分子熒光分析n

1、1第三章第三章 分子熒光分析法分子熒光分析法Chapter 3 Molecular Fluorescence2第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、分子熒光分析法一、分子熒光分析法利用利用物質(zhì)分子物質(zhì)分子的的熒光熒光進行分析測定的方法進行分析測定的方法3第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、分子熒光分析法一、分子熒光分析法利用利用物質(zhì)分子物質(zhì)分子的的熒光熒光進行分析測定的方法進行分析測定的方法化合物分子化合物分子吸收吸收電磁波電磁波并并發(fā)射出發(fā)射出另一波長電磁波另一波長電磁波二、分子熒光與熒光量子效二、分子熒光與熒光量子效(產(chǎn)產(chǎn))率率1. 分子熒光分子熒光2. 熒光量子效熒光量子效(產(chǎn)產(chǎn))率率 熒光分子發(fā)射與吸收的光

2、量子數(shù)之比熒光分子發(fā)射與吸收的光量子數(shù)之比)()(affII吸收的光強度熒光強度吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)l lex、I0l lem、If定性定性定量定量激發(fā)光激發(fā)光發(fā)射光發(fā)射光4第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、分子熒光分析法一、分子熒光分析法二、分子熒光與熒光量子效二、分子熒光與熒光量子效(產(chǎn)產(chǎn))率率affII /利用利用物質(zhì)分子物質(zhì)分子的的熒光熒光進行分析測定的方法進行分析測定的方法三、溶液的熒光強度三、溶液的熒光強度KclcIIff03 . 2熒光定量分析基本關(guān)系式熒光定量分析基本關(guān)系式熒光溶液的吸光度熒光溶液的吸光度0.05該關(guān)系式是如何得來的？該關(guān)系式是如何得來的？affII /affI

3、IclIIAt0log)1 (3 . 200cltaeIIIIclclteIII3 .20010)1 (3 . 20clffeII ! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 21323 . 2clclcleclclecl3 . 213 . 2若若05.0lcKclcIIff03 . 25第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、分子熒光分析法一、分子熒光分析法二、分子熒光與熒光量子效二、分子熒光與熒光量子效(產(chǎn)產(chǎn))率率affII /利用利用物質(zhì)分子物質(zhì)分子的的熒光熒光進行分析測定的方法進行分析測定的方法三、溶液的熒光強度三、溶液的熒光強度KclcIIff03 . 2熒光定量分析基本關(guān)系式熒光定量分析基本

4、關(guān)系式熒光溶液的吸光度熒光溶液的吸光度0.05四、溶液熒光的猝滅四、溶液熒光的猝滅熒光物質(zhì)分子其它物質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象熒光物質(zhì)分子其它物質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象熒光猝滅法熒光猝滅法6第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀7第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源I0透射光透射光檢測器檢測器信號顯示系統(tǒng)信號顯示系統(tǒng)FIt狹縫狹縫8第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件1.

5、 光源光源為熒光測定提供為熒光測定提供足夠強度的足夠強度的、穩(wěn)定的穩(wěn)定的激發(fā)光激發(fā)光氙燈氙燈、高壓汞燈、激光器、高壓汞燈、激光器發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器9第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件1. 光源光源氙燈、高壓汞燈、激光器氙燈、高壓汞燈、激光器2. 激發(fā)單色器激發(fā)單色器將光源發(fā)出的復(fù)合光分解為單色光將光源發(fā)出的復(fù)合光分解為單色光干涉濾光片、干涉濾光片、光柵光柵發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器10

6、第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件1. 光源光源氙燈、高壓汞燈、激光器氙燈、高壓汞燈、激光器2. 激發(fā)單色器激發(fā)單色器干涉濾光片、光柵干涉濾光片、光柵熔融石英熔融石英盛放試樣的容器盛放試樣的容器不吸光、無熒光、四壁透明不吸光、無熒光、四壁透明3. 吸收池吸收池發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器11第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件1. 光源光源氙燈、高壓汞燈、

7、激光器氙燈、高壓汞燈、激光器2. 激發(fā)單色器激發(fā)單色器干涉濾光片、光柵干涉濾光片、光柵熔融石英熔融石英四壁透明四壁透明3. 吸收池吸收池將熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光分解為單色光將熒光物質(zhì)產(chǎn)生的熒光分解為單色光4. 發(fā)射單色器發(fā)射單色器光柵光柵發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器12第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件1. 光源光源氙燈、高壓汞燈、激光器氙燈、高壓汞燈、激光器2. 激發(fā)單色器激發(fā)單色器干涉濾光片、光柵干涉濾光片、光柵熔融石英熔融石英四壁透明四壁透明3.

