克隆動(dòng)物培育技術(shù)

1、現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁(yè)，共52頁(yè)（一）全能性的概念（一）全能性的概念全能性全能性(totipotency) (totipotency) 是指分裂球發(fā)育成為是指分裂球發(fā)育成為完整胚胎的能力。包括細(xì)胞發(fā)育全能性和細(xì)完整胚胎的能力。包括細(xì)胞發(fā)育全能性和細(xì)胞核發(fā)育全能性。胞核發(fā)育全能性?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁(yè)，共52頁(yè) 細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱稱(chēng)為發(fā)育潛能。 根據(jù)發(fā)育潛能可以將細(xì)胞分成全能性、多能性、單能性細(xì)胞及終末分化細(xì)胞。 受精卵以及胚胎干細(xì)胞的發(fā)育具有全能性；多能造血干細(xì)胞具有的發(fā)育潛能稱(chēng)為多能性

2、；終末分化細(xì)胞，如人的成熟紅細(xì)胞 。 細(xì)胞全能性的基礎(chǔ)在于所有細(xì)胞的細(xì)胞核包含一個(gè)物種的全套染色體組，具有發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體所需要的全部遺傳物質(zhì)。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁(yè)，共52頁(yè) 細(xì)胞核的全能性是指一個(gè)細(xì)胞核具有該物種完整的遺傳信息，在適當(dāng)條件下能夠發(fā)育成一個(gè)完整個(gè)體的能力。 將分化的細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入去核的卵細(xì)胞或受精卵，發(fā)育成一個(gè)完整的個(gè)體（如體細(xì)胞克隆動(dòng)物），就是細(xì)胞核全能性?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁(yè)，共52頁(yè)1 1、動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞的全能性、動(dòng)物早期胚胎細(xì)胞的全能性 德國(guó)Virchow R. 論斷“細(xì)胞來(lái)自細(xì)胞”。Roux(1888) 用燒燙的針破壞蛙2細(xì)胞胚胎。Driesch(1892)以海膽做

3、實(shí)驗(yàn)。 Spemann（19011903）用細(xì)發(fā)結(jié)扎蠑螈受精卵。Roux(1888)用燒燙的針破壞蛙用燒燙的針破壞蛙2細(xì)細(xì)胞胚胎觀察胚胎發(fā)育情況胞胚胎觀察胚胎發(fā)育情況 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁(yè)，共52頁(yè)Spemann 蠑螈受精卵結(jié)扎實(shí)驗(yàn)蠑螈受精卵結(jié)扎實(shí)驗(yàn) 兩棲類(lèi)的核移植實(shí)驗(yàn)兩棲類(lèi)的核移植實(shí)驗(yàn) 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁(yè)，共52頁(yè)Spemann的蠑螈受精卵結(jié)扎實(shí)驗(yàn)的蠑螈受精卵結(jié)扎實(shí)驗(yàn)(1938) 用頭發(fā)將受精卵沿第一次卵裂面結(jié)扎成2個(gè)半球，使細(xì)胞核留在其中的一個(gè)半球中，兩半球之間留有一條小縫隙，當(dāng)有核的一側(cè)發(fā)育到8細(xì)胞期時(shí)，另一側(cè)還未開(kāi)始分裂；當(dāng)有核的一側(cè)發(fā)育到16細(xì)胞期時(shí)，一個(gè)細(xì)胞核進(jìn)入無(wú)核的一側(cè)，此時(shí)將胚

4、胎完全結(jié)扎；140 d后，每一側(cè)都發(fā)育成為一個(gè)完整的胚胎。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁(yè)，共52頁(yè)1952年，美國(guó)科學(xué)家年，美國(guó)科學(xué)家Briggs和和King以美洲豹蛙做核移植實(shí)驗(yàn)。以美洲豹蛙做核移植實(shí)驗(yàn)。將未分化的蛙囊胚細(xì)胞的細(xì)胞核移植到蛙去核受精卵中，獲得將未分化的蛙囊胚細(xì)胞的細(xì)胞核移植到蛙去核受精卵中，獲得了正常發(fā)育的蝌蚪。了正常發(fā)育的蝌蚪。后來(lái)的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：蛙胚胎細(xì)胞核的發(fā)育潛能隨著胚后來(lái)的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論：蛙胚胎細(xì)胞核的發(fā)育潛能隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)程、細(xì)胞分化的提高而逐步下降。胎發(fā)育的進(jìn)程、細(xì)胞分化的提高而逐步下降?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁(yè)，共

