常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方法匯總常用

1、技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）常用實(shí)驗(yàn)方法匯總目錄一Western Blot（蛋白質(zhì)印跡法）3二免疫組化技術(shù)4三. 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）6四免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）8五GST-pulldown9六雙向凝膠電泳11七ELISA 免疫測(cè)定12八酵母雙雜交系統(tǒng)14九熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)17十. RT-PCR19十一. 第二代DNA技術(shù)20伯豪生物十二. . . .

2、. . . . .23十三. Real-Time PCR25十四. RACE 技術(shù)28十五. DNase I 足跡試驗(yàn)30十六. DNase I 超敏感位點(diǎn)的研究32十七. Northern blot34十八. digital PCR36十九. Luciferase 報(bào)告系統(tǒng)38二十. 凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）39二十一. 染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）42二十二. RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀45二十三. 熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescence

3、in situ hybridization, FISH）48二十四. RNA-蛋白 Pull-Down50二十五.機(jī)制信號(hào)通路關(guān)鍵和抑制劑521 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）二十六.機(jī)制-細(xì)胞器典型標(biāo)志物62二十七.A（GeneA）的敲減載體構(gòu)建64二十八. GeneA 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建64二十九. GeneA 點(diǎn)突變載體構(gòu)建65三十. GeneA 敲除載體構(gòu)建（CRISPR/Cas9 法）65三十一. GeneA 敲除載體構(gòu)建（TALENs 法）65三十二. GeneA 的 miRNA 載體表達(dá)構(gòu)建66三十三. 原代細(xì)胞培養(yǎng)與分離6

4、7三十四. 干細(xì)胞分離培養(yǎng)68三十五. 細(xì)胞增殖相關(guān)研究方法70三十六. 細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)研究方法73三十七.生成75三十八. 細(xì)胞周期：PI 染色76伯豪生物三十九. 細(xì)胞凋亡檢測(cè)76四十. 細(xì)胞分選78四十一. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染79四十二. 細(xì)胞慢.80四十三.穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選80四十四. 耐藥細(xì)胞株的篩選81四十五. 細(xì)胞共培養(yǎng)81四十六. 研究腫瘤細(xì)胞增殖82四十七. 研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移82四十八. 研究腫瘤細(xì)胞耐藥84四十九. 免疫組化85五十. HE 染色862 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）一Western Blot（蛋白質(zhì)印跡法）概

5、述：蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗(yàn)）即 Western Blot，它是生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實(shí)驗(yàn)方法。其基本原理是通過(guò)特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色，通過(guò)分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。目的：獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中的表達(dá)情況的信息。原理：與 Southern 或 Northern 雜交方法類(lèi)似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò) PAGE 分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體(例如硝酸素薄膜)上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸

6、附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類(lèi)型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的表達(dá)的蛋白成分。伯豪生物步驟：1.提取組織或細(xì)胞蛋白；2.測(cè)定蛋白質(zhì)濃度 ；3.電泳：電泳條件為： 恒壓 100V， 待120min）；4.電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜 ：前沿移行到距離凝膠底部 2-3mm 時(shí)方可停止（ 約轉(zhuǎn)膜條件為：恒流 250mA ，2h（時(shí)間可根據(jù)目的蛋白5.封閉：5%脫脂牛奶室溫封閉 1h；量適當(dāng)調(diào)整）；6. 加一抗：一抗封膜之后室溫條件下?lián)u 1h 然后放入 4冰箱中過(guò)夜；7. 收一抗

7、，PBST 洗膜 3 次，10min/次；8. 二抗孵育：室溫孵育 1h，所用二抗的比例和種屬見(jiàn)步驟 9）表格。9.洗膜：PBST 洗膜 2 次，PBS 洗膜一次，10min/次。10.顯色流程圖：3 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）二免疫組化技術(shù):概述：免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）是組織化學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對(duì)組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進(jìn)行組織和細(xì)胞原位檢測(cè)的技術(shù)。凡是組織細(xì)胞內(nèi)伯豪生物具有抗原性的物質(zhì)，如肽類(lèi)、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體 表面抗原等均可用免疫組織化學(xué)方法顯示，因而

