食品生物技術(shù)完整版

1、名詞解釋：發(fā)酵工程：在最適發(fā)酵條件下，在發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)。發(fā)酵單位：又稱效價(jià)。是衡量發(fā)酵罐中目的產(chǎn)物的含量高低的指標(biāo)，屬于技術(shù)指標(biāo)一把用u/ml,mg/l。一般情況下用于表示發(fā)酵水平的高低生物轉(zhuǎn)化：指外源化學(xué)物在機(jī)體內(nèi)經(jīng)多種酶催化的代謝轉(zhuǎn)化前體:指在產(chǎn)物合成過(guò)程中，被菌體直接用于產(chǎn)物合成而自身結(jié)構(gòu)無(wú)顯著改變的物質(zhì)。最早是在青霉素生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的 玉米漿（苯乙胺） 蝦青素（甲羥戊酸）消毒：在工業(yè)微生物中消毒指的是除去雜菌，除去會(huì)引起污染的微生物，在工業(yè)上是滅殺引起生產(chǎn)污染的微生物滅菌：指的是殺死一切微生物(包括繁殖體和芽孢），不分病原和非病原微生物，雜菌和非雜菌。指把物體

2、上的所有微生物（包括細(xì)菌芽孢在內(nèi)）全部殺死的方法透氣比/VVM：?jiǎn)挝粫r(shí)間（min）單位體積（m³）培養(yǎng)基中通入標(biāo)準(zhǔn)狀況下空氣的體積在線檢測(cè)：利用傳感器檢測(cè)不離開(kāi)生產(chǎn)線的對(duì)參數(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)離線監(jiān)測(cè)：檢測(cè)樣品離開(kāi)生產(chǎn)線，檢測(cè)后生成不在一起的檢測(cè)溶解氧：指溶解在水中的分子氧，以每升水中所含氧的毫克數(shù)來(lái)表示臨界溶氧濃度：不影響微生物呼吸時(shí)的最低溶氧濃度Monod方程：隨著細(xì)胞的大量繁殖，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗至限制濃度，培養(yǎng)基中有害代謝產(chǎn)物積累增多，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率逐漸下降，進(jìn)入減速期，當(dāng)培養(yǎng)液中不存在抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)時(shí)，細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率和限制性基質(zhì)濃度S的關(guān)系活化：保藏菌種到斜面種子擴(kuò)大培

3、養(yǎng)：斜面種子-三角瓶液體培養(yǎng)-種子罐干熱滅菌：利用高溫對(duì)微生物有氧化、蛋白質(zhì)變性和電解質(zhì)濃縮作用而殺滅微生物，適用于玻璃及金屬用具、沙土管滅菌 140180 12h濕熱滅菌法：借助蒸汽釋放的熱能使微生物蛋白質(zhì)酶核酸分子內(nèi)部的化學(xué)鍵，特別是氫鍵受到破壞，引起不可逆變形，使微生物死亡。在有水分存在情況下，pr更易受熱凝固變性，是用培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備滅菌。121 30min 飽和蒸汽；100度 水煮熱滅菌法：利用空氣壓縮時(shí)放出的熱量進(jìn)行保溫殺菌。從壓縮機(jī)到空氣貯罐一段管道保溫進(jìn)行保溫是空氣達(dá)到高溫后保持一段時(shí)間，保證衛(wèi)生網(wǎng)死亡輻射滅菌：聲能，高能陰極射線、X射線、Y射線和紫外線都能破壞蛋白質(zhì)活性起到殺

4、菌作用靜電除菌：懸浮于空氣中的微生物，微生物孢子大多有不同的電荷，沒(méi)有帶電荷而微粒在進(jìn)入高壓靜電場(chǎng)是都會(huì)被電橋變成帶電微粒過(guò)濾除菌：微粒隨電流通過(guò)濾層是，濾層纖維所形成的網(wǎng)格阻礙氣流直線前進(jìn)，使氣流出現(xiàn)五十次改變運(yùn)動(dòng)速度和運(yùn)動(dòng)方向，繞過(guò)纖維前進(jìn)，這些改變引起微粒對(duì)濾層纖維產(chǎn)生慣性沖擊、阻攔，重力沉降，布朗擴(kuò)散，靜電吸引壁作用而微粒滯留子纖維表面，從而達(dá)到除菌目的。影響氧傳遞的因素：微生物發(fā)酵中，通入發(fā)酵罐內(nèi)的空氣中含有的氧不斷溶于培養(yǎng)液中，以供菌體細(xì)胞代謝之需。這種由氣態(tài)氧轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙鈶B(tài)氧的過(guò)程與液體吸收氣體的過(guò)程相同，所以可用描述氣體溶解于液體的雙膜理論的傳質(zhì)公式表示：N=kLa(C*-CL)

