食品和水樣中的細菌總數(shù)及大腸菌群的檢測

1、食品和水樣中的細菌總數(shù)及大腸菌群的檢測(一)實驗?zāi)康?1) 了解和學(xué)習(xí)食品和水樣中細菌總數(shù)和大腸菌群的測定原理和測定意義。(2) 學(xué)習(xí)和掌握食品中菌落總數(shù)檢測方法和用稀釋平板計數(shù)法測定水中細菌總數(shù)的方法。(3) 學(xué)習(xí)和掌握食品和水樣中大腸菌群的檢測方法。(二)實驗原理食品的微生物學(xué)指標(biāo)主要包括菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌等三個項目。其中菌落總數(shù)和大腸菌群是最重要、最常檢的檢驗項目。檢測食品中的菌落總數(shù)，可以了解食品在生產(chǎn)中，從原料加工到成品包裝受外界污染的情況.從而反映食品的衛(wèi)生質(zhì)量。一般來說、菌落總數(shù)越多，說明食品的衛(wèi)生質(zhì)量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落總數(shù)僅少量存在時，病原菌污染的

2、可能性就會降低或者幾乎不存在。但上述規(guī)則也有例外，有些食品成品的菌落總數(shù)并不高，但由于已有細菌繁殖并已產(chǎn)生了毒素，且毒素性狀穩(wěn)定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通過微生物的作用而制成的，且是活菌制品。因此，菌落總數(shù)的測定對評價食品的新鮮度和衛(wèi)生質(zhì)量有著一定的衛(wèi)生指標(biāo)的作用，但本能單憑此一項指標(biāo)來判定食品的衛(wèi)生質(zhì)量，還必須配合大腸菌群和致病菌等檢驗，才能作出比較全面、準(zhǔn)確的評價。大腸菌群是水源污染的指示菌，當(dāng)飲用水中檢查出大腸菌群時，即證實水已被糞便污染，對人是有害的，是不衛(wèi)生的。同樣，食品中若有大腸菌群存在，也會影響人的健康。水是微生物廣泛分布的天然環(huán)境。各種天然水中常

3、含有一定數(shù)量的微生物。水中微生物的主要來源有：水中的水生性微生物(如光合藻類)、來自土壤徑流、降雨的外來菌群和來自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要來源于人和動物的傳染性排泄物。水的微生物學(xué)的檢驗，特別是腸道細菌的檢驗，在保證飲水安全和控制傳染病上有著重要意義，同時也是評價水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)。國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，飲用水中大腸菌群數(shù)每升中不超過3個，細菌總數(shù)每mL超過100個。所謂細菌總數(shù)是指1mL或1g檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)，所用的方法是稀釋平板計數(shù)法，由于計算的是平板上形成的菌落(colony-formingunit,cfu)數(shù)，故其單位應(yīng)是cfu/g(mL)。它反映的是檢樣

4、中活菌的數(shù)量。所謂大腸菌群，是指在37c24h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣的兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌的總稱，主要由腸桿菌科中四個屬內(nèi)的細菌組成，即埃希氏桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。水的大腸菌群數(shù)是指100mL水檢樣內(nèi)含有的大腸菌群實際數(shù)值，以大腸菌群最近似數(shù)（MPN）表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽胞桿菌等多種細菌。這些細菌都可隨人畜排泄物進入水源，由于大腸菌群在腸道內(nèi)數(shù)量最多，所以，水源中大腸菌群的數(shù)量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標(biāo)。目前，國際上已公認大腸菌群的存在是糞便污染的指標(biāo)。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的

5、檢驗方法，常用多管發(fā)酵法和濾膜法。多管發(fā)酵法可運用于各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要時間長。濾膜法僅適用于自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用于雜質(zhì)較多、易于阻塞濾孔的水樣。（三）實驗器材（1）菌落總數(shù)的測定：1）培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白陳瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水，75駐醇。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管，直徑為9cm的平皿，18mmx200mm試管，1mL和10mL吸管，500mL三角瓶，500mL廣口瓶，均質(zhì)器或乳缽，培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋等。（2）大腸菌群的測定；1）培養(yǎng)基：乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵管，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（EMB）:蛋白月東20g,

6、豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g，乳糖10g,0.04%澳甲酚紫水溶液25mL水1000mLpH7.4。制法：將蛋白月東、膽鹽從乳糖溶于水中，校正pH,加入指示劑，分裝，每瓶50mL或每管5mL,并倒置放入一個杜氏小管，115c滅菌15min。雙倍或三倍乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基：蛋白月東10g,乳糖10g,K2HPC42g,2%伊紅水溶液20M1,0.65%美藍水溶液10mL,瓊月旨17g,水1000mLpH7.1。制法：將蛋白月東、磷酸鹽和瓊脂溶于水中，校正pH后分裝.121c滅菌15min備用。臨用時加入乳糖并熔化瓊脂，冷至50-55C,加入