8、目前在基礎(chǔ)與臨床科研中被廣泛應(yīng)用。免疫組織化學(xué)染色方法分類(lèi)：1、按標(biāo)記物質(zhì)的種類(lèi)，如熒光、放射性同位素、酶（主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫熒光法、放射免疫法、酶標(biāo)法和免疫金銀法等。2、按染色步驟可分為直接法（又稱(chēng)一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。3、按結(jié)合方式可分為抗原抗體結(jié)合，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等。目的：對(duì)所研究的大如肽類(lèi)、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子、受體、表面抗原等進(jìn)行，進(jìn)而深入研究其功能。

9、原理：1、免疫熒光方法4 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）免疫熒光方法是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體標(biāo)上熒光素，以此作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原，在熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)抗原抗體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會(huì)發(fā)出一定波長(zhǎng)的熒光，從而可確定組織中某種抗原的，進(jìn)而還可進(jìn)行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速簡(jiǎn)便，所以在臨床病理診斷、檢驗(yàn)中應(yīng)用比較廣。2、免疫酶標(biāo)方法免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù)?；驹硎窍纫悦笜?biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用，然后加入

10、酶的底物，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行研究。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前最常用的技術(shù)。3、免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標(biāo)記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白，對(duì)蛋白的生物學(xué)活性則沒(méi)有明顯的影響。因此，用膠體金標(biāo)記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的(如葡萄球菌 A 蛋白)等作為探針，就能對(duì)組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原進(jìn)行定性、，甚至定量研究。由于膠體金有不同大小的顆粒，伯豪生物且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標(biāo)記或多標(biāo)記研究。由于膠體金本身呈淡至深紅色，因此也

11、適合進(jìn)行光鏡觀察。如應(yīng)用銀加強(qiáng)的免疫金銀法則更便于光鏡觀察。步驟：1. 洗載玻片2. 包埋組織3. 切片4. 撈組織5. 脫蠟6. 抗原修復(fù)7. 血清封閉8. 加一抗9. 加二抗10. 加SABC11. 加顯色劑12. 復(fù)染13. 脫水5 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）14. 封片流程圖：伯豪生物三. 免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）概述：免疫熒光技術(shù)（Immunofluorescence technique ）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，

12、再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和。目的：測(cè)定內(nèi)激素、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原、腫瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。步驟：1、細(xì)胞準(zhǔn)備；2、固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞，固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的 PBS中 4保存 3；6 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）3、通透。使用交聯(lián)劑（如多聚）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通

13、透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。4、封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉。5、一抗結(jié)合。室溫孵育 1h 或者 4過(guò)夜。6、二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。7、封片，熒光顯微鏡檢查。流程圖：伯豪生物7 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）四免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）概述：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一種以抗體和抗原之間的特異免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間相互作用的經(jīng)典方法。其基本原理是在細(xì)胞裂解液中加入抗原特異性的抗體，抗體、抗原、以及與抗原具有相互作用

14、的蛋白質(zhì)通過(guò)抗原與抗體之間免疫沉淀反應(yīng)將形成免疫復(fù)合物，經(jīng)過(guò)純化，洗脫，收集免疫復(fù)合物，SDS-PAGE 電泳， western blot 和（或）質(zhì)譜可鑒定出與抗原相互作用的蛋白質(zhì)。其優(yōu)點(diǎn)為：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)；（2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響；（3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)為：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用；（2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有

15、性。伯豪生物目的：研究一種已知蛋白質(zhì)與已知或者未知蛋白質(zhì)間相互作用原理：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì) X 的抗體免疫沉淀 X，那么與 X 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y 也能沉淀下來(lái)。步驟：1.用 RIPA 裂解緩沖液裂解細(xì)胞；2. 用PBS 配制成 50%的 protein A/G-agarose 工作液；3. 在樣品中以每 1ml 中加 100l 的比例，加入 50%的Protein A/G agarose 工作液。水平搖床4搖動(dòng) 10min（該步驟的目的是去除非特異性結(jié)合的蛋白）；4. 4，14000g 離心 15min，

16、將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，去除 protein A/G-agraose 微球；5. 使用 BCA 法或者其他方法測(cè)定總蛋白的濃度；6. 加入一定體積的一抗；8 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）8. 用搖床緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物，4過(guò)夜；9. 14000g 離心收集沉淀，并且用預(yù)冷的洗滌緩沖液（或者預(yù)冷的PBS）洗滌 3 遍；10. 收集上清，用于進(jìn)一步的下游 SDS-PAGE、western-blot 或者質(zhì)譜分析。流程圖：五GST-pulldown伯豪生物概述：GST pull-down 實(shí)驗(yàn)是一個(gè)行之有效的驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)的體

