針對(duì)Bt轉(zhuǎn)基因大米結(jié)構(gòu)特異基因的實(shí)時(shí)熒光(Real-time)PCR檢測方法的研究

1、附件二：參考譯文：針對(duì)Bt轉(zhuǎn)基因大米結(jié)構(gòu)特異基因的實(shí)時(shí)熒光（Realtime）PCR檢測方法的研究Dietrich Made， Christine Degner， Lutz Grohmann摘要：中國的轉(zhuǎn)基因大米品系已接近獲得農(nóng)業(yè)種植與生產(chǎn)的批準(zhǔn)。但是，迄今還沒有檢測此轉(zhuǎn)基因作物的方法進(jìn)行報(bào)道。在本研究中，以田間測試為Bt大米（“Anti-pest Shanyou 63<抗蟲秈優(yōu)63>”和“Anti-pest Jinyou 63<抗蟲粳優(yōu)63>”）做為研究對(duì)象，對(duì)其轉(zhuǎn)基因DNA序列進(jìn)行研究。Real-time PCR檢測方法針對(duì)的區(qū)域?yàn)樘K云金芽孢桿菌殺蟲毒蛋白基因cry

2、IA（b）及cryIA(c)融合基因和農(nóng)桿菌的胭脂堿合成酶基因（nos）終止子之間的序列。此Bt大米特異檢測體系吸納了最近發(fā)表論文中Real-time檢測大米（Oryza sativa L）內(nèi)源基因gos9的內(nèi)容。檢測轉(zhuǎn)基因Bt大米的整個(gè)方法進(jìn)行了內(nèi)部驗(yàn)證，確定檢測限值為0.1（Bt大米 / 大米整體）。應(yīng)用PCR方法可更精確地檢測歐盟尚未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因大米。關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)基因生物，大米（Oryza sativa L），Bt毒蛋白，內(nèi)源基因，Real-time PCR, 檢測方法簡介在歐盟，轉(zhuǎn)基因（GM）食品的批準(zhǔn)與使用應(yīng)遵照法令(EC) No 1829/2003和(EC) No 1830/200

3、3的規(guī)定1,2。由于全球的轉(zhuǎn)基因作物的種植不斷增長，歐盟各成員國必須依據(jù)這些規(guī)定進(jìn)行全國食品監(jiān)督，以防止含有或來源于未經(jīng)歐盟批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因生物的食品與飼料進(jìn)入歐盟市場。亞洲的植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)是新的轉(zhuǎn)基因作物品性的主要集中地，許多已接近獲得批準(zhǔn)和可能很快就投放市場3。在中國，水稻的種植面積超過20，并通過大量使用除草劑和殺蟲劑達(dá)到了較高的產(chǎn)量。能抵抗害蟲或除草劑的轉(zhuǎn)基因大米可以減少此類化學(xué)品的用量3,4。幾個(gè)不同的轉(zhuǎn)基因水稻品系已在公眾的GMO資料庫有所描述5,6。至少四個(gè)已經(jīng)通過了田間試驗(yàn)、環(huán)境釋放試驗(yàn)，目前正處在預(yù)生產(chǎn)階段。一種含有Xa21基因可以抵抗白葉枯病的轉(zhuǎn)基因水稻在2001年就進(jìn)入了預(yù)生

4、產(chǎn)階段，但中國農(nóng)業(yè)部沒有最終批準(zhǔn)，原因是需要更多的生物安全資料。另一種轉(zhuǎn)基因水稻被轉(zhuǎn)入了豇豆胰蛋白酶抑制（CpTI）基因以獲得抗蟲特性，在1999年被批準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放試驗(yàn)，之后被引入雜交水稻GM II-Youming 86，2001年開始進(jìn)入預(yù)生產(chǎn)階段。已經(jīng)被研究并批準(zhǔn)進(jìn)行環(huán)境釋放的表達(dá)Bt毒蛋白的轉(zhuǎn)基因水稻至少優(yōu)兩個(gè)Bt水稻品系,“GM Shanyou 63”和“Kemingdao”在2001年進(jìn)入預(yù)生產(chǎn)階段。去年，國際環(huán)保組織綠色和平（Greenpeace）對(duì)中國市場上的GM水稻品系進(jìn)行了調(diào)查。從中國湖北省的當(dāng)?shù)胤N子公司、農(nóng)業(yè)推廣站和農(nóng)場購買了一些大米樣品。由一家商業(yè)的GMO檢測實(shí)驗(yàn)室對(duì)所