5、 N:O2的傳遞速率 C*：溶液中飽和溶解氧濃度 CL：溶液主流中的溶解氧濃度 kL:以濃度差為推動(dòng)力的氧傳質(zhì)系數(shù) a：比表面積培養(yǎng)基滅菌機(jī)理：致死溫度：殺死微生物的極限溫度（最低或最高溫度）2致死時(shí)間：在致死溫度下，殺死全部微生物所需時(shí)間。反應(yīng)速率常熟K：K與菌種的特性有關(guān)，相同溫度下，微生物越耐熱，K值越?。幌嗤瑴囟认?，微生物越不耐熱，K值越大同樣的溫差，如同樣升高10，活化能越高，則K增加越多，K對(duì)溫度越敏感。活化能為零，則為零級(jí)反應(yīng)。K不隨溫度變化。碳氮比：有機(jī)物中碳的總含量與氮的總含量的比氮源過(guò)多，會(huì)使菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源不足，則菌體繁殖量少，從而影

6、響產(chǎn)量。碳源過(guò)多，則容易形成較低的pH（封壓變大，CO2在水中溶解度變大），不利于菌體的生長(zhǎng)，若碳源不足則會(huì)引起菌體的衰老和自溶。速效碳源：能夠被微生物直接利用的含碳化合物遲效氮源：無(wú)機(jī)氮源或已蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物形式存在的有機(jī)氮源速效氮源：可以直接被菌體吸收利用的氮源內(nèi)源調(diào)節(jié)：由發(fā)酵液中微生物分泌的代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的發(fā)酵液pH的變化外源調(diào)節(jié)：由外源添加的物質(zhì)導(dǎo)致的發(fā)酵液pH的變化如何調(diào)節(jié)：用難溶碳酸鹽調(diào)節(jié)pH滲透壓：在半透膜兩側(cè)由于濃度差而導(dǎo)致的溶劑壓力差。附上圖 恰好能夠阻止水分子通過(guò)半透膜從濃度較低的溶液移向濃度較高的液體的，在較高濃度溶液的液面上施加的額外壓強(qiáng)。濕熱滅菌：微生物細(xì)胞是由蛋白質(zhì)組成

7、，加熱可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而達(dá)到微生物滅菌的目的。微生物對(duì)高溫的敏感性大于對(duì)低溫的敏感性，所以采用高溫滅菌是一種有效的滅菌方法。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)的含水量越大，蛋白質(zhì)凝固越快。優(yōu)點(diǎn)：更低溫度達(dá)到更好的效果。高溫比低溫易死，濕熱比干熱更易死。易錯(cuò)PCR：指在擴(kuò)增目的基因的同時(shí)加入堿基錯(cuò)配，導(dǎo)致目的基因隨機(jī)突變交錯(cuò)延伸：在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，縮短其反應(yīng)時(shí)間，從而只能合成出非常短的新生鏈，經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸。填空：發(fā)酵方法的類別：按微生物生長(zhǎng)特性： 分批發(fā)酵 連續(xù)發(fā)酵按培養(yǎng)基物理

8、性狀： 液體 固體 按對(duì)氧氣需要： 厭氧 有氧發(fā)酵按用途： 斜面培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基 發(fā)酵培養(yǎng)基細(xì)菌：營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 牛肉膏和蛋白胨菌種保藏的意義：菌種會(huì)退化菌種保藏的原理：休眠體菌種保藏的方法：斜面低溫保藏 液體石蠟保藏 液氮冷凍保藏 臨時(shí)保種 低溫缺氧 慢速凍結(jié) 每min 30 霉菌 酵母菌 有芽孢的細(xì)菌易保存Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌Q蒸發(fā)Q輻射微生物細(xì)胞的破碎：機(jī)械破碎法：高壓勻漿法 珠磨法 超聲波碎法 非機(jī)械破碎法：溶酶法 化學(xué)滲透法 除菌方法：輻射殺菌 熱殺菌 靜電除菌 過(guò)濾除菌法（空氣中用得最多）降低發(fā)酵液中的CL：減少通氣量或攪拌轉(zhuǎn)速膜分離的四種方法： 透析、超濾、反滲透、

9、電滲透簡(jiǎn)答：滅菌意義：如有雜菌 6.噬菌體溶菌 5.雜菌降解所要產(chǎn)物 4.雜菌湯所產(chǎn)生的物質(zhì)使提取產(chǎn)物時(shí)發(fā)生困難 3.雜菌污染終產(chǎn)品 2.雜菌生長(zhǎng)速度快1.攪拌槳的作用：1產(chǎn)生軸向和橫向流動(dòng)，促進(jìn)傳質(zhì)和傳熱2打碎氣泡，增加氣液接觸面積，提高溶氧3消除泡沫4速度太快會(huì)導(dǎo)致剪切力增加，也會(huì)導(dǎo)致氣泛提高飽和溶解氧濃度C*的辦法：降溫溶液性質(zhì)：溶質(zhì)含量越高，氧溶解度越小氧分壓：在系統(tǒng)總壓小于0.5MPa時(shí)，氧在aq中溶解度只與氧的分壓成直線關(guān)系，氣相中氧濃度越高，溶液中氧濃度也增加溫?zé)釡缇退沟聹缇壕?、啤酒、乳類、奶油和各種腌制食物的調(diào)制63 30s 7215s間歇滅菌：各種M的營(yíng)養(yǎng)體在100下半小