17、外試驗(yàn)技術(shù)，近年來(lái)越來(lái)越受到廣大學(xué)者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase 谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶）融合蛋白親和在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過(guò)柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過(guò)SDS-PAGE 電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白，“誘餌蛋白” 和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。目的：體外檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用，用于驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白

18、。原理：9 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）利用重組技術(shù)將探針蛋白與 GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過(guò) GST 與固相化在載體上的 GTH（Glutathione）親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過(guò)層析柱時(shí)或與此固相復(fù)合物混合時(shí)就可被吸附而分離。步驟：.Glutathione 瓊脂糖珠預(yù)處理；.GST 融合蛋白掛柱：取適 GST-融合蛋白與已經(jīng)處理過(guò)的 beads 置于管中，4，搖床孵育過(guò)夜；.孵育過(guò)夜的蛋白質(zhì)與 beads 的混合液于 4，離心,上清收集，觀察融合蛋白是否飽和

19、地掛在 beads 上；.把轉(zhuǎn)染目的的細(xì)胞裂解在細(xì)胞裂解液里（含蛋白酶抑制劑），最大轉(zhuǎn)速4離心，收集上清液；.將細(xì)胞裂解液上清加入 beads；.加上 SDS 上樣緩沖液；伯豪生物.SDS-PAGE，Western Blot 或者質(zhì)譜儀分析。流程圖：10 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）伯豪生物六雙向凝膠電泳概述：雙向凝膠電泳技術(shù)結(jié)合了等電聚焦技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)進(jìn)行分離）以及 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)（根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進(jìn)行分離）。這兩項(xiàng)技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳。目的：凝膠中蛋白的檢測(cè)、圖像和分析、蛋

20、白鑒定、分離蛋白質(zhì)組所有蛋白 。原理：1、 根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（第一向）和量（第二向）的不同進(jìn)行分離。，在不同的 pH 環(huán)境中可以帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷。對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)是兩性蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)都有一個(gè)特定的 pH，此時(shí)蛋白質(zhì)的靜電荷為零，此 pH 值即該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)。將蛋白質(zhì)樣品加載至 pH 梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時(shí)，它會(huì)向與其所帶電荷相反的電極方向移動(dòng)。在移動(dòng)過(guò)程中，蛋白可能獲得或失去質(zhì)子，并且隨著移動(dòng)的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移至其等電點(diǎn) pH 位置時(shí)，其凈電荷數(shù)為零，在11 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203

21、）電場(chǎng)中不再移動(dòng)。聚焦是一個(gè)與 pH 相關(guān)的平衡過(guò)程：蛋白質(zhì)以不同的速率靠近并最終停留在它們各自的pI 值；在等電聚焦過(guò)程中，蛋白質(zhì)可以從各個(gè)方向移動(dòng)到它的恒點(diǎn)。雙向電泳的第二向是將 IPG 膠條中經(jīng)過(guò)第一向分離的蛋白轉(zhuǎn)移到第二向 SDSPAGE凝膠上，根據(jù)蛋白相對(duì)質(zhì)量或量(MW)大小與第一相垂直的分離。蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉(SDS)結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS 復(fù)合物，由于 SDS 是一種強(qiáng)陰離子去垢劑，所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)蛋白質(zhì)原有的電荷量，能消除不同之間原有的電荷差異，從而使得凝膠中電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于蛋白質(zhì)的質(zhì)量大小，其遷移率與量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。步

22、驟：.樣品.第一向分離 等電聚焦.第二向分離 聚丙烯酰胺凝膠電泳.修飾和，如用 32P 標(biāo)記可以研究磷酸化蛋白的變化流程圖：伯豪生物七ELISA 免疫測(cè)定概述：12 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）ELISA 是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱(chēng)。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自 70 年代初問(wèn)世以來(lái)， 發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。在臨床檢驗(yàn)中主要通過(guò)抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。目的：1.