5、采集的樣品進(jìn)行了DNA與蛋白方面的檢測。25個(gè)樣品中的19個(gè)顯示存在轉(zhuǎn)基因大米。幾個(gè)樣品的DNA掃描檢測為陽性，同時(shí)CryIA(c)蛋白檢測也為陽性，提示這些大米品系表達(dá)Bt蛋白。檢測GMOs的分析方法和在食品或飼料中含量的方法主要是基于DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）。由于Real-time PCR具有的高特異性、使用方便的特點(diǎn)，都能應(yīng)用于GMO定性與定量檢驗(yàn)。大多數(shù)Real-time PCR進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)都是采用水解熒光探針（TaqMan）。為了滿足GMO含量檢測的需要，歐盟對(duì)于單倍體基因組拷貝也采用此類方法。為了建立轉(zhuǎn)基因作物的檢測方法，必須要得到陽性檢驗(yàn)材料。但是對(duì)于在歐盟沒有進(jìn)行研究和種

6、植的或者沒有得到歐盟批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因品系，是非常難于獲得可信的陽性材料。為了建立針對(duì)在中國已接近商業(yè)化種植而歐盟還未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因大米的檢測方法，我們使用了綠色和平（Greenpeace）進(jìn)行調(diào)查時(shí)的兩個(gè)大米樣品做為參考材料。在推測參考材料含有GM Shanyou 63大米的基礎(chǔ)上，建立了Real-time PCR方法檢測部分結(jié)構(gòu)特異性基因。本研究所建立的Bt大米品系檢測方法也可以應(yīng)用于進(jìn)口食品中該成分的定量檢測。材料和方法樣品材料與DNA的提取兩個(gè)轉(zhuǎn)基因大米樣品（FR0502519，F(xiàn)R0502520）是由綠色和平友情提供，此樣品為2005年春季在中國湖北省松滋（Songzi）縣王家橋（Wangj

7、iaqiao）鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)推廣站的水稻種子包裝中采集。樣品標(biāo)記為“Anti-pest Shanyou 63（抗蟲秈優(yōu)63）”和“Anti-pest Jinyou 63（抗蟲粳優(yōu)63）”。使用改良的CTAB核酸提取方法從粉碎材料中提取DNA。200mg粉碎過的大米樣品中加入1.5ml CTAB 提取緩沖液（20g/L CTAB,1.4mol/L NaCL,0.1mol/L Tris-HCL,0.02mol/L Na2EDTA, pH8.0）和10µL蛋白酶K溶液（20mg/mL)，60振蕩過夜后13000×g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。加入750µL氯仿后用

8、力振蕩，13000×g離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入2倍體積的CTAB沉淀溶液（5g/L CTAB, 40mmol/L NaCl），室溫靜置60min，13000×g離心15min，棄去上清，加入350µL NaCl溶液（350mmol/L）將沉淀進(jìn)行懸浮，再加入350µL 氯仿，渦旋振蕩進(jìn)行混勻，13000×g離心10min，轉(zhuǎn)移上清后加入0.6倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20min，13000×g離心10min，棄去上清，加入500µL 70乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200µL TE溶液中（

9、1mmol/L Tris-HCL, 0.1mmol/L，Na2EDTA, pH8.0）。按照PicoGreen dsDNA結(jié)合染料（Invitrogen）的使用說明，使用fluorrometric方法對(duì)提取的DNA進(jìn)行定量。使用ABI PRISM 7900以525nm 波長進(jìn)行測定。使用含量為0.1µg /µL DNA的100bp DNA 標(biāo)記（Fermentas）進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)于特異性試驗(yàn)，在德國市場上購買兩個(gè)傳統(tǒng)品牌的普通大米（Wurzener Parboiled，批號(hào)L 60531E, Wurzen，德國；Gut Gunstig SpitzenLangkornReis，