10、時(shí)即可被殺死，先殺親本，等子代長(zhǎng)大再殺而芽孢和孢子不會(huì)失去活力，當(dāng)它們長(zhǎng)成營(yíng)養(yǎng)體再殺菌，連續(xù)滅菌3次過(guò)濾除菌：用于壓縮空氣，酶溶液以及其他不耐熱的微生物 0.01-0.45mm輻射滅菌（超凈工作臺(tái)）：紫外線、X射線、Y射線 紫外燈剛滅菌有O3（臭味）化學(xué)物質(zhì)滅菌：使用范圍：器皿、雙手，實(shí)驗(yàn)室、無(wú)菌室的環(huán)境滅菌，不能用于培養(yǎng)基滅菌高錳酸鉀：強(qiáng)氧化劑，使Pro氧化 （浸化）漂白粉：強(qiáng)氧化劑，使Pro氧化變性75%酒精：細(xì)胞脫水，Pro凝固 新潔爾滅：陽(yáng)離子表面活性劑，膜損傷和蛋白質(zhì)變性甲醛：強(qiáng)還原劑，與氨基結(jié)合，蛋白質(zhì)變性。利用高錳酸鉀的催化作用，促使甲醛迅速蒸發(fā)放出大量穿透力大，殺菌力弧的甲醛氣

11、體，進(jìn)行空氣消毒發(fā)酵工程的產(chǎn)品：1.以微生物細(xì)胞為產(chǎn)物的發(fā)酵工業(yè) 2.以微生物代謝產(chǎn)物為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè) 3.以微生物酶為產(chǎn)品的發(fā)酵工業(yè) 4.生物轉(zhuǎn)化或修飾化合物的發(fā)酵工業(yè)1、 生物技術(shù)包括哪些主要內(nèi)容？基因工程在生物技術(shù)中作用和地位？ 主要內(nèi)容：基因、細(xì)胞、酶、蛋白質(zhì)、分子進(jìn)化工程 地位：是現(xiàn)代生物技術(shù)中的核心技術(shù) 作用：基因工程的主要原理是應(yīng)用人工方法將生物遺傳物質(zhì)DNA分離出來(lái)，在體外進(jìn)行切割、拼接和重組，然后通過(guò)運(yùn)載工具將重組的基因?qū)肽撤N宿主細(xì)胞或個(gè)體，從而改變宿主的遺傳特性；有時(shí)還使導(dǎo)入新的遺傳信息在宿主細(xì)胞中或個(gè)體中大量表達(dá)，以獲得大量所需的基因表達(dá)產(chǎn)物（各種生理活性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)

12、、酶、多肽、抗生素等等）。這種利用DNA重組技術(shù)來(lái)創(chuàng)造新物種或給予生物以特殊的技術(shù)稱基因工程，由此可見(jiàn)，基因工程為生物技術(shù)中的其他內(nèi)容如細(xì)胞工程、酶工程等提供了基礎(chǔ)，為其它內(nèi)容提供新的，具有特殊功能的細(xì)胞。2、 簡(jiǎn)述生物技術(shù)在食品工業(yè)中的作用 傳統(tǒng)生物技術(shù)：傳統(tǒng)生物技術(shù)從很早起便為人們所開(kāi)發(fā)和利用，并造福人類，如利用傳統(tǒng)生物技術(shù)，人們使面包發(fā)酵，制作酒精飲料，果汁發(fā)酵、制醋和釀酒等。豐富了食物的風(fēng)味和種類 現(xiàn)代生物技術(shù)：現(xiàn)代生物技術(shù)以基因工程為核心，帶動(dòng)了現(xiàn)代發(fā)酵工程、現(xiàn)代酶工程、現(xiàn)代細(xì)胞工程、蛋白質(zhì)工程以及分子進(jìn)化工程的發(fā)展，它的出現(xiàn)，為改造傳統(tǒng)的食品生產(chǎn)、進(jìn)行食品深度加工，開(kāi)發(fā)新產(chǎn)品，提高