5、52頁(yè) 1981年，瑞士科學(xué)家Illmensee和美國(guó)科學(xué)家Hoppe首次報(bào)道哺乳動(dòng)物細(xì)胞核移植獲得成功。ICR(白色白色)ICR(白色白色)(棕色棕色)(黑色黑色)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁(yè)，共52頁(yè) 1983年，McGrath和Solt結(jié)合顯微技術(shù)與細(xì)胞融合技術(shù)，將單細(xì)胞期小鼠胚胎與未受精卵用病毒誘導(dǎo)融合的方法獲得了后代 。 1996年，Campbell等采集9d齡的綿羊胚胎進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以培養(yǎng)液中血清濃度遞減的饑餓培養(yǎng)，誘導(dǎo)6-13代細(xì)胞進(jìn)入靜止期，移入去核的卵母細(xì)胞，產(chǎn)下了克隆羊。這是用已分化細(xì)胞系經(jīng)誘導(dǎo)進(jìn)入Go期核移植產(chǎn)下的首例克隆羊?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁(yè)，共52頁(yè) 1997年，英國(guó) Ro

6、slin研究所的Wilmut等用乳腺細(xì)胞核移植培育克隆綿羊“多莉 (Dolly)”。Wilmut等采用6歲母羊（白面）懷孕3個(gè)月時(shí)的乳腺細(xì)胞進(jìn)行核移植。供體核在血清濃度從10降至0.5的培養(yǎng)液中誘導(dǎo)至靜止期，然后移入去核卵母細(xì)胞，發(fā)育為桑椹胚和囊胚再移植到受體母羊（黑面），結(jié)果產(chǎn)羔l頭（白面） ，即著名的“多莉”。這是世界上首次用體細(xì)胞克隆獲得的后代，劃時(shí)代現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁(yè)，共52頁(yè) 早期使用原核期的受精卵和2細(xì)胞胚胎。1986年后采用去核的處在M期(第二次分裂中期)的成熟卵母細(xì)胞作胞質(zhì)受體。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁(yè)，共52頁(yè) Gurdon（1966）研究發(fā)現(xiàn)，

7、核在移植前轉(zhuǎn)錄rRNA基因，移入卵后，核仁消失，rRNA基因失活；隨著胚胎的發(fā)育，rRNA基因活性恢復(fù)，核仁重現(xiàn)。表明卵細(xì)胞質(zhì)對(duì)核活性有重構(gòu)效應(yīng)。 事實(shí)上，核重編程同核質(zhì)間蛋白質(zhì)交換有關(guān)。許多細(xì)胞質(zhì)因子，如組蛋白(去)、乙酰化酶、DNA甲基化/去甲基化酶等進(jìn)入核內(nèi)；核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如異染色質(zhì)蛋白、組蛋白H1等輸出核外。（1 1） 核質(zhì)互作核質(zhì)互作現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁(yè)，共52頁(yè) 核重編程的過(guò)程就是基因重新被激活的過(guò)程。 體細(xì)胞去分化過(guò)程伴隨著與染色質(zhì)相關(guān)的蛋白(如連接組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子)的重構(gòu)、基因組甲基化變化、組蛋白組裝及核小體形成等。染色質(zhì)解聚對(duì)核重編程可能是必須的。 核重編程涉及到基因組DNA