8、 吸收池吸收池4. 發(fā)射單色器發(fā)射單色器光柵光柵將熒光信號轉(zhuǎn)換為電學(xué)信號將熒光信號轉(zhuǎn)換為電學(xué)信號光電管、光電管、光電倍增管光電倍增管、CCD、二極管陣列、光子計數(shù)器、二極管陣列、光子計數(shù)器5. 檢測器檢測器靈敏度高靈敏度高發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器13第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件三、激發(fā)光選擇與激發(fā)光譜三、激發(fā)光選擇與激發(fā)光譜激發(fā)光譜：熒光強度與激發(fā)光波長間的關(guān)系曲線。激發(fā)光譜：熒光強度與激發(fā)光波長間的關(guān)系曲線。激發(fā)光波長：激發(fā)光波長： 最

9、大激發(fā)波長最大激發(fā)波長 l lex與紫外吸收光譜一致與紫外吸收光譜一致發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器14第二節(jié)第二節(jié) 熒光光譜儀熒光光譜儀一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)一、熒光光譜儀的基本結(jié)構(gòu)二、熒光光譜儀的主要部件二、熒光光譜儀的主要部件三、激發(fā)光選擇與激發(fā)光譜三、激發(fā)光選擇與激發(fā)光譜最大激發(fā)波長最大激發(fā)波長 l lex四、發(fā)射光選擇與發(fā)射光譜四、發(fā)射光選擇與發(fā)射光譜發(fā)射光譜：熒光強度與發(fā)射光波長間的關(guān)系曲線。發(fā)射光譜：熒光強度與發(fā)射光波長間的關(guān)系曲線。與激發(fā)光波長無關(guān)與激發(fā)光波長無關(guān)發(fā)射光波長：發(fā)射光波長： 最大發(fā)射波長最大發(fā)射波長 l lemS

10、tokes位移位移鏡像規(guī)則鏡像規(guī)則發(fā)射光發(fā)射光單色器單色器樣品池樣品池激發(fā)光激發(fā)光單色器單色器光源光源檢測器檢測器15第三節(jié)第三節(jié) 分子熒光分析法的應(yīng)用分子熒光分析法的應(yīng)用二、熒光定性分析二、熒光定性分析很少采用很少采用利用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜實現(xiàn)利用熒光激發(fā)和發(fā)射光譜實現(xiàn)三、熒光定量分析三、熒光定量分析標(biāo)準(zhǔn)曲線法標(biāo)準(zhǔn)曲線法與紫外與紫外-可見分光光度法相同可見分光光度法相同KcIf標(biāo)準(zhǔn)對比法標(biāo)準(zhǔn)對比法A0.05定量依據(jù)定量依據(jù)定量方法定量方法一、熒光分析法的特點一、熒光分析法的特點1. 靈敏度高靈敏度高(1100ppb)暗背景下測量暗背景下測量2. 選擇性好選擇性好3. 提供的物理參數(shù)較多提供的

11、物理參數(shù)較多4. 方法簡便、試樣用量少方法簡便、試樣用量少16第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光激發(fā)能量激發(fā)能量激發(fā)激發(fā)定性定性l lI I樣品樣品樣品樣品發(fā)射發(fā)射定量定量激發(fā)能量激發(fā)能量電磁波電磁波化學(xué)能化學(xué)能生物能生物能分子發(fā)光分子發(fā)光熒光、磷光熒光、磷光化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光生物發(fā)光生物發(fā)光分子發(fā)光分析的特點分子發(fā)光分析的特點靈敏度高、選擇性好靈敏度高、選擇性好光致發(fā)光光致發(fā)光化合物分子化合物分子吸收能量吸收能量從基態(tài)電子能級從基態(tài)電子能級躍遷躍遷至激發(fā)態(tài)，若其返回至激發(fā)態(tài)，若其返回基態(tài)時基態(tài)時釋放出電磁輻射釋放出電磁輻射，則產(chǎn)生分子發(fā)光。，