13、食品質(zhì)量和減少營(yíng)養(yǎng)損失增添了新的活力如其中的基因工程和細(xì)胞工程可改善食品原料農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)和提高產(chǎn)量；通過(guò)基因工程、發(fā)酵工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程和分子進(jìn)化工程食品加工工藝高效化，提高食品附加值，提高農(nóng)產(chǎn)品利用率，以及提高食品保健功能；利用生物技術(shù)減少食品損失，保證食品的安全性和質(zhì)量。1、 何為限制性內(nèi)切酶？II型限制性內(nèi)切酶的基本特征有哪些？限制性內(nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱限制酶，是指一類能夠識(shí)別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)核苷酸序列的內(nèi)切核酸酶基本特征： 識(shí)別序列和切割位點(diǎn)：大多數(shù)II型限制性內(nèi)切核酸酶可識(shí)別長(zhǎng)度為4-7bp的雙鏈DNA特定序列，該識(shí)別序列（識(shí)別位點(diǎn)）常呈旋轉(zhuǎn)對(duì)稱性 切割方式：根據(jù)雙鏈DNA被

14、切割所稱的末端，可分為平齊末端，黏性末端和單鏈黏性末端 同裂酶和同尾酶：由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此連接起來(lái)，但是由此連接形成的重組DNA分子往往不能被原來(lái)同尾酶中的任何一種重新切開(kāi)，即原來(lái)同尾酶的識(shí)別序列都已不再存在。 限制性片段長(zhǎng)度與切割頻率：不同限制酶切割后所產(chǎn)生的DNA后所形成的限制性片段長(zhǎng)度不一2、 DNA聚合酶在分子生物學(xué)基因工程中有哪些用途？DNA聚合酶催化DNA體外合成反應(yīng)。不同DNA聚合酶具有不同用途： 大腸桿菌DNA聚合酶I：a以切刻平板法標(biāo)記DNA；b對(duì)DNA分子的3突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記 大腸桿菌DNA聚合酶I大片段：a補(bǔ)平限制酶切割雙鏈DNA所產(chǎn)生的3凹端；

15、b如果以標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平雙鏈DNA的3凹端，那么可對(duì)DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記；c對(duì)DNA分子的3突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記；d在cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈；e應(yīng)用Sanger雙脫氧末端終止法進(jìn)行DNA測(cè)序 T4噬菌體DNA聚合酶：a補(bǔ)平限制酶雙鏈DNA產(chǎn)生的3凹端；b如果以標(biāo)記的dNTP補(bǔ)平雙鏈DNA的3凹端，那么可對(duì)DNA分子進(jìn)行末端標(biāo)記；c對(duì)DNA分子的3突出尾進(jìn)行末端標(biāo)記，并且該酶為利用此法進(jìn)行此類末端標(biāo)記的首選酶；d將雙鏈DNA的突出端轉(zhuǎn)化成平齊端 TaqDNA聚合酶：a對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序b通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增 逆轉(zhuǎn)錄酶：a將mRNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA；b

16、標(biāo)記帶5突出端的DNA片段（補(bǔ)平反應(yīng)）；c當(dāng)大腸桿菌DNA聚合酶I的KIenow片段或測(cè)序酶等使用結(jié)果不理想時(shí)，它可用于雙脫氧鏈終止法測(cè)定DNA序列 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：a給載體DNA或cDNA加上互補(bǔ)的同聚尾；b以32P標(biāo)記的一種dNTP、一種ddNTP或一種rNTP來(lái)標(biāo)記DNA片段的3端3、 理想的質(zhì)粒基因工程載體的應(yīng)具備哪些條件？ 分子結(jié)構(gòu)中具有多個(gè)單一限制酶切位點(diǎn)，具有易被檢測(cè)的選擇標(biāo)記基因，且切點(diǎn)位于選擇標(biāo)記基因上； 能插入、運(yùn)載一定大小的外源基因； 在攜帶外源基因前后在宿主細(xì)胞內(nèi)均能自主復(fù)制 在與外源基因構(gòu)建重組質(zhì)粒后具有轉(zhuǎn)化功能； 分子量小，易于操作，一般為松弛型復(fù)制控制 容易

17、控制，安全可靠4、 Ti一元載體和雙元載體體統(tǒng)比較有哪些優(yōu)缺點(diǎn)？ 微型Ti質(zhì)粒具有大腸桿菌質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，能在大腸桿菌宿主中復(fù)制，使其質(zhì)?？截悢?shù)增加10-100倍 微型Ti質(zhì)粒分子量?。?0kb），可以直接對(duì)其進(jìn)行體外遺傳操作，而且將其導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌也比較容易 一元載體系統(tǒng)的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)兩個(gè)質(zhì)粒的接合頻率較高，一般后者比前者至少高4倍 一元載體系統(tǒng)構(gòu)建成功后工程菌的穩(wěn)定性較好，而雙元載體系統(tǒng)相應(yīng)穩(wěn)定性較差，易丟失 雙元載體系統(tǒng)不需要經(jīng)過(guò)共整合過(guò)程。因?yàn)?，雙元載體系統(tǒng)中的兩個(gè)質(zhì)粒不必含有同源序列，而且構(gòu)建操作步驟比較簡(jiǎn)單。 雙元載體系統(tǒng)在外源基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞前，無(wú)須進(jìn)行同源重組。