23、測(cè)定體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等；2. 測(cè)定激素，包括小量的甾體激素等；3.測(cè)定抗生素和；4. 測(cè)定病原體抗原，HBsAg、HBeAg 等；5. 利用純化的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs 等；原理：ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用伯豪生物洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)

24、固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。步驟：1. 包被；2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品 0.1ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置 37孵育 1 小時(shí)。然后洗滌(同時(shí)做空白孔，對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔)；3.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育 0.51 小時(shí)，洗滌。4.5.6.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的 TMB 底物溶液 0.1m

25、l，371030 分鐘； 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入 2M 硫酸 0.05ml；結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽(yáng)性程度越強(qiáng)，反應(yīng)為無(wú)色或極淺。也可測(cè) OD 值：在 ELISA 檢測(cè)儀上，于 450nm 處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔 OD 值。13 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）流程圖：八酵母雙雜交系統(tǒng)概述：酵母雙雜交由 Fields 在提出，他的產(chǎn)生是基于對(duì)真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子特別是酵母轉(zhuǎn)錄伯豪生物因子 GAL4 性質(zhì)的研究。GAL4 包括兩個(gè)彼此分離的但功能必需的結(jié)構(gòu)域，分別是位于 N端 1-147 位

26、氨基酸殘基區(qū)段的 DNA 結(jié)合域（DNA binding domainDNA-BD）和位于 C 端768-881 位氨基酸殘基區(qū)段的轉(zhuǎn)錄激活域（Activationdomain，AD)。DNA-BD 能夠識(shí)別位于 GAL4 效應(yīng)（GAL4-responsivegene）的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)，并與之結(jié)合。而 AD 則是通過(guò)與轉(zhuǎn)錄機(jī)構(gòu)（transcription machinery）中的其他成分之間的結(jié)合作用，以啟動(dòng) UAS 下游的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。DNA-BD 和 AD 單獨(dú)分別作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，但是當(dāng)二者在空間上充分接近時(shí)，則呈現(xiàn)完整

27、的 GAL4 轉(zhuǎn)錄因子活性并可激活 UAS 下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游得到轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點(diǎn)： 作用信號(hào)是在融合表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 檢測(cè)的結(jié)果可以是表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、細(xì)胞類(lèi)型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA 文庫(kù)，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋

28、白。酵母雙雜交系統(tǒng)仍存在一些局限性：雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后如糖基化、二硫鍵形成等，這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)14 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）法進(jìn)行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴(lài)于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問(wèn)題是"假陽(yáng)性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無(wú)特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力

29、區(qū)域， 能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報(bào)告的表達(dá)，產(chǎn)生"假陽(yáng)性"結(jié)果。目的：1. 發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用；2. 在細(xì)胞體內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用；3. 篩選4. 建立作用位點(diǎn)及對(duì)蛋白相互作用影響；組蛋白連鎖圖，原理：酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子 GAL4 由兩個(gè)可以的、功能上相互的結(jié)構(gòu)域 DNA 結(jié)合域(DNA binding domain BD)和的轉(zhuǎn)錄激活域(transcription activation domain,AD)。BD 可以和伯豪生物上游激活序列(upstream ac ivating sequence，UAS)結(jié)合，而 AD 則能激活 UAS

30、下游的進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但是 單獨(dú)的 BD 或 AD 不能激活轉(zhuǎn)錄，它們之間只有通過(guò)某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。酵母雙雜交系統(tǒng)主要利用酵母的 GAL4 的這個(gè)特性通過(guò)兩個(gè)雜交蛋白在酵母細(xì)胞中的相互結(jié)合及對(duì)報(bào)告的轉(zhuǎn)錄激活來(lái)研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報(bào)告敏感地檢測(cè)到。步驟：1、酵母菌株的保存與表達(dá)型驗(yàn)證1)用接種環(huán)將凍存在-70 C°的酵母 Y190 貯備備液劃于 YPD 瓊脂培養(yǎng)平板上，在 30 C°培養(yǎng)，直到菌落直徑達(dá)到 2mm，約需 3-5 天，密封平板，4°C 保存。2)正常的Y190 菌落由于 ade

31、2-101 突變而呈粉紅色，并且直徑>2mm。挑取 3-4 個(gè)菌落置于不同培養(yǎng)平板上(SD/-Trp，SD/-Leu,，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，培養(yǎng) 4-6 天。核對(duì)其不同的生長(zhǎng)情況。由于 Y190 可以有輕微的 His3 泄漏表達(dá)，所以需要在 SD/-His 的培養(yǎng)基中加入的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑 3-AT(3-ammino-l,2,4-triazole，25mmol/L)，以抑制背景生長(zhǎng)。2、酵母感受態(tài)細(xì)胞15 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）挑取數(shù)個(gè)直徑 2-3 mm 的酵母單菌落放入 1 ml YPD 液體培養(yǎng)基中