8、甲基/去甲基化和組蛋白乙?；?。通過(guò)基因組甲基化來(lái)改變DNA與蛋白質(zhì)間的作用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁(yè)，共52頁(yè) 在細(xì)胞分化過(guò)程中，核重編程須去除染色質(zhì)上的獲得性修飾。 牛成纖維細(xì)胞核克隆胚胎的端粒酶活性比胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的端粒酶活性顯著降低；用血清饑餓法進(jìn)行細(xì)胞傳代，與不經(jīng)處理的早期傳代細(xì)胞相比，端粒酶活性降低30%-50%。 體外培養(yǎng)牛胎兒成纖維細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞晚期傳代中發(fā)現(xiàn)了端?？s短。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁(yè)，共52頁(yè) 細(xì)胞周期分四個(gè)時(shí)期，包括G1期，S期，G2期，M期。有絲分裂中，成熟促進(jìn)因子（也叫M期促進(jìn)因子MPF ）調(diào)控細(xì)胞由間期向M期轉(zhuǎn)變。 核受體一般是M期卵母細(xì)胞，但是M期卵

9、母細(xì)胞MPF的含量依然很高，將誘導(dǎo)移植核發(fā)生一系列的形態(tài)變化，包括核膜破裂(NEBD)，早熟染色體凝集(PCC)。只能將G1期(二倍體)的核移入未經(jīng)活化的M期的卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，才能獲得染色體倍體正常且能正常發(fā)育的重組胚胎?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁(yè)，共52頁(yè) 具有全能性的細(xì)胞核是否具有重編程的能力，主要取決于細(xì)胞質(zhì)啟動(dòng)供體核重新編程的因子。 核重編程涉及到基因組DNA甲基/去甲基化和組蛋白乙?；?。 在細(xì)胞分化過(guò)程中，核重編程須去除染色質(zhì)上的獲得性修飾。與端粒酶活性降低、端粒縮短有關(guān) ?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁(yè)，共52頁(yè) 動(dòng)物克隆技術(shù)方法可分為胚胎分割、胚胎嵌合、細(xì)胞

10、核移植、雌核或雄核發(fā)育等。 細(xì)胞核移植方法又分為胚胎細(xì)胞核移植、胚胎干細(xì)胞核移植、胎兒成纖維細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植等。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁(yè)，共52頁(yè)供體細(xì)胞（核供體）的準(zhǔn)備。供體細(xì)胞（核供體）的準(zhǔn)備。受體細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)受體）的準(zhǔn)備。受體細(xì)胞（細(xì)胞質(zhì)受體）的準(zhǔn)備。核移植。核移植。核質(zhì)融合及卵母細(xì)胞質(zhì)的激活。核質(zhì)融合及卵母細(xì)胞質(zhì)的激活。重構(gòu)胚的培養(yǎng)和移植。重構(gòu)胚的培養(yǎng)和移植。重復(fù)克隆。重復(fù)克隆?？寺?dòng)物的鑒定?？寺?dòng)物的鑒定。其基本技術(shù)環(huán)節(jié)除顯微操作技術(shù)外，主要包括其基本技術(shù)環(huán)節(jié)除顯微操作技術(shù)外，主要包括 ：現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁(yè)，共52頁(yè)細(xì)胞核移植技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物克隆的主要步驟，包括供體細(xì)胞的選

11、擇、受體細(xì)胞的去核、核移植、胚胎融合、重構(gòu)胚胎移植，以及連續(xù)核移植等等?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十八頁(yè)，共52頁(yè)常用的供體細(xì)胞有常用的供體細(xì)胞有3大類(lèi)：早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和大類(lèi)：早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞。核移植時(shí)可以將整個(gè)細(xì)胞作為供體，也可以挑體細(xì)胞。核移植時(shí)可以將整個(gè)細(xì)胞作為供體，也可以挑取細(xì)胞核或含有少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞移植到受體中取細(xì)胞核或含有少量細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞移植到受體中 供體細(xì)胞的準(zhǔn)備方面，通常采用建立細(xì)胞系的辦法供體細(xì)胞的準(zhǔn)備方面，通常采用建立細(xì)胞系的辦法 。包括：。包括： 胚胎干細(xì)胞系的建立。胚胎干細(xì)胞系的建立。 TNT4細(xì)胞系的建立。細(xì)胞系的建立。 將供體細(xì)胞的細(xì)胞周期做同步法

