實驗四-逆轉(zhuǎn)錄PCR-(RT-PCR)

1、實驗四 逆轉(zhuǎn)錄 PCR (RT-PCR)【實驗目的】1了解用逆轉(zhuǎn)錄PCF法獲取目的基因的原理。2 學習和掌握逆轉(zhuǎn)錄PCR的技術(shù)和方法?！緦嶒炘怼烤酆厦告準椒错慞CR過程利用模板變性，引物退火和引物延伸的多個循環(huán)來擴增DNA序列。因為上一輪的擴增產(chǎn)物又作為下一輪擴增的模板， 是一個指數(shù)增長的過程， 使其成為檢測核酸和克隆基因 的一種非常靈敏的技術(shù)。一般經(jīng)25-35輪循環(huán)就可使模板DNA擴增達106倍。RT-PCF將以RNA為模 板的 cDNAcomplement DNA合成即 RNA的反轉(zhuǎn)錄RT, reversetranscription，同 cDNA的 PCR 結(jié)合在一起的技術(shù)，提供了一種基

2、因表達檢測、定量和cDNA克隆的快速靈敏的方法。由于 cDNA包括了編碼蛋白的完整序列而且不含內(nèi)含子， 只要略經(jīng)改造便可直接用于基因工程表達和功能研究， 因 此RT-PCR成為目前獲得目的基因的一種重要手段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平、表達差異，細胞中 RNA病 毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA序列。RT-PCF比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原 位雜交及S1核酸酶分析在內(nèi)的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。RT-PCF的根本原理圖。首先是在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下從 RNA合成cDNA,即總RNA中的mRNA 在體外被反向轉(zhuǎn)錄合成DNA

3、拷貝，因拷貝DNA的核苷酸序列完全互補于模板 mRNA,稱之為互補DNA cDNA然后再利用DNA聚合酶，以cDNA第一鏈為模板，以四種脫氧核苷三磷酸dNTF為材料， 在引物的引導下復制出大量的cDNA或目的片段。在RT時，有3種引物可選擇表4.1)。用1和2方法，理論上是擴增的所有的 cDNA,還要用此產(chǎn)物做PCR的模板繼續(xù)擴增。如果用3方法，先要去：查它的序列，并用oligo等軟件設計引物。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。兩步法 RT-PCR:匕較常見，在使用一個樣品檢測或克 隆多個基因的mRNA時比擬有用。在兩步法RT-PCR,每一步都在最正確條件下進行。cDNA的合成 首先在

4、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反響產(chǎn)物進行PCR而一步法RT-PC具有其它優(yōu)點表, cDNA合成和擴增反響在同一管中進行，不需要翻開管蓋和轉(zhuǎn)移，有助于減少污染。還可以得到更高 的靈敏度，最低可以到達總 RNA因為整個cDNA樣品都被擴增。對于成功的一步法 RT-PCR 一般使 用基因特異性引物(GSP起始cDNA的合成。由圖不難看出，隨機引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉(zhuǎn)錄本的多個位點退火， 產(chǎn)生短的，局部長度的cDNA。這種方法經(jīng)常用于獲取5'末端序列及從帶有二級結(jié)構(gòu)區(qū)域或帶有逆轉(zhuǎn) 錄酶不能復制的終止位點的 RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA,需要按經(jīng)驗

5、確定每個 RNA 樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為 50到250ng每20卩l(xiāng)反響體系。因為使用隨 機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA所以模板一般選用poly(A)+RNAOligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數(shù)真核細胞mRNA 3端所發(fā)現(xiàn)的poly(A)尾雜交。 因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%,所以與使用隨機引物相比，cDNA的數(shù)量和復雜度要少 得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優(yōu)化。建 議每20卩l(xiāng)反響體系使用卩g oligo(dT> oligo(dT)

6、12-18適用于多數(shù)RT-PCR基因特異性引物GSP對于逆轉(zhuǎn)錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或 oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物 的規(guī)那么同樣適用于逆轉(zhuǎn)錄反響 GSP的設計。GSP可以同與mRNA 3最末端退火的擴增引物序列相同， 或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。已經(jīng)制備好的雙鏈cDNA和一般DNA一樣，可以插入到質(zhì)粒或噬菌體中，為此，首先必需有適 當?shù)慕宇^Linker,接頭可以是在PCR引物上增加限制性內(nèi)切酶識別位點片段，經(jīng) PCRT增后再克隆 入相應的載體；也可以利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和雙鏈