32、，劇烈振蕩使菌落分散， 然后轉(zhuǎn)入 50ml YPDA 液體培養(yǎng)基中。以 250 rpm、30°C 的條件培養(yǎng) 16-18h 達(dá)到穩(wěn)定期。將過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入 YPDA 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，使 OD600 值達(dá)到 0.4-0.6。室溫下4,000 rpm 離心 5 min 收集菌體，用無(wú)菌 IxTE 洗菌體后，用新鮮配制的 1 xTE/LiAc 溶液重懸。3、酵母感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1)PEG/LiAc 溶液。2)將各組分在反應(yīng)管中混勾(BD 載體構(gòu)建產(chǎn)物 0.1 g + AD 載體構(gòu)建產(chǎn)物 0.1 g +鮭精 DNA0.1 mg)。3) 在反應(yīng)管中加入酵母感受態(tài)細(xì)胞 100 l，

33、混勻；4) 加入PEG/LiAc 溶液 0.6 ml，混勻；5) 30 C°培養(yǎng) 30min；6) 加入DMSO 70 l 以達(dá)到 10%的終濃度，輕輕顛倒混勻；7) 42°C 水浴中熱休克 15 min； 8)冰浴 10 min；伯豪生物9)14,000 rpm 離心 5 s 沉淀細(xì)胞；10)用 IxTE 重懸細(xì)胞。4、共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的培養(yǎng)和處理共轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞鋪于 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培養(yǎng)平板上。30°C 倒置培養(yǎng) 7-10 天， 直至菌落出現(xiàn)。選擇直徑>2 mm 的淡粉色菌落,用牙簽重新點(diǎn)種在新鮮的 SD/-Trp/-L

34、eu/-His+3-AT(25mM)培養(yǎng)平板上，繼續(xù)培養(yǎng) 2-4 天，此時(shí)可進(jìn)行半乳糖苷酶活性檢測(cè)。5、LacZ活性的測(cè)定1) 將 SD/-Trp/-Leu/-His+3-AT(25mM)培養(yǎng)平板上的克隆印跡到新華 3 號(hào)濾紙上；2) 濾紙克隆面朝上，在液氮中冷凍 10s 以上，取出，室溫放置數(shù)分鐘；3) 在一平皿中放一張新華 3 號(hào)濾紙，再加入 2ml Z buffer/X-Gal 溶液，盡量避免出現(xiàn)氣泡。4) 將濾紙置于濾紙上，克隆面朝上，盡量避免出現(xiàn)氣泡。30°C 溫浴。5) 觀察濾紙上克隆顏色反應(yīng)。一般菌落半乳糖苷酶的表達(dá)需要 30min-8 h。流程圖：16 / 87技術(shù)服

35、務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）九熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET)伯豪生物概述：熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）作為一種高效的光學(xué)“分子尺”，在生物大相互作用、免疫分析、核酸檢測(cè)等方面有廣泛的應(yīng)用。在生物學(xué)領(lǐng)域，該技術(shù)可用于研究活細(xì)胞生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用在整個(gè)細(xì)胞生命過(guò)程中占有重要地位，由于細(xì)胞內(nèi)各種組分極其復(fù)雜，因此一些傳統(tǒng)研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的方法如酵

36、母雙雜交、免疫沉淀等可能會(huì)丟失某些重要的信息，無(wú)法正確地反映在當(dāng)時(shí)活細(xì)胞生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。FRET 技術(shù)是近來(lái)發(fā)展的一項(xiàng)新技術(shù)，為在活細(xì)胞生理?xiàng)l件下對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間相互作用進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)研究提供了便利。目的：1. 活細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)蛋白激酶活性；2. 細(xì)胞凋亡的研究；3. 受體激活效應(yīng)在細(xì)胞膜上的橫向擴(kuò)散；4.膜蛋白的修飾；5.細(xì)胞膜受體之間相互作用；6.細(xì)胞內(nèi)之間相互作用。17 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）原理：熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指兩個(gè)熒光發(fā)色基團(tuán)在足夠靠近時(shí)，當(dāng)供體吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電