12、處理，即將供體細(xì)胞的細(xì)胞周期做同步法處理，即G0期的誘導(dǎo)。期的誘導(dǎo)。方法是：在方法是：在5d內(nèi)將培養(yǎng)液的血清濃度由內(nèi)將培養(yǎng)液的血清濃度由10.0%降至降至0.5%。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十九頁(yè)，共52頁(yè) 受體細(xì)胞有3類(lèi)：卵母細(xì)胞、原核期受精卵和2細(xì)胞期胚胎細(xì)胞。 獲得卵母細(xì)胞多采用活體超排的方法。 卵母細(xì)胞的去核目前多采用顯微操作法，即在顯微鏡下用外徑為20m的微細(xì)玻璃管吸管吸取細(xì)胞核。常用的去核方法有盲吸法、半卵法和功能去核法等。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十頁(yè)，共52頁(yè) 在顯微操作儀下將供體細(xì)胞核移入受體細(xì)胞中。根據(jù)供體移入到受體細(xì)胞的不同部位，可以分為帶下（透明帶下）注射和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第

13、三十一頁(yè)，共52頁(yè)核質(zhì)融合的方法有：(1)病毒融合法 如將仙臺(tái)病毒與供體核一起注入去核的受精卵中，促進(jìn)細(xì)胞融合。 (2)電融合法 將重構(gòu)胚置于電場(chǎng)下，以電脈沖促進(jìn)融合。(3)Honolulu技術(shù) 利用吸液管將遺傳物質(zhì)取出，然后注入卵細(xì)胞中。以機(jī)械和化學(xué)激活方式促使重構(gòu)胚的融合?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十二頁(yè)，共52頁(yè)一種是體外培養(yǎng)，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)到一定時(shí)期，然后進(jìn)行胚胎移植。另一種方法是采用中間受體培養(yǎng)，在核質(zhì)融合后，將重構(gòu)胚用瓊脂糖包埋，移入動(dòng)物的輸卵管或子宮，發(fā)育到桑椹胚或囊胚后，再重新移入假孕受體子宮。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十三頁(yè)，共52頁(yè) 如有必要，將核移植胚胎培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚后繼續(xù)做核

14、供體重復(fù)克隆，可以顯著提高克隆成活率?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十四頁(yè)，共52頁(yè) 克隆動(dòng)物出生后，從形態(tài)、性別上和分子生物學(xué)水平上鑒定，以確定所克隆的動(dòng)物在遺傳上是否真的來(lái)源于供體細(xì)胞系。 分子生物學(xué)鑒定方法有PCR、Southern、Northern等。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十五頁(yè)，共52頁(yè)克隆綿羊多莉（Dolly）的培育示意圖 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十六頁(yè)，共52頁(yè) 技術(shù)關(guān)鍵：一是使精子的遺傳物質(zhì)失活且保持精子激技術(shù)關(guān)鍵：一是使精子的遺傳物質(zhì)失活且保持精子激活卵子發(fā)育的能力；二是誘導(dǎo)卵子二倍體形成?；盥炎影l(fā)育的能力；二是誘導(dǎo)卵子二倍體形成。 使精子遺傳物質(zhì)失活的辦法一般是采用輻射處理使精子遺傳物質(zhì)失活的辦法一