12、則產(chǎn)生分子發(fā)光。17第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生1. 分子的激發(fā)分子的激發(fā)基態(tài)基態(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)激發(fā)激發(fā) 單重態(tài)單重態(tài)激發(fā)激發(fā) 三重態(tài)三重態(tài)18第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)1. 分子的激發(fā)分子的激發(fā)2. 激發(fā)態(tài)分子的去活化激發(fā)態(tài)分子的去活化a. 振動馳豫振動馳豫激發(fā)激發(fā) 單重態(tài)單重態(tài)激發(fā)激發(fā) 三重態(tài)三重態(tài)激發(fā)態(tài)分子將過剩的激發(fā)態(tài)分子將過剩的振動能振動能量量以以

13、熱熱的形式傳遞給周圍分的形式傳遞給周圍分子，從而失活到該電子能級子，從而失活到該電子能級的較低振動能層。的較低振動能層。19第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生1. 分子的激發(fā)分子的激發(fā)2. 激發(fā)態(tài)分子的去活化激發(fā)態(tài)分子的去活化a. 振動馳豫振動馳豫b. 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換激發(fā)態(tài)分子通過振動能層間激發(fā)態(tài)分子通過振動能層間的重疊由的重疊由較高電子能級較高電子能級失活失活到到較低電子能級的較高振動較低電子能級的較高振動能層能層。激發(fā)激發(fā) 單重態(tài)單重態(tài)激發(fā)激發(fā) 三重態(tài)三重態(tài)激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)

14、20第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生1. 分子的激發(fā)分子的激發(fā)2. 激發(fā)態(tài)分子的去活化激發(fā)態(tài)分子的去活化a. 振動馳豫振動馳豫b. 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換激發(fā)激發(fā) 單重態(tài)單重態(tài)激發(fā)激發(fā) 三重態(tài)三重態(tài)處于處于第一單重激發(fā)態(tài)最低振第一單重激發(fā)態(tài)最低振動能層動能層的熒光分子，的熒光分子，發(fā)射光發(fā)射光子子返回基態(tài)的過程。返回基態(tài)的過程。c. 熒光發(fā)射熒光發(fā)射激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)21第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和

15、磷光的產(chǎn)生1. 分子的激發(fā)分子的激發(fā)2. 激發(fā)態(tài)分子的去活化激發(fā)態(tài)分子的去活化a. 振動馳豫振動馳豫b. 內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換兩個電子能態(tài)的振動能層間兩個電子能態(tài)的振動能層間有較大重疊時，有較大重疊時，不同多重態(tài)不同多重態(tài)間的轉(zhuǎn)換間的轉(zhuǎn)換。激發(fā)激發(fā) 單重態(tài)單重態(tài)激發(fā)激發(fā) 三重態(tài)三重態(tài)處于處于第一單重激發(fā)態(tài)最低振動能層第一單重激發(fā)態(tài)最低振動能層的熒光分子，的熒光分子，發(fā)射光子發(fā)射光子返回基返回基態(tài)的過程。態(tài)的過程。d. 系間跨越與磷光發(fā)射系間跨越與磷光發(fā)射c. 熒光發(fā)射熒光發(fā)射熒光與磷光的判斷：激發(fā)光去除后，熒光立即消失，磷光不會立熒光與磷光的判斷：激發(fā)光去除后，熒光立即消失，磷光不會立即消失。即消失。

16、激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)激發(fā)單重態(tài)、激發(fā)三重態(tài)22第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生光致激發(fā)，發(fā)射電磁波光致激發(fā)，發(fā)射電磁波三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須能夠吸收激發(fā)光分子必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率分子必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率)()(affII吸收的光強度熒光強度吸收的光量子數(shù)發(fā)射的光量子數(shù)與激發(fā)態(tài)分子失活過程的速率常數(shù)有關(guān)與激發(fā)態(tài)分子失活過程的速率常數(shù)有關(guān)ifffkkk1. 分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子熒光產(chǎn)生的必備條件23第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子