10、批號(hào)07/02/2008, Hamburg，德國），轉(zhuǎn)基因大米品系LL RICE62，轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2, 轉(zhuǎn)基因玉米品系T25、Bt11、Bt10、Bt176、MON810、MON863、NK603、TC1507、GA21與CBH351。分別提取DNA用于試驗(yàn)。對(duì)于敏感性試驗(yàn)，用0.1×TE溶液對(duì)樣品FR0502519和FR0502520所提取的DNA進(jìn)行四倍梯度的系列稀釋。另一種系列稀釋液是使用FR0502519的提取DNA和傳統(tǒng)大米DNA（Wurzener Parboiled, 10µg/mL）與玉米DNA(10µg/mL)的混合液。不同GMO

11、成分的質(zhì)量比率混合物是使用粉碎的傳統(tǒng)大米和轉(zhuǎn)基因大米樣品FR0502519進(jìn)行制備。9.5g傳統(tǒng)大米與0.5g 大米樣品FR0502519混合后得到5（w/w）混合物來做為起始材料。2 g 的5（w/w）混合物加到8 g 傳統(tǒng)大米中得到1（w/w）混合物。5 g 的1（w/w）混合物加到5 g 傳統(tǒng)大米中得到0.5（w/w）混合物。2 g 的0.5（w/w）混合物加到8 g 傳統(tǒng)大米中得到0.1（w/w）混合物。對(duì)于后續(xù)的定量real-time PCR檢測可以使用5、0.5與0.1混合物所提取的DNA。PCR 和 DNA測序PCR擴(kuò)增體系的體積為25µL，包括2.5ul 10xbuf

12、fer（含15mmol/L MgCL2），0.5µmol/L引物，0.625U Taq(HotStar,Qiagen)和1µL 模板DNA（約為25ng）。反應(yīng)程序?yàn)?5預(yù)變性15min，94/30s、60/30s、72/1min進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，最后72延伸7min，用常規(guī)PCR方法和real-time PCR按照描述來檢測CaMV 35S啟動(dòng)子和Nos終止子序列14，18。對(duì)于轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的基因測序，將樣品FR0502519和FR0502520所提取的DNA用于PCR試驗(yàn)，引物為RiceActin 1f（5ccc tct cct ctt tct ttc tcc g3）和NO

13、S180R（5TTg TTT TCT ATC gCg TAT TAA Atg T3）。其它PCR使用的引物為NOS-1（5gAA TCC TgT TgC Cgg TCT Tg3）、NOS-3（5TTA TCC TAg TTT gCg CgC TA3）和CryIA（b）F（5ACC ATC AAC AgC CgC TAC AAC gAC C3）, 反應(yīng)條件參考相關(guān)文獻(xiàn)14,17,18。PCR產(chǎn)物用QIAquick PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，直接使用BigDye Terminator V1.1 測序試劑盒進(jìn)行測序。首先使用Sequence Navigator 軟件對(duì)核酸序列進(jìn)行比較，再用BLAST

14、 2在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索分析19。Real-time PCRReal-time PCR在ABI PRISM 7900儀器進(jìn)行。在96孔板上所有的樣品進(jìn)行雙平行檢測。25µL反應(yīng)液包括12.5µL universal master 反應(yīng)液（ABI）、表1所示濃度的引物與探針、5µL 模板DNA。反應(yīng)條件為95預(yù)變性10min，95/20s、60/1min進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。引物T51F、T51R 與T51P使用Primer Express 2.0 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。大米內(nèi)源基因的引物與探針引用已發(fā)表論文的real-time PCR方法20, 21。結(jié)果與討論

15、轉(zhuǎn)基因大米樣品的序列分析2005年對(duì)Greenpeace從中國當(dāng)?shù)嘏l(fā)商購買的兩個(gè)大米樣品進(jìn)行基因測序。 首先對(duì)FR0502519和FR0502520兩個(gè)樣品進(jìn)行GMO篩選檢測。兩個(gè)樣品的Bt蛋白檢測均為陽性，NOS終止子DNA檢測也都為陽性，只有一個(gè)樣品FR0502520的CaMV35S 啟動(dòng)子的DNA檢測為陽性。用35S啟動(dòng)子的real-time PCR檢測重新進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示FR0502520的DNA的35S檢測結(jié)果非常弱，Ct值約為35，使用相同模板量時(shí)NOS終止子的real-time PCR檢測結(jié)果的Ct值約為24。我們推測在樣品FR0502520可能存在另外的GMO品系，因?yàn)镚M