18、因此插入雙元載體系統(tǒng)外源基因的可能變異比插入一元載體系統(tǒng)外源基因的可能變異小 雙元載體系統(tǒng)比一元載體系統(tǒng)對(duì)植物的轉(zhuǎn)化效率高5、 標(biāo)記基因應(yīng)具備哪些條件？舉例說(shuō)明植物載體中常用的選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因標(biāo)記基因一般需要具備以下幾個(gè)條件： 編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶 基因較小，可以構(gòu)成嵌合基因 能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá) 檢測(cè)容易，并能定量分析植物載體中常用的選擇標(biāo)記基因： Npt-II（新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）基因：目前在植物基因工程中應(yīng)用最廣泛的選擇標(biāo)記基因原理：其表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)酶促磷酸化作用使氨基葡萄糖苷類抗生素失活，從而解除其毒性，它對(duì)茄科植物的轉(zhuǎn)化選擇特別有效，但是，其對(duì)豆科植物和單子葉

19、植物的轉(zhuǎn)化選擇效果不好 HPT（潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶）基因：原理：其表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)酶促磷酸化作用使潮霉素失活，從而解除其毒性植物載體中常用的篩選標(biāo)記基因： Gus（葡萄醛酸糖苷酶）基因：來(lái)自于大腸桿菌染色體其在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的葡糖醛酸糖苷酶在檢測(cè)上具有以下特點(diǎn)：A 在一定條件下水解特定底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-葡糖醛酸酯生成藍(lán)色物質(zhì)，呈現(xiàn)藍(lán)色沉淀。因此，既可用分光光度計(jì)測(cè)定，又可通過(guò)組織化學(xué)方法直接觀察植物組織中的藍(lán)色沉淀斑點(diǎn)B 在一定條件下，水解特定底物4-甲基傘形酮酰-葡糖醛酸苷生成4-甲基傘形酮，產(chǎn)生熒光，因此，可用熒光光譜法測(cè)定，該法非常靈敏。C 檢測(cè)簡(jiǎn)便、迅速且能定量D Gus檢

20、測(cè)比Ntp-II檢測(cè)便宜，且不需要使用放射性同位素 Cat（氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶）基因：該基因來(lái)自于細(xì)菌轉(zhuǎn)座子Tn9其在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶在檢測(cè)上具有以下特點(diǎn)：A 可用硅膠G薄層層析法等測(cè)定所生成的乙?；a(chǎn)物以確定該酶的活性，但操作繁瑣B 一般Cat基因表達(dá)產(chǎn)物不夠穩(wěn)定C 測(cè)定花費(fèi)大6、 酶促標(biāo)記探針的方法有哪些？用到了哪些工具酶？ 切刻平移法：DNA酶I DNA聚合酶I 隨機(jī)引物法：DNA聚合酶I 末端標(biāo)記法：DNA聚合酶I，T4DNA聚合酶，T4多核苷酸激酶，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶7、 Southern blotting的實(shí)驗(yàn)流程及注意要點(diǎn)實(shí)驗(yàn)流程：用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶對(duì)待測(cè)

21、DNA進(jìn)行酶切經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離將含有DNA片段的瓊脂糖凝膠進(jìn)行堿變性處理將其中的單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其它固相支持物上（各DNA片段的相對(duì)位置保持不變）放射自顯影或免疫酶法顯色顯示雜交結(jié)果注意要點(diǎn)： 所取待測(cè)DNA樣品的量因樣品種類及研究目的而異，對(duì)于克隆片段的限制性內(nèi)切酶圖譜分析，取0.1-0.5g；對(duì)于鑒定基因組DNA中的單拷貝基因序列，取10-20g；對(duì)于采用寡核苷酸探針或當(dāng)探針的比放射性活性較低時(shí)，取30-50g 選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶酶切待測(cè)DNA樣品的目的在于獲得合適長(zhǎng)度的DNA片段，一般而言，較理想的片段長(zhǎng)度為0.5-10kb 電

22、泳結(jié)束后，需要在紫外線下仔細(xì)觀察檢查DNA樣品有無(wú)降解，酶切是否完全，電泳分離效果是否理想，DNA電泳帶型是否清晰，有無(wú)拖尾現(xiàn)象。 一般采用0.45m孔徑的硝酸纖維素濾膜，但當(dāng)DNA片段小于300bp時(shí)，可選用0.22m孔徑的硝酸纖維素濾膜或采用尼龍膜8、 PCR反應(yīng)體系有哪些成分？PCR的基本流程反應(yīng)體系： KCl 50mmol/L Tris-Cl 10mmol/L（在室溫時(shí)pH8.4） MgCl2 1.5mmol/L 明膠或牛血清蛋白 100g/L 2個(gè)引物 各0.25mol/L 4種底物（dATP、dCTP、dGTP、dTTP） 各200mol/L 模板DNA 0.1g TaqDNA聚合

