分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告封面

1、生命學(xué)院09級(jí)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告專業(yè)：生物醫(yī)學(xué)工程班級(jí)：0902班學(xué)號(hào)：U2009125666姓名：尤書暢成績_指導(dǎo)教師_分子生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)已成為生物化學(xué)及分子生物學(xué)以及相關(guān)學(xué)科院系教學(xué)科研不可缺少的一部分。為提高學(xué)生在分子生物學(xué)技術(shù)方面的動(dòng)手能力，生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)室主要開設(shè)常用而基本的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它的內(nèi)容包括質(zhì)粒DNA的制備；DNA的重組；PCR基因擴(kuò)增等等。實(shí)驗(yàn)一 質(zhì)粒DNA的小量制備一、 實(shí)驗(yàn)原理  要把一個(gè)有用的外源基因通過基因工程手段，送進(jìn)細(xì)胞中去進(jìn)行繁殖和表達(dá)，需要運(yùn)載工具，攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的這種工具就叫載體（vector）。載體的設(shè)計(jì)和

2、應(yīng)用是DNA體外重組的重要條件。作為基因工程的載體必須具備下列條件:(1)是一個(gè)復(fù)制子，載體有復(fù)制點(diǎn)才能使與它結(jié)合的外源基因復(fù)制繁殖；（2）載體在受體細(xì)胞中能大量增殖，只有高復(fù)制率才能使外源基因在受體細(xì)胞中大量擴(kuò)增；（3）載體DNA鏈上有1到幾個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別與切割位點(diǎn)，便于外源基因的插入；（4）載體具有選擇性的遺傳標(biāo)記，如有抗四環(huán)素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，也可根據(jù)這個(gè)標(biāo)記將受體細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離篩選出來。細(xì)菌質(zhì)粒具備上述條件，它是基因工程中常用的載體之一。質(zhì)粒（plasmid）是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子，大小在1120kb之間，具有

3、雙鏈閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA分子，主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中。質(zhì)粒具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)，可表達(dá)它攜帶的遺傳信息。它可獨(dú)立游離在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，也可以整合到細(xì)菌染色體中，它離開宿主的細(xì)胞就不能存活，而它控制的許多生物學(xué)功能也是對宿主細(xì)胞的補(bǔ)償。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制，一般分為兩種類型：嚴(yán)密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，染色體不復(fù)制時(shí)，它也不復(fù)制。每個(gè)細(xì)胞內(nèi)只含有1個(gè)或幾個(gè)質(zhì)粒分子。后者的質(zhì)粒在整個(gè)細(xì)胞周期中隨時(shí)復(fù)制，在細(xì)胞里，它有許多拷貝，一般在20個(gè)以上。通常大的質(zhì)粒

4、如F因子等，拷貝數(shù)較少，復(fù)制受到嚴(yán)格控制。小的質(zhì)粒，如ColE 質(zhì)粒（含有產(chǎn)生大腸桿菌素E1基因），拷貝數(shù)較多，復(fù)制不受嚴(yán)格控制。在使用蛋白質(zhì)合成抑制劑氯霉素時(shí)，染色體DNA復(fù)制受阻，而松弛型ColE質(zhì)粒繼續(xù)復(fù)制1216h，由原來20多個(gè)拷貝可擴(kuò)增至10003000個(gè)拷貝，此時(shí)質(zhì)粒DNA占總DNA的含量由原來的2增加到4050。本實(shí)驗(yàn)分離提純化的質(zhì)粒pBR322、pUC19就是由ColE 衍生的質(zhì)粒。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括三個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。采用溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（SDS）可使細(xì)胞壁解，經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SD

5、S）處理后，細(xì)菌染色體DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在清液中。用乙醇沉淀、洗滌，可得到質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA的相對分子量一般在106107范圍內(nèi)，如質(zhì)粒pBR322的相對分子質(zhì)量為2.8×106，質(zhì)粒pUC19的相對分子質(zhì)量為1.7×106。在細(xì)胞內(nèi)，共價(jià)閉環(huán)DNA（covalently closed circular DNA，簡稱cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂，分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力，這種松弛型的分子叫做開環(huán)DNA（open circular DNA，簡稱ocDNA）。在電泳時(shí)，同一質(zhì)粒如以