37、子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過(guò)偶極子相互作用，實(shí)現(xiàn)了能量向鄰近的受體轉(zhuǎn)移（即發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移）。FRET 是一種非輻射能量躍遷，通過(guò)間的電偶極相互作用，將供體激發(fā)態(tài)能量轉(zhuǎn)移到受體激發(fā)態(tài)的過(guò)程，使供體熒光強(qiáng)度降低，而受體可以發(fā)射更強(qiáng)于本身的特征熒光（敏化熒光），也可以不發(fā)熒光（熒光猝滅），同時(shí)也伴隨著熒光的相應(yīng)縮短或延長(zhǎng)。能量轉(zhuǎn)移的效率和供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜的重疊程度、供體與受體的躍遷偶極的相對(duì)取向、供體與受體之間的距離等因素有關(guān)。作為共振能量轉(zhuǎn)移供、受體對(duì)，熒光物質(zhì)必須滿足以下條件：受、供體的激發(fā)光要足夠分得開(kāi)；供體的發(fā)光光譜與受體的激發(fā)光譜要重疊。伯豪生物步驟：1 、實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞

38、的培養(yǎng)；2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：CFP-A和 YFP-B質(zhì)粒；3 多光子共聚焦顯微鏡和 FRET 觀察18 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）FRET 檢測(cè)時(shí)間：CFP-A測(cè) FRET?；?YFP-B轉(zhuǎn)染細(xì)胞 12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢FRET 圖像：確定 FRET 配對(duì)的激發(fā)波長(zhǎng)， 藍(lán)寶石激光被調(diào)諧分別用于探測(cè)最大和最小的供體和受體信號(hào)， 最大供體信號(hào)和最小受體信號(hào)對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)用于收集雙表達(dá)細(xì)胞的FRET 信號(hào)。標(biāo)定 CFP （供體）和 YFP （受體），調(diào)整激光變化，以便獲取最大 CFP 信號(hào)和最小 YFP 信號(hào)的激

39、發(fā)光波長(zhǎng)，以此激發(fā)（CFP-YFP）雙表達(dá)細(xì)胞，選擇合適的濾鏡組合和高靈敏的PMT，供體和受體圖像，收集 FRET 信號(hào)，調(diào)整供體激光強(qiáng)度，固定用于激發(fā)供體，對(duì)受體激發(fā)波長(zhǎng)也類(lèi)似要求，注意調(diào)整能量，使用合適的中性密度濾光片，避免光漂白。每個(gè)細(xì)胞FRET 檢測(cè)重復(fù) 3 次，每種轉(zhuǎn)染至少完成 6 個(gè)細(xì)胞的 FRET 檢測(cè)。FRET 數(shù)據(jù)處理： 去除 FRET 信號(hào)中DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號(hào)； 受體通路的FRET 信號(hào)需要對(duì)供體受體光譜靈敏度的變化進(jìn)行矯正、對(duì)自發(fā)熒光和光學(xué)噪聲進(jìn)行矯正； 利用矯正系數(shù)對(duì)雙標(biāo)定細(xì)胞進(jìn)行象素匹配矯正。十. RT-PCR伯豪生物概述：RT- PCR（Reve

40、rse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆轉(zhuǎn)錄 PCR是將 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和 cDNA 的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù) RT-PCR 技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞/組織中表達(dá)水平，細(xì)胞中 RNA的含量和直接克隆特定的cDNA 序列等。目的：檢測(cè)目的的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 mRNA 的水平原理：提取組織或細(xì)胞中的總 RNA，以其中的 mRNA 作為模板，采用 Oligo(dT)或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。再以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，從而獲得目的因的表達(dá)。或檢測(cè)基步驟：1. 總 RNA 的提?。ㄒ约?xì)胞為

41、例）1.1 棄去培液，PBS 洗 2 遍，加入 1ml Trizol，輕輕吹打，直至細(xì)胞脫落，吸入 1.5 ml EP 管內(nèi)，靜置 5 min。（Trizol 量根據(jù)細(xì)胞密度可適當(dāng)調(diào)整，建議：6 孔板細(xì)胞長(zhǎng)滿1ml Trizol）19 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）1.2 加入 200l 氯仿（三氯甲烷），用手劇烈震蕩 15 秒，室溫靜置 2-3 分鐘。（氯仿量為1/5 Trizol）1.3 12000g，4，離心 15min。1.4 仔細(xì)轉(zhuǎn)移上層水相到 1 個(gè)新 EP 管中，不能貪多，約 400-500l。1.5 加等體積異丙醇，輕