23、酶 2.5IUPCR的基本流程： 變性，通過(guò)加熱至一定溫度使雙鏈DNA兩鏈之間的氫鍵斷裂，DNA雙鏈離解形成兩條DNA單鏈 復(fù)性，當(dāng)反應(yīng)體系溫度突然降低時(shí)，由于模板DNA分子的結(jié)構(gòu)比引物DNA分子復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物的量大大多于模板，因此引物和與其互補(bǔ)的模板配對(duì)形成局部雜交雙鏈，而變形后離解形成的兩條模板DNA單鏈之間互補(bǔ)配對(duì)的機(jī)會(huì)則較少 延伸：在4種脫氧核糖核苷三磷酸底物、Mg2+等存在的條件下，TaqDNA聚合酶以模板-引物雜交體分別為模板和引物催化DNA鏈沿5-3方向合成延伸，每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增產(chǎn)物作為下循環(huán)的模板9、 PCR引物設(shè)計(jì)的一般原則（1） 長(zhǎng)度可為15-30nt，常為20

24、-27nt（2） G+C含量一般可謂40%-60%，常為45%-55%（3） 組成堿基盡可能隨機(jī)分布，不能存在聚嘌呤或者聚嘧啶。尤其3端不能以3個(gè)連續(xù)G或者3個(gè)連續(xù)結(jié)束。否則，會(huì)使引物在模板G+C富集區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。（4） 引物自身不能存在互補(bǔ)序列，連續(xù)互補(bǔ)堿基不能超過(guò)3個(gè)。否則，引物自身會(huì)折疊形成發(fā)獎(jiǎng)狀等二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)的空間位阻作用更影響引物與末班的復(fù)性結(jié)合。（5） 兩個(gè)引物之間不能有互補(bǔ)性，尤其3端不能存在互補(bǔ)性。否則，會(huì)形成引物二聚體。兩個(gè)引物之間不能超過(guò)4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或者互補(bǔ)性。（6） 引物3端原則上須與模板DNA配對(duì)。當(dāng)引物3端末位堿基為A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能較好引

25、發(fā)鏈的延伸。而當(dāng)引物3端末位堿基為T(mén)時(shí)，如果為錯(cuò)配之堿基，其引發(fā)鏈延伸的效率就大大降低。當(dāng)引物3端末位堿基為G或C時(shí)，如果錯(cuò)配之堿基，其引發(fā)鏈延伸的效率就介于上述兩者之間。因此，引物3端的末位堿基最好選T、C或G，不選A。（7） 由于引物5端只限定PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，而不影響擴(kuò)增的特異性，因此引物5端可被修飾。修飾包括：附加酶切位點(diǎn)、引入蛋白質(zhì)結(jié)合序列、突變位點(diǎn)、啟動(dòng)子、生物素等。總之，引物5端堿基沒(méi)有嚴(yán)格限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物部分的長(zhǎng)度足夠，其5端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀。（8） 如果需要擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端就不要終止于密碼子的第三位，因?yàn)槊艽a子的第三位易出現(xiàn)簡(jiǎn)并現(xiàn)象，

26、從而影響擴(kuò)增的特異性與效率。（9） 引物的序列與模板的非擴(kuò)增區(qū)序列之間的同源性不要超過(guò)70%或者不要有連續(xù)8個(gè)堿基互補(bǔ)同源。10、 反向PCR，簡(jiǎn)并PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR，巢式PCR（1） 反向PCR：將含已知序列區(qū)段的DNA分子，用在已知序列區(qū)段內(nèi)沒(méi)有切點(diǎn)的合適的限制性內(nèi)切核酸酶媒介，產(chǎn)生大小適于PCR擴(kuò)增的酶切片段。將這些酶切片段的兩端連接起來(lái)形成環(huán)狀分子，用一對(duì)與已知序列區(qū)段兩側(cè)互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR。對(duì)已知序列區(qū)段而言，在引物與模板復(fù)性后，兩引物的3端相背，兩引物的延伸沿環(huán)狀分子的未知序列區(qū)段進(jìn)行。（2） 簡(jiǎn)并PCR：所謂簡(jiǎn)并引物是指堿基序列不同，但有相同堿基數(shù)的一組針對(duì)某一基因相同區(qū)段的