15、般是采用輻射處理(如如線(xiàn)、線(xiàn)、X射線(xiàn)、紫外線(xiàn)等射線(xiàn)、紫外線(xiàn)等)。 誘導(dǎo)卵子二倍體形成的辦法，一是在受精后不久抑誘導(dǎo)卵子二倍體形成的辦法，一是在受精后不久抑制第二極體排出；二是在受精卵第一次卵裂時(shí)，抑制第二極體排出；二是在受精卵第一次卵裂時(shí)，抑制有絲分裂。可以用溫度制有絲分裂。可以用溫度(冷休克或熱休克冷休克或熱休克)、靜水、靜水壓和化學(xué)壓和化學(xué)(秋水仙素、細(xì)胞松弛素秋水仙素、細(xì)胞松弛素B等等)等方法。等方法?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十七頁(yè)，共52頁(yè)在受精過(guò)程的原核期中用顯微手術(shù)操作把雄性原核吸出，再把變成單倍體的卵子用細(xì)胞松弛素B處理回復(fù)到二倍體之后，再移植到假孕動(dòng)物，使之發(fā)育成胎仔?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三

16、十八頁(yè)，共52頁(yè) 紅鯽紅鯽 鯉魚(yú)鯉魚(yú) 卵卵 子子 精精 子子 紫外燈照射紫外燈照射 ( (激活激活) () (遺傳物質(zhì)滅活遺傳物質(zhì)滅活) (30W,45min) (30W,45min) 單倍體胚胎單倍體胚胎冷休克冷休克(0(044，30min)30min) 二倍體胚胎二倍體胚胎純合二倍體紅鯽純合二倍體紅鯽( (近交系近交系) )現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三十九頁(yè)，共52頁(yè) 選擇兩對(duì)毛色不同的近交系小鼠（例如白色的SJL小鼠與黑色的BL/10小鼠）。在8分裂球時(shí)，用蛋白酶消化透明帶，在37的條件下，將來(lái)自?xún)蓚€(gè)品系的兩種分裂球彼此接觸，任其粘成一個(gè)具有雙倍體積的早期胚胎，繼續(xù)培養(yǎng)成胚囊，移植到寄養(yǎng)母鼠的子宮內(nèi)

17、。新生小鼠表現(xiàn)出黑、白條或塊狀的毛色，說(shuō)明是一只嵌合體小鼠。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十頁(yè)，共52頁(yè)嵌合體小鼠培育過(guò)程嵌合體小鼠培育過(guò)程 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十一頁(yè)，共52頁(yè) 用顯微術(shù)將未著床的早期胚胎一分為二、四或更多，然后分別移植給受體，妊娠產(chǎn)仔。 胚胎分割不是嚴(yán)格意義上的克隆。 胚胎分割已得到多種動(dòng)物的胚胎雙生后代，如兔、小鼠、綿羊、牛、山羊、馬和豬的同胚雙生后代。 80年代以來(lái)，牛胚胎二分割已應(yīng)用于生產(chǎn)。 胚胎分割是胚胎移植的重要措施，也是性別鑒定和核移植等生物工程的基本技術(shù)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十二頁(yè)，共52頁(yè)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十三頁(yè)，共52頁(yè) 克隆技術(shù)為近交系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育提供了新途徑，通過(guò)這一途徑培育

18、的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，遺傳組成完全一致，并且比用傳統(tǒng)的近親繁殖方法更省時(shí)，品系更純?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十四頁(yè)，共52頁(yè) 豬的器官在大小、形狀及生理特點(diǎn)等方面與人的器官非常相似?？梢詫⒇i作為異體器官移植的供體。 在異源移植方面，最主要的問(wèn)題就是急性排斥問(wèn)題。將豬細(xì)胞的細(xì)胞膜上的A-1，3-半乳糖昔酶基因敲除或經(jīng)過(guò)修飾去除其免疫原性，可以解決豬器官在人體的急性排斥問(wèn)題?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四十五頁(yè)，共52頁(yè) 治療性克隆是指利用克隆技術(shù)結(jié)合人的胚胎干細(xì)胞分離技術(shù)，在體外培養(yǎng)人體細(xì)胞、組織或器官來(lái)修復(fù)人體損傷的細(xì)胞、組織或器官的過(guò)程。 將病人自身體細(xì)胞移植到去核的卵母細(xì)胞內(nèi)形成重構(gòu)胚，從重構(gòu)胚中分離出ES細(xì)胞，并誘導(dǎo)其定向分化為