42、柔混合 45 次，室溫放置 10 分鐘。1.6 12000g，4，離心 10min。1.7 輕輕倒去上清，用 20 l 槍輕輕吸去殘液，沉淀用 1ml 75%乙醇（0.75ml 無(wú)水乙醇0.25ml DEPC 水，現(xiàn)配）洗 12 次，渦旋混勻。1.8 吸去上清，5-10 分鐘空氣干燥 RNA。（肉眼不能明顯看到水分即可）1.9 加 15-20l DEPC 水，吹打數(shù)次，測(cè)濃度。注釋?zhuān)簃RNA 不穩(wěn)定，很容易講解，因此 mRNA 提取過(guò)程中要盡量避免 RNA 酶污染。2.RT：（參照商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)）3.PCR：（參照商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)）4.電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。5.密

43、度掃描、結(jié)果分析：采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，對(duì)電泳條帶進(jìn)行密度掃描。伯豪生物十一. 第二代 DNA技術(shù)概述：第一代（缺點(diǎn)：通量低 1000 個(gè)核苷酸/反應(yīng)，費(fèi)用高） 化學(xué)降解法雙脫氧鏈終止法（Sanger 法）高通量熒光自動(dòng)技術(shù)雜交技術(shù)：（next-generation sequencing，NGS）第二代第二代技術(shù)的思想是邊邊(Sequencing by Synthesis)，即通過(guò)捕捉新的末端的標(biāo)記來(lái)確定 DNA 的序列， 現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括 Roche/454 FLX 、Illumina/Solexa Genome Analyzer 和 Applied Biosystems SOLID

44、system。這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)，454 FLX 的片段比較長(zhǎng)，高質(zhì)量的讀長(zhǎng)(read)能達(dá)到 400bp；Solexa性?xún)r(jià)比最高，不僅的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成20 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）本只有 454的 1/10；SOLID的準(zhǔn)確度高，原始?jí)A基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于 99.94%，而在 15X 覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到 99.999%，是目前第二代技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。雖然第二代技術(shù)的工作一般都由專(zhuān)業(yè)的商業(yè)公司來(lái)完成，但是了解原理、操作流程等會(huì)對(duì)后續(xù)的數(shù)據(jù)分析有很重要的作用，下文將以Illu

45、mina/Solexa Genome Analyzer為例，簡(jiǎn)述第二代技術(shù)的基本原理、操作流程等方面。原理：Illumina/Solexa Genome Analyzer的基本原理是邊邊。在 Sanger 等方法的基礎(chǔ)上，通過(guò)技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的 dNTP，當(dāng) DNA 聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種 dNTP 就會(huì)出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè) DNA 的序列信息。Illumina Solexa儀特點(diǎn)：橋式PCR邊邊可逆終止物伯豪生物Illumina Solexa流程：操作步驟：1)文庫(kù)的構(gòu)建(Library Constructio

46、n)21 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）組 DNA(雖然公司要求樣品量要達(dá)到 200ng，但是 Gnome Analyzer 系統(tǒng)首先準(zhǔn)備所需的樣品量可低至 100ng，能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)中)，然后將 DNA 隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭(Adaptor)。如果是轉(zhuǎn)錄組，則文庫(kù)的構(gòu)建要相對(duì)麻煩些，RN段化之后需反轉(zhuǎn)成 cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA 反轉(zhuǎn)成 cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大小(Insert size)對(duì)于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來(lái)選擇。對(duì)于組來(lái)說(shuō)，通常會(huì)選

47、擇幾種不同的 insert size，以便在組裝(Assembly)的時(shí)候獲得的信息。2)錨定橋接(Surface Attachment and Bridge Amplification)Solexa的反應(yīng)在叫做 flow cell 的管中進(jìn)行，flow cell 又被細(xì)分成 8 個(gè) Lane，每個(gè)Lane 的內(nèi)表面有無(wú)數(shù)的被固定的單頭。上述步驟得到的帶接頭的 DN段變性成單鏈后與通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。3)預(yù)擴(kuò)增(Denaturation and Complete Amplification)添加未標(biāo)記的dNTP 和普通 Taq 酶進(jìn)行固相橋式PCR 擴(kuò)增，單

48、鏈橋型待測(cè)片段被擴(kuò)增成為雙鏈橋型片段。通過(guò)變性，出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過(guò)不斷循環(huán)，將會(huì)在 Flow cell 的固相表面上獲得上百萬(wàn)條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。伯豪生物4)單堿基延伸(Single Base Extension and Sequencing)在的 flow cell 中加入四種熒光標(biāo)記的 dNTP 、DNA 聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的 dNTP 就能出相對(duì)應(yīng)的熒光，儀通過(guò)捕獲熒光信號(hào)，并通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為峰，從而獲得待測(cè)片段的序列信息。從熒光信號(hào)獲取待測(cè)片段的序列信息的過(guò)程叫做 Base Calling，I