27、寡核苷酸混合物。值得指出的是，由于次黃嘌呤可與任何堿基配對(duì)，因此在堿基高度簡(jiǎn)并位置可以使用次黃嘌呤替代。簡(jiǎn)并引物PCR是指利用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行PCR的方法，該法主要用于僅知蛋白質(zhì)部分序列而求知其編碼基因序列的研究、尋找已知基因家族中新成員的研究等。（3） 逆轉(zhuǎn)錄PCR：以總RNA或mRNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。該法主要用于基因表達(dá)等研究。（4） 巢式PCR：首先以第一對(duì)引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，即擴(kuò)增靶基因中較大區(qū)域片段DNA，然后再以較大區(qū)域內(nèi)的序列設(shè)計(jì)合成第二對(duì)引物。再對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，即擴(kuò)增靶基因中較小區(qū)域片段DNA。該法兩次連續(xù)擴(kuò)增模板靶基因，可進(jìn)一步提高PCR檢測(cè)的靈敏度

28、和特異性。該法特別適于微量模板的擴(kuò)增11、 如果要分離目標(biāo)基因，應(yīng)該至少知道哪些特征？在完全位置基因核苷酸序列的情況下，基因的分離策略大多比較復(fù)雜。一般分離基因的策略多基于基因一下幾個(gè)基本特性中的至少一個(gè)：具有特定的核苷酸序列；存在于基因組中某一特定位置；編碼mRNA；大多具有一定的功能。12、 目標(biāo)基因制備的方法有哪些？（1） 基因化學(xué)合成法：全基因合成；基因的半合成就化學(xué)本質(zhì)而言，基因是一段具有特定生物功能的核苷酸序列。如果知道了基因的分子結(jié)構(gòu)，就可以進(jìn)行基因的化學(xué)合成。（2） 基因組文庫(kù)法：機(jī)械切割法；限制性內(nèi)切酶局部消化法是一種直接從基因組中分離目的基因的方法。所謂基因組文庫(kù)是指匯集某

29、一基因組所有DNA序列的重組DNA群體（3） cDNA文庫(kù)法：是從真核生物細(xì)胞分中分離目的基因的常用方法cDNA文庫(kù)：是指匯集以某種生物成熟mRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄而成的cDNA序列的重組DNA群體構(gòu)建cDNA文庫(kù)的一般操作程序如下：總RNA的提取mRNA的分離cDNA雙鏈的合成cDNA與載體連接噬菌體的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（4） PCR法：可用于已知核苷酸片段的特意擴(kuò)增；而一些改進(jìn)的PCR法可以用于一些未知核苷酸序列核酸片段的特意擴(kuò)增。13、 重組體導(dǎo)入大腸桿菌，植物動(dòng)物各有什么方法？植物：農(nóng)桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)法；基因槍法動(dòng)物：顯微注射法；磷酸鈣共沉淀法；電穿孔法；病毒感染法14、 重組體篩選和鑒定

30、方法（遺傳檢測(cè)法） 利用表型特征進(jìn)行篩選a) 利用載體提供的表型特征進(jìn)行篩選（抗藥性標(biāo)記基因插入失活篩選法；-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)篩選法）b) 利用外源DNA提供的表型特征進(jìn)行篩選c) 利用噬菌斑的形成進(jìn)行篩選d) 利用遺傳互補(bǔ)作用進(jìn)行篩選 物理篩選鑒定法（電泳檢測(cè)法；R-環(huán)檢測(cè)法） 利用限制性內(nèi)切核酸酶酶切進(jìn)行鑒定 利用核酸雜交進(jìn)行鑒定 利用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定 利用免疫學(xué)方法進(jìn)行篩選鑒定放射性抗體檢測(cè)法；免疫沉淀檢測(cè)法；酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法 利用Western雜交進(jìn)行鑒定 利用寡核苷酸序列測(cè)定進(jìn)行鑒定 轉(zhuǎn)譯篩選鑒定法（阻斷轉(zhuǎn)譯雜交法；釋放轉(zhuǎn)譯雜交法）15、 幾丁質(zhì)酶具有抗真菌作用，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)獲得幾

31、丁質(zhì)抗真菌植物基因序列已知 基因序列未知 設(shè)計(jì)引物（加合適限制性內(nèi)切酶 獲得基因序列 位點(diǎn)，保證閱讀框不被破壞） 擴(kuò)增基因、酶和Ti載體連接 （合適的啟動(dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記等） 篩選陽(yáng)性克隆（抗藥性、PCR、酶切、 測(cè)序）-E.coli 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌、轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞 篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，驗(yàn)證、獲得完整植株評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)工程1、 蛋白質(zhì)工程的組成部分蛋白質(zhì)工程主要包括以下兩方面： 分子遺傳學(xué)的相關(guān)理論與技術(shù)：完整的cDNA克隆技術(shù)、DNA序列的快速測(cè)定技術(shù)、DNA序列推測(cè)蛋白質(zhì)序列的多維程序系統(tǒng)、原核生物及真核生物基因表達(dá)過(guò)程的調(diào)控、基因的定位誘變及隨機(jī)誘變理論與技術(shù) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能相關(guān)的理論與技術(shù)：蛋白質(zhì)