17、熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生光致激發(fā)，發(fā)射電磁波光致激發(fā)，發(fā)射電磁波三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1. 分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子熒光產(chǎn)生的必備條件吸光，一定的熒光量子產(chǎn)率吸光，一定的熒光量子產(chǎn)率a. 躍遷類型躍遷類型p pp p*躍遷熒光效率較高。躍遷熒光效率較高。b. 共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強。共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強。0.070.180.930.272. 分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系24第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子

18、熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生光致激發(fā)，發(fā)射電磁波光致激發(fā)，發(fā)射電磁波三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1. 分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子熒光產(chǎn)生的必備條件吸光，一定的熒光量子產(chǎn)率吸光，一定的熒光量子產(chǎn)率a. 躍遷類型躍遷類型p pp p*躍遷熒光效率較高。躍遷熒光效率較高。b. 共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強。共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強。2. 分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系c. 剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)0.18125第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分

19、子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生光致激發(fā)，發(fā)射電磁波光致激發(fā)，發(fā)射電磁波三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系1. 分子熒光產(chǎn)生的必備條件分子熒光產(chǎn)生的必備條件吸光，一定的熒光量子產(chǎn)率吸光，一定的熒光量子產(chǎn)率a. 躍遷類型躍遷類型p pp p*躍遷熒光效率較高。躍遷熒光效率較高。b. 共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強。共軛體系越大、共軛程度越高，熒光越強。2. 分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系c. 剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)供電子基團供電子基團：增強；：增強；吸電子基團吸電子基團：減弱。：減弱。重原子效應(yīng)重原子效應(yīng)：熒光減弱、磷光增強。

20、：熒光減弱、磷光增強。d. 取代基效應(yīng)取代基效應(yīng)FClBrI0.160.050.01026第四節(jié)第四節(jié) 分子熒光的產(chǎn)生分子熒光的產(chǎn)生一、分子發(fā)光與分子熒光一、分子發(fā)光與分子熒光二、熒光和磷光的產(chǎn)生二、熒光和磷光的產(chǎn)生光致激發(fā)，發(fā)射電磁波光致激發(fā)，發(fā)射電磁波三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系三、熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系p pp p*，共軛，剛性結(jié)構(gòu)，取代基，共軛，剛性結(jié)構(gòu)，取代基四、影響溶液熒光強度的因素四、影響溶液熒光強度的因素一般溶劑效應(yīng)一般溶劑效應(yīng)特殊溶劑效應(yīng)特殊溶劑效應(yīng)介電常數(shù)、折射率介電常數(shù)、折射率溶劑與熒光物質(zhì)間的特殊作用溶劑與熒光物質(zhì)間的特殊作用1. 溶劑影響溶劑影響2. 溫度影響溫度影響溫度升

21、高，熒光減弱溫度升高，熒光減弱3. pH影響影響改變含有酸堿官能團分子的結(jié)構(gòu)改變含有酸堿官能團分子的結(jié)構(gòu)4. 內(nèi)濾光作用與自吸現(xiàn)象內(nèi)濾光作用與自吸現(xiàn)象干擾物質(zhì)和溶液濃度干擾物質(zhì)和溶液濃度5. 散射光的影響散射光的影響NH2NH3H+OH-27第四節(jié)第四節(jié) 熒光分析新技術(shù)簡介熒光分析新技術(shù)簡介28什么是分子熒光？（分子發(fā)光與分子熒光的定義）什么是分子熒光？（分子發(fā)光與分子熒光的定義）分子熒光是如何產(chǎn)生的？（分子發(fā)光的基本原理）分子熒光是如何產(chǎn)生的？（分子發(fā)光的基本原理）分子熒光是如何測量的？（熒光光度計、激發(fā)光譜、發(fā)射光譜）分子熒光是如何測量的？（熒光光度計、激發(fā)光譜、發(fā)射光譜）什么物質(zhì)可產(chǎn)生分子熒光？什么物質(zhì)可產(chǎn)生分子熒光？什么因素影響化合物的熒光強度？什么因素影響化合物的熒光強度？分子熒光法如何進行定性和定量分析？分子熒光法如何進行定性和定量分析？29一、什么是分子發(fā)光？分子發(fā)光有哪幾類？一、什么是分子發(fā)光？分子發(fā)光有哪幾類