6、cccDNA形式存在，它比其開環(huán)和線狀DNA的泳動(dòng)速度快，因此在本實(shí)驗(yàn)中，自制質(zhì)粒DNA在電泳凝膠中呈現(xiàn)3條區(qū)帶。二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握最常用的提取質(zhì)粒DNA的方法和檢測方法。2了解制備原理及各種試劑的作用。三、 實(shí)驗(yàn)材料和試劑材料：大腸桿菌E.coli，含pBR322質(zhì)粒。試劑：1. LB培養(yǎng)基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH調(diào)pH至7.3左右。如固體培養(yǎng)基則添加15g/L瓊脂。2. 溶液（pH8.0G.E.T緩沖液）：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/L EDTA。滅菌后存放。3. 溶液（0.2mol/LNaO

7、H(內(nèi)含1SDS)）：預(yù)先配制1SDS母液，臨用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4保存。4. 溶液（pH4.8乙酸鉀溶液）：5mol/L乙酸鉀60mL、冰乙酸11.5mL、雙蒸餾水28.5mL。5. 酚/氯仿液(V/V1/1)：酚為重蒸酚，配制時(shí)，先將氯仿中加入異戊醇，使其體積比為24:1，然后等量的加入重蒸酚，混勻，并用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)抽提幾次以平衡這一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆蓋等體積的0.01 mol/LTris-HCl(pH7.6)，4保存。6. 無水乙醇7. 70乙醇8. pH8.0 TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl、1mm

8、ol/LEDTA，其中含RNA酶20g/mL。儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、臺(tái)式高速離心機(jī)、臺(tái)式小型振蕩器、EP管(1.5mL微量離心管)、加樣器(20uLlmL)、吸頭。四、 操作步驟（一）培養(yǎng)細(xì)菌將帶有質(zhì)粒pBR322的大腸桿菌接種在含50g/mL氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜。注意：添加Amp時(shí)，須待LB培養(yǎng)基冷卻到50左右方可加入。（二）從菌落中快速提取制備質(zhì)粒DNA1取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，7500rpm離心1min。2棄上清，重復(fù)步驟1，棄上清，加入150L GET緩沖液，在渦旋混合器上充分混勻，在室溫下放置10

9、min。3加入200L新配制的0.2mol/L NaOH(內(nèi)含1SDS)，加蓋，顛倒（不要振蕩）23次，使之混勻，冰上放置4min，最多不能超過5min。4加入150L冰冷的乙酸鉀溶液。加蓋后，顛倒數(shù)次使之混勻，冰上放置15min。54，10000rpm離心5min，上清液吸至另一干凈的1.5mL Ep中，如上清液渾濁則需重新離心一次。6于上清液中加等體積酚/氯仿液，振蕩混勻，4，12000rpm離心2min，小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至另一1.5mL Ep管中，注意勿將兩液相中間的白色蛋白薄層吸出。7向上清液加入2倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置min。用離心機(jī)于10000rpm離心5min。小心吸

10、去上清液，將離心管倒置于一張紙巾上，以使所有液體流出。8用0.5mL 70乙醇洗滌沉淀一次，10000rpm離心3min，除盡乙醇，室溫自然干燥(將離心管倒置于一張紙巾上)，備用。9用25uL含無DNA酶的胰RNase(20 ugmL)的TE重新溶解DNA，置于4保存，供下午電泳使用。貯存于-20備用，可長期保存。五、 注意事項(xiàng)1收集菌體提質(zhì)粒前，培養(yǎng)基要去除干凈，同時(shí)保證菌體在懸浮液中充分懸浮。2在添加溶液與溶液后溶液的混合一定要柔和，采用上下顛倒的方法，千萬不能在旋轉(zhuǎn)器上劇烈振蕩。其中加入溶液后，溶液變成澄清，并有黏性；加入溶液后，出現(xiàn)絮狀沉淀。3苯酚具有腐蝕性，能造成皮膚的嚴(yán)重?zé)齻耙挛?/p>

11、損壞，使用時(shí)應(yīng)注意。如不小心皮膚上碰到苯酚則應(yīng)用堿性溶液、肥皂及大量的清水沖洗。4苯酚可以用于抽提純化DNA，由于苯酚的氧化產(chǎn)物可以使核酸鏈發(fā)生斷裂。所使用的苯酚在使用前必須經(jīng)過重蒸，且都必須用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)進(jìn)行平衡。所以取酚/氯仿/異戊醇時(shí)應(yīng)取下層溶液，因?yàn)樯蠈邮荰ris-HCl液隔絕空氣層。5酚/氯仿/異戊醇抽提時(shí)，應(yīng)充分混勻。經(jīng)酚/氯仿/異戊醇抽提后，吸取上清液時(shí)注意不要把中間的白色層吸入，其中含有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。6實(shí)驗(yàn)中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且與之接觸的吸頭、Ep管，全部棄用，不回收。7有些質(zhì)粒本身可能在某些菌種中穩(wěn)定存在，但經(jīng)過多次移接