7、 cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA 尾巴,退火后形成重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到宿主菌中進行擴增。本實驗是要從小鼠肝臟組織中獲取 Fas配體基因，F(xiàn)as配體FasL是一分子量約為40u的II型跨 膜糖蛋白，屬TNF家族成員?；罨腡細胞可表達Fas和FasL并通過Fas/FasL系統(tǒng)介導細胞凋亡作 用，保持機體免疫系統(tǒng)的自穩(wěn)態(tài)。近年研究發(fā)現(xiàn)在局部癌細胞中FasL表達增強，并與腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移有關。我們采用RT-PCR方法克隆FasL全長cDNA并構(gòu)建其表達載體，可以為進一步研究 FasL的功 能提供條件。在上下游引物的5'端分別加上了限制酶切位點及其保護堿基即 Hind III和B

8、amH， 以便可以通過雙酶切將目的片段定向的克隆到原核表達載體pGFPUv上附錄圖。為了便于后續(xù)實驗可以用金屬螯和層析的方法別離和純化目的蛋白，我們改造了 pGFPUv在其上加了 6X His標簽。表4.1RT-PCR|物選擇的履那么隨機可物(Random Pmers)適用于長的或具有發(fā)卡結(jié)枸的適用于rKNA>niRNA>tRNA 等所有RNA的威隸反響。主姜用干單一模板的EPCR反氛Oligo dT(Oligo- dT AdaptorPrimer)適用于具有Polfca屋巴的RNA姑于紗亦套結(jié)合至I Polka屋 巴上所次對RNA樣品的質(zhì)量耍求較託即使有少量降解也會 使全長fDX

9、H合成量大大減少-基因特異性引物(Gene SpeciHc Primer 5 GSP)與模板席列互補的引糊適用于目的序列的情況o表12一步法和兩步法RT-PCR的比較兩步法一步法性始第 HScDNAjSttffl；起始第一®合威棲用：O昭咚刁：隨機六聚體0P引韌GSP刖物優(yōu)點優(yōu)點試活擴增酶同誣轉(zhuǎn)錄酶預先泯合擴壇酶的選怪轉(zhuǎn)管步驟少，-械少污渠可能性困難RT-PCR的優(yōu)化能力蔦靈SS度可通過選用不同特性的DNA聚合酶和改變反響條件 提高擴壇的特異性忠實性適用于大量祥品分折適用于在里個樣品中檢測或克隆務伍因的mJ還二適用于定重PCR一試劑1. 總 RNA或 mRNA酶抑制蛋白RNase I

10、nhibitor: 40 U/mL3. dNTP混合物(各10 mM)4.oligo(dT)12-18: 2.5 mol/L5.10*逆轉(zhuǎn)錄合成緩沖液10 RT buffer：250 mmol/L Tris-HCI (pH8.3)375 mmol/L KCl 15 mmol/L MgCI2 逆轉(zhuǎn)錄酶5u/ L7. 基因特異性5和3引物各20 mol/L8. Tap DNA聚合酶 5u/ L9.10*PCR緩沖液：500mmol/L KC, 100mmol/L Tris?C,在 25°C下，1.0% Triton X-100 15mmol/L MgCI2。二器材1PCR儀，2PCR管,

11、3微量移液器【操作方法】一逆轉(zhuǎn)錄：1建立RT反響體系:總RNA或?qū)ΨNA0.5-1 rigdNT?混合物2 LoligoiT124S1J1L10>RT緩;梆如AMV逆諾錄酶IpLRNase Inhibitor0.5DEPC水如至20 pLTotal volume20 pL2渦旋混勻，42C反響1小時，95C加熱5分鐘，然后置于冰上。二PCR擴增：1建立PCR反響體系:上步逆轉(zhuǎn)錄反響得到的10L基因特異性亍和歹引物各ILdNIP混合初1110叩CR緩;械5TiqDNAM 合醸0.5 1LDEPC水力咗50iiLTotal volumeSOuL2將上述反響體系渦旋混勻，按以下程序運行循環(huán):