7、伊紅和美藍溶液，搖勻，傾注平板。乳糖發(fā)酵管：除不加膽鹽外.其余同乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)基。2）器材：滅菌三角瓶，滅菌的具塞三角瓶，滅菌平皿，滅菌吸管，滅菌試管，滅菌發(fā)酵管，滅菌廣口瓶，均質(zhì)器或乳缽，培養(yǎng)箱，恒溫水浴鍋等。3）試劑：革蘭氏染色液等。（四）實驗方法食品中：（1）菌落總數(shù)的檢測1）檢樣稀釋及培養(yǎng)：以無菌操作法，將檢樣25g（或25mL）剪碎以后，放于裝有225mL無菌水的三角版（瓶內(nèi)預(yù)先放適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成l:10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌容器中以8000-10000r/min的速度離心1min,做成1:10的均勻稀釋液。將上述樣

8、品進行10倍系列稀釋，稀釋度視食品性質(zhì)和污染狀況而定。根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇23個適宜稀釋度，分別吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作3個重復(fù)。迅速將熔化后保溫在45c的牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基1520mL注入平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻，同時將培養(yǎng)基傾入加有1mL空白稀釋劑（即不含樣品）的滅菌平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，倒置平板，于36±1C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48±2h取出，計算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得lg（1mL）樣品所含菌落總數(shù)。2）菌落計算方法和報告：同實驗一0七水中菌落總數(shù)測定方法中的菌落計數(shù)報告方式。（2）大腸菌群的檢測：1

9、）檢驗程序：食品中大腸菌群檢測程序見圖1081所示。2）操作步驟：采樣及稀釋：a.按無菌操作法將檢樣25g（或25mL）放于含有225mL無菌水的三角瓶中（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的玻璃珠）或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質(zhì)器，以8000-10000r/min的速度離心1min,做成1：10的稀釋液。b.用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1M1,注入含有9mL無菌水的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1:100的稀釋液，換用1支1mL滅菌吸管，按上述操作依次作10倍系列稀釋液。圖1食品中大腸菌群的檢測程序每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。乳糖初發(fā)酵試驗：即通常所說

10、的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細菌。.將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙倍乳糖膽鹽發(fā)酵管；lmL及1mL以下者，用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一個稀釋度接種3管，置36±1C溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24±2h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板，置36±1C溫箱內(nèi)培養(yǎng)18-24h,然后觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色、鏡檢并作復(fù)發(fā)酵試驗。乳糖復(fù)發(fā)酵試驗：即通常所說的證實試驗，其目的在于證明經(jīng)乳糖初發(fā)酵試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏

11、陰性無芽胞桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述選擇性EM盼養(yǎng)基上，挑取可疑的大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±lC溫箱內(nèi)培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。凡乳搪發(fā)酵管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性反應(yīng)的無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性；凡乳糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色為陽性，則報告為大腸菌群陰性。水樣中：(1)水樣的采集：1)自來水：先將自來水龍頭用酒精燈火焰灼燒滅菌，再開放水龍頭使水流5min,以滅菌三角瓶接取水樣以備分析。2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸邊5m處，取距水面10-15cm的深層水樣，先將滅菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過來

12、，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再從水中取出。如果不能在2h內(nèi)檢測的，需放入冰箱中保存。（2）細菌總數(shù)的測定:1）水樣稀釋及培養(yǎng)：按無菌操作法，將水樣作10倍系列稀釋：根據(jù)對水樣污染情況的估計，選擇2-3個適宜稀釋度（飲用水如自來水、深井水等，一般選擇1、1:10兩種濃度；水源水如河水等，比較清潔的可選擇1:10、1:100、1:1000三種稀釋度；污染水一被選擇1:100、1:1000、1:10000三種稀釋度）,吸取1mL稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作3個重復(fù)。將熔化后保溫度45c的牛肉膏蛋白月東瓊脂培養(yǎng)基倒平皿，每皿約15mL并趁熱轉(zhuǎn)動平皿混合均勻。待瓊脂凝固后，將平皿

13、倒置于37c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24±1h后取出，計算平皿內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1mL水樣中所含的細菌菌落總數(shù)。2）計算方法：作平板計數(shù)時，可用肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)。3）計數(shù)的報告：平板菌落數(shù)的選擇：選取菌落數(shù)在30-300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標(biāo)準(zhǔn)。一個稀釋度使用兩個重復(fù)時，應(yīng)選取兩個平板的平均數(shù)。如果一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板計數(shù)作為該稀釋度的菌數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計算半個平板后乘2以代表整個平板的菌落數(shù)。稀釋度的選擇：

14、a.應(yīng)選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度，乘以該稀釋倍數(shù)報告之（表1例1）。b.若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)均在30-300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2,應(yīng)報告其平均數(shù)；若比值大于2,則報告其中較小的數(shù)字（1例2、例3）。c.若所有稀釋度的平均菌落均大于300,則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（1例4）。d.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30、則應(yīng)按稀釋倍數(shù)最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（1例5）。e.若所有稀釋度均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之（表1例6）。f.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30-300之間，則以最接近30或300的平

