氧化鉀溶液0.2mL和少許肌酸結(jié)晶，振搖試管后靜置2h,如出現(xiàn)伊紅色，為VP試驗(yàn)陽(yáng)性。將MRVP培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng)48h滴加5滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，若變黃色則為陰性反應(yīng)。Koser氏枸椽酸鹽肉湯：于36±C培養(yǎng)96h記錄有無(wú)生長(zhǎng)。LST肉湯：于30+C培養(yǎng)48立h,觀察試管中是否產(chǎn)氣。革蘭氏染色：取18h營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。

36、大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下:靛基質(zhì)MR+-+-+-+-+-+VP枸椽酸鹽鑒定（型別）-典型大腸桿菌-非典型大腸桿菌+典型中間型+非典型中間型+典型產(chǎn)氣腸桿菌+非典型產(chǎn)氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應(yīng)類型,表明培養(yǎng)物可能不純，應(yīng)重新劃線分離，必要時(shí)做重復(fù)試結(jié)果報(bào)告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無(wú)芽抱桿菌，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，IMViC試驗(yàn)為+-或-+-,再根據(jù)LST肉湯陽(yáng)性管數(shù)查MPN表，報(bào)告每克（毫升）樣品中大腸桿菌MPN值。8大腸菌群固體培養(yǎng)基測(cè)定法8.1樣品制備同第4章。計(jì)數(shù)選取適宜的三個(gè)連續(xù)稀釋度的樣品液，每個(gè)稀釋度接種兩個(gè)滅菌平皿，每皿1mL。另取lmL稀釋劑加入一個(gè)滅菌平皿中，作空白對(duì)照

37、。將冷至45i05c的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）1015mL傾注于每個(gè)平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加34mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36HC培養(yǎng)1824h。選用有30150個(gè)菌落的平板，計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為0.5mm或更大。證實(shí)從VRBA平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落，移種于BGLB肉湯管內(nèi)，36±C培養(yǎng)24h和48h,觀察產(chǎn)氣情況。將出現(xiàn)產(chǎn)氣的肉湯管判為大腸菌群陽(yáng)性。對(duì)形成菌膜的陽(yáng)性管，應(yīng)進(jìn)行革蘭氏染色，以便排除革蘭氏陽(yáng)性桿菌。結(jié)果報(bào)告經(jīng)最后證實(shí)為陽(yáng)性

38、（產(chǎn)氣，革蘭氏陰性桿菌）的試管百分比乘以于8.2.5條中計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4樣品稀釋液lmL,在VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100X6/10X104/g(mL)=6.0¥05/g(mL)附錄A培養(yǎng)基和試劑（補(bǔ)充件）A1月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯胰蛋白或胰酪月東（Trypticase）20g5.0g氯化鈉乳糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）2.75g磷酸二氫鉀（KH2P04）2.75g月桂基硫酸鈉0.1g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成

39、分溶解于蒸儲(chǔ)水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的20m/150mm試管中，每管10mL。121c高壓滅菌15min。最終pH6.810.2。A2煌綠乳糖膽鹽（BGAB）肉湯蛋白月東10.0g乳糖10.0g牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200.0mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸儲(chǔ)水將蛋白月東乳糖溶于約500mL蒸儲(chǔ)水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸儲(chǔ)水中，pH7.07.5）,用蒸儲(chǔ)水稀釋到975mL,調(diào)pH7.4。再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL,用蒸儲(chǔ)水補(bǔ)足到1000mL,用棉花過濾后，分裝到20mmel50mm試管（管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管）中，每管1

40、0mL。121c高壓滅菌15min。最終pH7.2i0.1。A3EC肉湯胰蛋白或胰酪20.0g3號(hào)膽鹽或混合月1鹽1.5g乳糖5.0g磷酸氫二鉀（KH2P04）4.0g磷酸二氫鉀（KH2P04）1.5g氯化鈉5.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將以上成分溶解于蒸儲(chǔ)水中，分裝16mme150mm試管（管內(nèi)有倒立的小發(fā)酵管），每管8mL。121c高壓滅菌15min,最終pH6.9W。1。A4伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）蛋白月東10.0g乳糖10.0g磷酸氫二鉀（KH2P04）2.0g瓊脂15.0g伊紅丫水溶性）0.4g或2%水溶液20mL美藍(lán)0.065g或0.5%水溶液13mL蒸儲(chǔ)水1000.0mL在1000

41、mL蒸儲(chǔ)水中煮沸溶解蛋白月東、磷酸鹽和瓊脂，加水補(bǔ)足至原量。分裝于三角燒瓶中。每瓶100mL或200mL,高壓滅菌15min。最終pH7.1±0.2。使用前將瓊脂融化，于每100mL瓊脂中加5mL滅菌的20%乳糖水溶液、2mL的2%伊紅丫水溶液和1.3mL0.5%的美藍(lán)水溶液，搖勻，冷至4550c傾注平皿。A5營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面牛肉膏3.0g蛋白陳5.0g瓊脂15.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分加于蒸儲(chǔ)水中，煮沸溶解。分裝合適的試管。121c高壓滅菌15min。最終pH7.3±0.1。滅菌后擺成斜面?zhèn)溆?。A6色氨酸肉湯胰月東或胰酪月東10.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL加熱攪拌溶

42、解胰月東或胰酪月東于蒸儲(chǔ)水中。分裝試管，每管5mLo121c高壓滅菌15min。最終pH6.910.2oA7MR-VP培養(yǎng)基月東7.0g葡萄糖5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）5.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分溶于蒸儲(chǔ)水中，分裝試管，121c高壓滅菌15min,最終pH6.9±0.2。A8Koser氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫鏤鈉（NaNH4HPO4?4H2O）1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.2g枸椽酸鈉（含2H2O）3.0g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將各成分溶解于蒸儲(chǔ)水中，分裝試管，每管10mL,121c高壓滅菌15min。最終pH6.7±0.2。A9結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）蛋白臍7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化鈉5.0g膽鹽或3號(hào)膽鹽1.5g中性0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂1518g蒸儲(chǔ)水1000.0mL將上述成分溶于蒸儲(chǔ)水中，靜置幾分鐘，充分?jǐn)嚢瑁{(diào)至pH7.4±0.1o煮沸2min,將培養(yǎng)基冷4550c傾注平板。臨用時(shí)制備，不得超過3h。A1OButterfield氏磷酸鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀（K2HPO4）34