49、llumina 公司Base Calling 所用的軟件是 Illumina's Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。讀長(zhǎng)會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。隨著讀長(zhǎng)的增加，錯(cuò)誤率也會(huì)隨之上升。5)數(shù)據(jù)分析(Data Analyzing)這一步嚴(yán)格來(lái)講不能算作操作流程的一部分，但是只有通過(guò)這一步，前面的工作才顯得有意義。得到的原始數(shù)據(jù)是長(zhǎng)度只有幾十個(gè)堿基的序列，要通過(guò)生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長(zhǎng)的 Contigs 甚至是整個(gè)組的框架，或者把這

50、些序列比對(duì)到已有的組或者相近物種組序列上，并進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。22 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）十二.概述：（又稱(chēng) DNA、生物）技術(shù)系指將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400 ）探針固定于支持物上后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)探針的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品的數(shù)量和序列信息。通俗地說(shuō)，就是通過(guò)微技術(shù) ，將伯豪生物數(shù)以萬(wàn)計(jì)、乃至百萬(wàn)計(jì)的特定序列的 DN段（探針），有規(guī)律地排列固定于 2cm2的硅片、玻片 等支持物上的一個(gè)二維 DNA 探針陣列，與計(jì)算機(jī)的電子十分相似，所以被稱(chēng)為。主要用于檢測(cè)工作 。目前主要被應(yīng)

51、用的表達(dá)是美國(guó)昂飛公司和安捷倫兩家公司的。美國(guó)Affymetrix 公司開(kāi)發(fā)了世界上最第一款商業(yè)化，其發(fā)明的寡核苷酸原位光刻專(zhuān)利技術(shù)（light-controlled in situ synthesisof DNA microarrays）可在每 cm²片基上超過(guò) 400 萬(wàn)條探針，是世界上最高密度的探針技術(shù)。將片基羥基化保護(hù)后，通過(guò)光刻掩膜（photolithographic mask）的覆蓋調(diào)控激光對(duì)片基的照射，從而促使相應(yīng)片基部位脫羥基而活化。進(jìn)而，與后續(xù)加入的 3端活化(5羥基末端連接光敏保護(hù)基團(tuán))單一核苷酸單體底物發(fā)生循環(huán)偶聯(lián)反應(yīng)，而實(shí)現(xiàn)原位寡核苷酸的。待檢測(cè)樣本利用體外轉(zhuǎn)

52、錄的方式進(jìn)行擴(kuò)增和生物素標(biāo)記，標(biāo)記后雜交、洗滌、染色、掃描獲得原始圖像文件安捷倫的制造工藝為享有專(zhuān)利的噴墨打印化學(xué)原位技術(shù)（ink-jet chemicalinsitusynthesis）。非接觸式的探針技術(shù)保證了每一個(gè)探針樣點(diǎn)的制作準(zhǔn)確度，精度的高度均一化，極大地減少了間的差異和實(shí)驗(yàn)可以完整準(zhǔn)確的60mer 的長(zhǎng)寡核苷酸探針，極大地提高了檢測(cè)的靈敏度，并且使的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)具有無(wú)與倫比的靈活應(yīng)用特性。23 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）目的：功能的研究。通過(guò)可以大規(guī)模，高通量地對(duì)成千上萬(wàn)個(gè)同時(shí)進(jìn)行表達(dá)豐度檢測(cè)。原理：的原理是利用堿基互補(bǔ)雜交，即以熒光或生物素標(biāo)記的樣品，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的表達(dá)研究。帶有熒光或生物素標(biāo)記的目的片段與固定在片基上序列互補(bǔ)的探針雜交后，通過(guò)掃描儀獲得熒光或生物素信號(hào)強(qiáng)度，借以反應(yīng)的表達(dá)豐度。伯豪生物的雜交原理圖的原理圖24 / 87技術(shù)服務(wù)Tel：/ Web：上海市張江高科技園區(qū)李冰路 151 號(hào)（201203）步驟：1. 樣品的準(zhǔn)備： 總RNA 抽提、逆轉(zhuǎn)錄、體外轉(zhuǎn)錄、標(biāo)記2. 雜交、掃描獲得信號(hào)強(qiáng)度。當(dāng)前掃描儀主要是應(yīng)用激光共聚焦顯微掃描技術(shù)，以便于對(duì)高密度探針