15、均菌落數(shù)乘以該稀釋彳§數(shù)報告之（表1例7）。細菌總數(shù)的報告：細菌的菌落數(shù)在100以內(nèi)時，按其實有數(shù)報告；大于100時，用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)字，以四舍五入方法修約。為了縮短數(shù)字后面的0的個數(shù)，可用10的指數(shù)來表示，如表1“報告方式”一欄所示。（3）大腸菌群的測定（多管發(fā)酵法）：表1稀釋度的選擇及細菌數(shù)報告方式稀釋度及菌落數(shù)兩稀釋度之比菌落息數(shù)/(cfu/g或cfu/mL)報告方式（菌落總數(shù)）/（cfu/mL或cfu/g）-110-210-3101多不口計16420-16400416000或1.6X102多不口計295461.637750438000或3.8X103多不

16、口計271602.22710027000或2.7X1044多不口計多不可計313-3130005310000或3.1X105627115-270270或000-V10V107多不PJ計30512-30500431000或3.1X101）生活飲用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗:初步發(fā)酵試驗：在2個各裝有50mL的3倍濃縮乳糖膽鹽蛋白月東培養(yǎng)液（可稱為三倍乳糖膽鹽）的三角瓶中（內(nèi)有倒置杜氏小管），以無菌操作各加水樣100mL在10支裝有5mL的三倍乳糖膽鹽的發(fā)酵試管中（內(nèi)有倒置小管），以無菌操作各加入水樣10mL如果飲用水的大腸菌群數(shù)變異不大，也可以接種3份100mL水樣。搖勻后，37c培養(yǎng)24h。平板分

17、離：經(jīng)24h培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及只產(chǎn)酸的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板（EMB培養(yǎng)基）上，37c培養(yǎng)18-24ho大腸菌群在EM抨板上，菌落呈紫黑色，具有或略帶有或不帶有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深；挑取符合上述特征的菌落進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。復(fù)發(fā)酵試驗：將革蘭氏陰性無芽胞桿菌的菌落的剩余部分接于單倍乳糖發(fā)酵管中，為防止遺漏，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的平板上同類型菌落13個，37c培養(yǎng)24h,如果產(chǎn)酸又產(chǎn)氣者，即證實有大腸菌群存在。報告：根據(jù)證實有大腸菌群存在的復(fù)發(fā)酵管的陽性管數(shù)，查表107-2（或表107-3）,報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN）。2）水源

18、水的檢驗：用于檢驗的水樣量，應(yīng)根據(jù)預(yù)計水源水的污染程度選用下列各量。嚴重污染水：1,0.1,0.01.0.00lmL各1份。中度污染水：10.1,0.1,0.01mL各1份。輕度污染水：100,10,1,0.1mL各l份。大腸菌群變異不大的水源水：10mLl0份。表2大腸菌群檢索表（飲用水）012備注每升水樣中大腸菌群數(shù)0<3411接種水樣總量300mL（100mL2份,10mL10份）138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230表3大腸菌群數(shù)變異不大的飲用水陽性管數(shù)0123接種水

19、樣總量300mL(3份100mL)每升水樣中大腸菌群數(shù)<3411>18表4大腸菌群檢索表(嚴重污染水)接種水樣量/mL每升水樣中大腸菌群數(shù)備注10.10.010.001-<900接種水樣總量-+900-+-900-+-950-+1800-+-+1900-+-2200+-2300為1.111（1,0.1,0.01,0.001mL各一份）-+2800+-+9200+-+-9400+-+18000+-23000+-+96000+-238000+>238000表5大腸菌群檢索表（中度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注大腸菌群數(shù)1010.10.01-v90-+90-+-90-

20、+-95-+180-+-+190-+-220接種水樣總量+-230為11.11(10,-+2801,0.1,0.01mL+-+920各一份）+-+-940+-+1800+-2300+-+9600+-23800+>23800表6大腸菌群檢索表（輕度污染水）接種水樣量/mL每升水樣中備注大腸菌群數(shù)1001010.1-<9接種水樣總量為111.1（100,10,1,0.1mL各一份）-+9-+-9-+-9.5-+18-+-+19-+-22+-23-+28+-+92+-+-94+-+180+-230+-+960+-2380+>2380表7大腸菌群變異不大的水源水陽性管數(shù)012345678910每升水樣中大腸菌群數(shù)V10112236516992120160230>230備注接種水樣總量100mL（10mL10份）操作步驟同生活用水或食品生產(chǎn)用水的檢驗。同時應(yīng)注意，接種量1mL及1mL以內(nèi)用單倍乳糖膽鹽發(fā)酵管；接種量在1mL以上者，應(yīng)保證接種后發(fā)酵管（瓶）中的總液體量為單倍培養(yǎng)液量。然后根據(jù)證實有大腸菌群存在的陽性管（瓶）數(shù)，查表107-4、表107-5、表107-6或表107-7,報告每升水樣中的大腸菌群數(shù)（MPN