12、step變性5 minstep2變性1 minstcp3性曲secstcp472延伸step5芒遼溫肓lOminstepC保存H過夜step2-4運行30個循環(huán)，其中復性溫度主要依據(jù)引物的不同而不同。三取10-20uL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，余下的 PCR產(chǎn)物-20C保存?！究记绊氈c提示】1. 逆轉(zhuǎn)錄反響過程，需建立無 RNAase環(huán)境，以防止RNA的降解。2. 成功的逆轉(zhuǎn)錄反響決定于高質(zhì)量的模板 RNA高質(zhì)量的RNA至少應保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或 SDS此外，RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是 RNA中沾染的基因組DNA。使用較 好的RNA別離方法，如T

13、rizol Reage nt會減少RNA制備物中沾染的基因組 DNA。因此在進行PCR反 應時應該對每個RNA模板進行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照反響，以確定擴增出來的片段是來自基因組DNA還是cDNAo在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。的起始模板可是總RNA或mRNA都可以檢測到擴增結(jié)果如以下列圖。另外，別離mRNA會導致樣 品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當分析稀有基因時，使用 mRNA會增加檢測的靈敏度。4 / 64. 在逆轉(zhuǎn)錄反響中經(jīng)常參加RNA酶抑制蛋白以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。RNA酶抑制蛋白要在第一鏈合成反響中，在緩沖液和復原劑如 DTT存

14、在的條件下參加，因為cDNA合成前的過程會使抑 制劑變性，從而釋放結(jié)合的可以降解 RNA的RNase RNA酶抑制蛋白僅防止RNase A，B，C對RNA 的降解，并不能防止皮膚上的 RNase因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心試驗者的手上Rnase對樣品的污染。5. 較高的保溫溫度有助于 RNA二級結(jié)構(gòu)的翻開，增加了反響的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65C保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)， 從而使引物可以結(jié)合。然而某些模板仍然會存在二級結(jié)構(gòu)， 即使熱變性后也是如此。對這些困難模板 的擴增可以使用經(jīng)過改良的耐高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，女如: Inv

15、itrogen公司的ThermoScript逆轉(zhuǎn)錄酶，使逆轉(zhuǎn)錄反響置于較高溫度下進行以改善擴增。而且適當提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度，可增加RT-PCR勺特異性。6. 建立反響體系時，加完其它反響物后，才加模板DNA和Taq DNA聚合酶；然后將全部反響物渦旋混 勻；上PCR儀前加礦物油封蓋或設熱蓋。反響的循環(huán)數(shù)一般25-30次就足夠了，過多的循環(huán)數(shù)會造成非特異性擴增和時間的浪費。復性溫度的 計算，一般是在引物的Tm值上下浮動，Tm =2 : A+T+4 G+C。適當提高復性溫度可提高 PCRT增 的特異性。8.不管是反轉(zhuǎn)錄反響還是 PCF反響都應先調(diào)制試劑的 Master Mix 包括RNase Fr

16、ee dH2O緩沖液、dNTP Mixture等，然后分裝到每個反響管中。這樣可使所取的試劑的體積更準確，減少試劑的損失，防止 重復分取同一試劑，同時也可以減少實驗操作造成的誤差。而且分裝試劑時務必用新Tip，以防止樣品間的污染。、RNase Inhibitor、Taq等酶類，要輕輕地混勻，防止起泡。分取之前要輕輕地離心收集到反響管底部， 因其粘度高，所以要慢慢地分取。 酶類務必在實驗前從-20C取出，使用后立即放回-20C保存。10.最正確的PCR條件，因PCRT增儀的不同而不同，所以在使用您的樣品之前最好先做 Control反響， 以確定最正確的PCR條件。為延長PCR儀的使用壽命，應盡可能縮短PCR儀4C保存的時間，盡量防 止4 °C過夜的情況。-1500bplOOObp800bp一 50flbp® 4.2 RT-PCK瓊脂稲瀧除電泳示意團Lane 1:總RNA的RT-PCR產(chǎn)物人細胞調(diào)亡因子 TF15基因Lane 2: mRN