12、有可能造成質(zhì)粒丟失。因此不要頻繁轉(zhuǎn)接，每次接種時(shí)應(yīng)挑單菌落。六、 思考題1裂解細(xì)菌時(shí)需注意的事項(xiàng)有哪些？2質(zhì)粒的基本性質(zhì)有哪些？3堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中各溶液的作用是什么？4抽提質(zhì)粒DNA的方法包括哪幾個(gè)步驟？5如何提高質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量？6為什么質(zhì)粒DNA不能反復(fù)在4、-20、室溫中放置？為達(dá)到這一目的，需要注意些什么？實(shí)驗(yàn)二 DNA含量、純度與分子量的電泳法測定一、 實(shí)驗(yàn)原理測定核酸通常采用兩種方法：即紫外分光光度法與瓊脂糖凝膠電泳法。1紫外分光光度法DNA或RNA定量時(shí)，應(yīng)在260nm和280nm兩個(gè)波長下讀數(shù)。根據(jù)計(jì)算在260nm波長下，每1ug/mL DNA鈉鹽的A值為0.20，即在

13、A260=1時(shí)，雙鏈DNA含量為50ug/mL，單鏈DNA與RNA含量為40ug/mL，單鏈寡核苷酸的含量為33 ug/mL。雙鏈DNA含量A260×50×稀釋倍數(shù)（ug/mL）RNA含量A260×40×稀釋倍數(shù)（ug/mL）單鏈DNA含量A260×33×稀釋倍數(shù)（ug/mL）此外還可以根據(jù)260nm和280nm的讀數(shù)間的比值（A260/A280）估計(jì)核酸的純度。2瓊脂糖凝膠電泳法根據(jù)DNA分子量不同，采用外加電場使其分開，用EB嵌入DNA分子后在紫外下顯熒光。而熒光強(qiáng)度正比于DNA的含量，如將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品表21作為電泳對照，就

14、可以估計(jì)出待測樣品的濃度。電泳后的瓊脂凝膠糖直接在紫外燈下拍照，只需要510ngDNA，就可以從照片上比較鑒別。由于電泳時(shí)所用的樣品量非常少，只要將濃度控制在幾十納克即可，所以在基因工程中經(jīng)常被用做檢測DNA樣品。表21 DNA/ Hind 中DNA片斷片段堿基對數(shù)目/kb相對分子質(zhì)量DNA含量/ %DNA含量/(ng/mg)123.13015.0×10647.7476.929.4196.12×10619.4194.136.5574.26×10613.5135.244.3712.84×106989.952.3221.51×1064.847.96

15、2.0281.32×1064.241.870.5640.37×1061.111.680.1250.08×1060.32.6二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1從以上實(shí)驗(yàn)中提取到的質(zhì)粒DNA，為了能作下一步的酶切，連接及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，必須測定DNA的純度、含量以及分子量大小。2本實(shí)驗(yàn)旨在學(xué)習(xí)水平式瓊脂糖凝膠電泳，學(xué)習(xí)檢測DNA、含量與相對分子質(zhì)量大小。三、 實(shí)驗(yàn)材料和試劑材料：自制的質(zhì)粒DNA、DNA/ Hind 、。試劑：1標(biāo)準(zhǔn)DNAmarker(DNA/ Hind )2限制性內(nèi)切酶EcoR或Hind和10X緩沖液3酶反應(yīng)中止液：0.2 5溴酚藍(lán)(含40蔗糖)，已配好。4溴化乙錠染液（

16、EB）：使用前稀釋1000倍，母液已配好。注意：EB是一種誘變劑，配制和使用時(shí)應(yīng)戴好手套，并且不能將該染液灑在桌面或地面上！使用后立即用大量的水沖洗干凈。50.5×TBE緩沖液：Tris 2.18g、硼酸1.10g、EDTA-Na20.14g用蒸餾水定容至400mL?？膳涑?×TBE母液，使用時(shí)稀釋10倍即可。60.7瓊脂糖儀器：37水浴鍋、微波爐、穩(wěn)壓電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、電泳槽、Eppendorf架、恒溫?fù)u床、臺(tái)式小型振蕩器、Ep管(1.5mL)、加樣器(20uLlmL)、吸頭。四、 實(shí)驗(yàn)操作（一）質(zhì)粒DNA的酶解1新提的質(zhì)粒，在10uL的體系中用單一酶（如EcoR）進(jìn)