16、 Shanyou 63品系中不應(yīng)含有CaMV35S 啟動(dòng)子，其親本CMS restorer品系Minghui 63是去除了35S 啟動(dòng)子所調(diào)控hph標(biāo)記基因22。使用幾個(gè)不同的引物組合針對(duì)GM Shanyou 63中含有的預(yù)測轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)，將PCR產(chǎn)物用于直接DNA測序（Fig. 1）。所測的核苷酸序列在NCBI 中用BLAST 進(jìn)行分析比較。轉(zhuǎn)基因序列的兩個(gè)連接區(qū)域與GeneBank中的序列是一致的(Fig. 2和Fig. 3)。為了進(jìn)一步分析大米樣品中的轉(zhuǎn)基因序列，來研究NOS終止子是否位于Bt cryIA(b)和cryIA(c)融合基因的后部，確證是否符合已有研究中對(duì)pFHBT1結(jié)構(gòu)的描述

17、。使用樣品FR0502519與FR0502520的DNA，使用在cryIA(c)基因與NOS終止子上的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(參見Fig.1)。測序結(jié)果顯示兩個(gè)大米調(diào)查樣品的序列沒有差異(見Fig. 3)，序列中含有cryIA(c)基因與NOS終止子基因。Bt大米品系結(jié)構(gòu)特異性的檢測為了檢測中國可能商品化的所有利用質(zhì)粒pFHBT1轉(zhuǎn)化的Bt轉(zhuǎn)基因大米，我們決定建立結(jié)構(gòu)特異性的檢測方法來代替基因特異性的方法。在兩個(gè)大米樣品的基因序列的基礎(chǔ)上，針對(duì)cryIA(c)基因與NOS終止子之間的序列建立了PCR檢測體系（見Fig. 3）。使用從轉(zhuǎn)基因植物參考物質(zhì)（LL RICE62大米、GTS40-3-2大

18、豆、T25、Bt11、Bt10、Bt176、MON810、MON863、NK603、TC1507、GA21與CBH351玉米）和傳統(tǒng)大米中提取的10ng100ng DNA用來檢測PCR體系的特異性，上述的DNA對(duì)于Bt大米PCR檢測體系都為陰性（檢測資料未顯示）。靈敏度與檢測限值Bt大米的real-time PCR方法的檢測限值的測定通過使用DNA的系列稀釋液，直到得到PCR陰性檢測結(jié)果（Table 2）。估計(jì)一個(gè)大米單倍體基因拷貝的分子質(zhì)量約為0.47pg，Bt轉(zhuǎn)基因大米結(jié)構(gòu)特異性檢測體系的檢測限為7個(gè)拷貝。使用各稀釋度的平均Ct值可以建立相應(yīng)的回歸曲線（Fig. 4）。為了建立可以相對(duì)定量的檢測方法，將Bt大米結(jié)構(gòu)特異性PCR檢測體系與特異性分類基因的real-time PCR檢測體系進(jìn)行了結(jié)合。目前已經(jīng)有兩個(gè)分別檢測大米內(nèi)源基因的real-time PCR進(jìn)行了報(bào)道20,21。sps PCR體系的檢測限為10 個(gè)基因拷貝20。gos9 PCR體系的檢測限為3 個(gè)基因拷貝21。我們將兩個(gè)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示gos9 PCR體系比sps PCR體系靈敏度更高，對(duì)于相同量的模板DNA，gos PCR體系擴(kuò)增曲線出現(xiàn)時(shí)要比sps體系提早出現(xiàn)5個(gè)Ct值。因此，本研究采用gos9 PCR體系來檢測大米內(nèi)源性基因，并建立real-time PCR體系對(duì)Bt 大米進(jìn)行檢測。B