17、行處理，即：質(zhì)粒DNA 5L10×緩沖液 1LEcoR 0.5LddH2O 4L237，保溫30min。3加入1/10體積的酶反應(yīng)終止液，混勻以停止酶解反應(yīng)。各酶解樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆?。（二）瓊脂糖凝膠板的制備1瓊脂糖凝膠的制備稱取1.0g瓊脂糖，置于錐形瓶中，加入100mL TBE緩沖液，瓶口倒扣一小燒杯，于電爐上加熱，注意：防止溢出，由于瓊脂糖較難溶解，如果水分損失較大，則補(bǔ)充一定量的蒸餾水，使其終濃度為1。2膠板的制備將有機(jī)玻璃內(nèi)槽洗凈、晾干。取膠帶紙將有機(jī)玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好，形成一個(gè)邊腳模子。注意：將橡皮膏緊貼在有機(jī)玻璃內(nèi)槽兩端邊上，不能留空隙。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于水平位置

18、，放好樣品槽模板(一般稱之為梳子)，將冷卻至65左右的瓊脂糖凝膠，小心地倒在內(nèi)槽上，控制灌膠速度，使膠液緩慢地展開，直到整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1h左右，待凝固完全后，輕輕拔出樣品槽模板，撕去膠帶紙，膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放入電泳槽中，加入0.5×TBE電泳緩沖液，以蓋過膠板為宜。膠板內(nèi)的樣品小槽3加樣用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每次加完一個(gè)樣品為了避免交叉污染，各樣品用不同的吸頭，以免造成限制酶被污染。加樣時(shí)，吸頭不要插入膠板內(nèi)，防止碰壞樣品槽周圍的凝膠面，每個(gè)樣品槽的加樣量不宜過多，本實(shí)驗(yàn)加樣為10uL左右。(每塊膠板

19、需點(diǎn)一個(gè)Marker，這里即為DNA/ Hind )4電泳加完樣品后應(yīng)立即通電，進(jìn)行恒壓電泳。在低壓條件下，線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關(guān)系，為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率，電場強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm。當(dāng)溴酚藍(lán)染料（藍(lán)色）移動(dòng)到距離膠板下沿約12cm處，停止電泳。5染色將電泳后的凝膠浸入EB染液中，進(jìn)行染色以觀察在瓊脂糖凝膠中的DNA帶。染色20min后，用大量水沖洗。6觀察在波長為254nm的紫外燈下，觀察染色后的電泳凝膠。DNA存在處顯示出紅色熒光條帶。用凝膠自動(dòng)成像儀處理代替。五、 注意事項(xiàng)1基因工程是微量操作技術(shù)，DNA樣品與限制性內(nèi)切酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量

20、的正確性，確認(rèn)樣品確實(shí)被加入反應(yīng)體系。2酶應(yīng)在20冰箱中保存，取酶的操作必須嚴(yán)格在冰浴條件下進(jìn)行，用完后立即放回20冰箱，不要將酶在冰浴中放置過久，或放在高于0以上的環(huán)境中，以防止酶失活。3酶切加樣次序?yàn)樗⒕彌_液和DNA，然后混勻。酶永遠(yuǎn)是最后加入的，如將酶直接加入濃縮的緩沖液中會(huì)引起嚴(yán)重的失水。酶切反應(yīng)體系的溶液加完后，用手指輕彈管壁使溶液混勻，也可用微量離心機(jī)甩一下，使溶液集中在管底，不要用振蕩器。此步操作是整個(gè)實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵，注意防止錯(cuò)加、漏加。4為了避免交叉污染，各樣品用不同的吸頭，且每次取酶時(shí)務(wù)必?fù)Q吸頭，以免造成限制酶被污染。5溴化乙錠是一種強(qiáng)烈的誘變劑，有毒性，使用含有這種染料的

21、溶液時(shí)，應(yīng)戴手套進(jìn)行操作。勿將溶液滴灑在臺(tái)面或地面上，用后用水徹底沖洗干凈。六、 思考題1簡述EB顯色的原理。2使用溴化乙錠時(shí)應(yīng)注意什么？3說明不同電壓對電泳結(jié)果的影響是什么4如何判斷DNA的純度？實(shí)驗(yàn)三 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、 實(shí)驗(yàn)原理 感受態(tài)就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)，只有發(fā)展為感受態(tài)的細(xì)胞才能穩(wěn)定攝取外來的DNA分子。轉(zhuǎn)化是將外源DNA分子引入受體細(xì)胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段。轉(zhuǎn)化的基本原理是細(xì)胞處于0，CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基鈣磷酸混合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在選擇性培養(yǎng)

22、基平板上培養(yǎng)，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。二、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)和理解影響細(xì)胞感受態(tài)的因素，掌握感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。2掌握質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法。把體外DNA引入受體細(xì)胞，使受體菌具有新遺傳性，并從中選擇出轉(zhuǎn)化子。三、 實(shí)驗(yàn)材料和用具材料：自制的質(zhì)粒DNA、大腸桿菌(E.coli)菌種(DH5菌株)。試劑：LB瓊脂平板 (無抗生素)、LB瓊脂平板 (含50g/L氨芐青霉素)、LB液體培養(yǎng)基5mL(無抗生素)、LB液體培養(yǎng)基100mL(無抗生素)、LB液體培養(yǎng)基5mL(含50g/L氨芐青霉素)、0.1mol/LCaCl2溶液(滅菌備用)。儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、接種環(huán)、涂布器、冷凍離心機(jī)、離心管、超凈工作臺(tái)

23、、高壓蒸汽滅菌鍋。四、 操作步驟(一)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1從新活化的E.coliDH5菌平板上挑取一單菌落，接種于5mL液體培養(yǎng)基中，37振蕩培養(yǎng)過夜，直至對數(shù)生長期。將該菌懸液以1：50接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37快速振蕩培養(yǎng)34h。2取5mL培養(yǎng)液放入離心管中，在冰上放置10min，于45000rpm離心10min。3可用加樣器將殘余液體盡量去凈，用1mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置1530min。4于4，5000rpm離心10min。5棄上清，加入200L預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液

24、。6制好的感受態(tài)細(xì)胞可在冰上放置，24h內(nèi)直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，也可加入占總體積95左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于Ep管中，-70條件下可保存半年至一年。(二)細(xì)胞轉(zhuǎn)化取200L搖勻后的感受態(tài)細(xì)胞懸液，進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化如下（單位：L）：編號(hào)質(zhì)粒感受態(tài)細(xì)胞無菌水0.1mol/LCaCl2樣品2100/對照1/1002/對照22/100樣品組即為我們的轉(zhuǎn)化組：100L感受態(tài)細(xì)胞2L質(zhì)粒DNA對照1為受體菌對照組：100L感受態(tài)細(xì)胞2L無菌水對照2為質(zhì)粒DNA對照組：100L0.1mol/LCaCl22L質(zhì)粒DNA將以上各樣品輕輕搖勻，冰上放置30min后，于42水浴中保溫90s，然后迅速在冰

25、上冷卻35min。上述各管中分別加入400L LB液體培養(yǎng)基，使總體積為500L，該溶液稱為轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液，搖勻后于37振蕩培養(yǎng)30min，使受體細(xì)胞恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生抗藥性。(三)平板培養(yǎng)取各樣品培養(yǎng)液100L分別接種于含氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)基上（分別記為Amp和Amp），涂勻。37培養(yǎng)24h，待菌落生長良好且未相互重疊時(shí)停止培養(yǎng)。(四)檢出轉(zhuǎn)化體不含抗生素培養(yǎng)基含抗生素培養(yǎng)基結(jié)果分析受體菌對照組有大量菌落長出無菌落長出本實(shí)驗(yàn)未產(chǎn)生抗藥性菌株質(zhì)粒對照組無菌落長出無菌落長出質(zhì)粒DNA不含雜菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)組有大量菌落長出有菌落長出質(zhì)粒進(jìn)入受體菌中產(chǎn)生抗藥性五、 注意事項(xiàng)1這一個(gè)實(shí)驗(yàn)中的所有操作均要為無菌操作，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。2細(xì)胞轉(zhuǎn)化中，42水浴90s要準(zhǔn)確操作。3制備感受態(tài)細(xì)胞過程中，需要在冰上放置的一定不要在室溫中放置。六、 思考題1感受態(tài)細(xì)胞制備好后，為什么在轉(zhuǎn)化前還要在冰上放置？2思考轉(zhuǎn)化后平板培養(yǎng)應(yīng)有的結(jié)果、分析自己培養(yǎng)的情況。附錄：1. pH8.0 G.E.T.緩沖液 (滅菌后