32、一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列的分析、X光單晶衍射結(jié)構(gòu)分析技術(shù)、兩維和三維核磁共振結(jié)構(gòu)分析技術(shù)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立、蛋白質(zhì)功能的酶學(xué)和免疫研究技術(shù)。2、 目的基因的定點(diǎn)突變的方法有哪些 寡核苷酸引物街道的定點(diǎn)突變 PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變 盒式突變3、 易錯(cuò)PCR的原理，簡(jiǎn)述利用易錯(cuò)PCR進(jìn)行酶分子進(jìn)化的基本實(shí)驗(yàn)流程易錯(cuò)PCR：是在采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，如提高M(jìn)g2+濃度、加入錳離子、改變體系中四種dNTPs濃度或運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等，未改變擴(kuò)增過(guò)程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體第五章 細(xì)胞工程1、 何為細(xì)胞融合技術(shù)？誘

33、導(dǎo)細(xì)胞融合的方法有哪些？細(xì)胞融合技術(shù)：是利用自然或人工的方法使兩個(gè)或幾個(gè)不同細(xì)胞融合為一個(gè)細(xì)胞，用于制造新的物種或品系（植物、微生物上用得多，動(dòng)物上用得少）及產(chǎn)生單克隆抗體等的技術(shù)誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法：病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合、化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞融合、電融合方法、其他2、 影響微生物原生質(zhì)體形成的因素有哪些？ 菌齡：微生物菌體的不同生長(zhǎng)時(shí)期，表現(xiàn)的生理狀況不同，不同生長(zhǎng)時(shí)期的微生物細(xì)胞的細(xì)胞壁對(duì)脫壁促進(jìn)劑的敏感程度可能會(huì)存在很大的不同。一般而言，對(duì)數(shù)期的菌體易被溶解酶脫壁，原生質(zhì)體的生成效率最高 培養(yǎng)基成分；構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)于葡萄糖+鹽的培養(yǎng)基菌絲比酵母膏培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌絲有利于原生質(zhì)體的形成，降低磷或增加螯

34、合劑也有利于原生質(zhì)體的形成 培養(yǎng)方法也影響原生質(zhì)體形成 酶的用量和處理時(shí)間也影響原生質(zhì)體的形成 獲得的原生質(zhì)體要保存與核實(shí)的滲透環(huán)境3、 微生物原生質(zhì)體如何制備？1) 親本菌株的標(biāo)記（如何將親本菌株與雜種細(xì)胞有效地分離是原生質(zhì)體融合技術(shù)中非常關(guān)鍵的一步）親本的標(biāo)記是否適于融合子的有效檢出和融合子中優(yōu)良性狀的保持有很大關(guān)系。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 抗藥性標(biāo)記 熒光標(biāo)記 失活原生質(zhì)體供體法2) 不同微生物細(xì)胞壁的消化一般采用溶菌酶處理就可達(dá)到細(xì)胞壁消化的目的。主要的細(xì)菌細(xì)胞壁溶解酶可分為兩大類：作用與糖苷鍵的糖苷酶類和作用于酰胺部分和肽部分的酶。前者也稱自溶素，在微生物的細(xì)胞自溶中起重要作用；后一類酶包

35、括了切開(kāi)肽聚糖中肽段部分肽鍵的肽酶。4、 微生物細(xì)胞融合的基本步驟 微生物原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的再生（原生質(zhì)體只有再生才能對(duì)其后代進(jìn)行遺傳鑒定， 而且再生率的高低，將直接影響原生質(zhì)體融合育種的重組效果 原生質(zhì)體的融合和雜合子的篩選5、 細(xì)胞系、細(xì)胞株、原代培養(yǎng)、細(xì)胞傳代細(xì)胞系：原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系。如果傳代有限，可稱為有限細(xì)胞系；如可連續(xù)傳代，則稱為聯(lián)系細(xì)胞系。細(xì)胞株：通過(guò)選擇法或克隆從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得的具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株。原代培養(yǎng)：從供體取得組織細(xì)胞后，在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)（PPT）。以直接取自生物體細(xì)胞、組織或器官開(kāi)始的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。細(xì)胞

36、傳代：當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞增值到一定程度時(shí)（一般標(biāo)準(zhǔn)是瓶底被細(xì)胞覆蓋），這時(shí)需進(jìn)行分離培養(yǎng)，細(xì)胞由原代培養(yǎng)瓶分離稀釋后轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)液的過(guò)程，稱為傳代。（PPT）無(wú)論稀釋與否，將細(xì)胞從一個(gè)培養(yǎng)容器轉(zhuǎn)移或移植到另一個(gè)培養(yǎng)容器即稱為傳代或傳代培養(yǎng)。6、 植物細(xì)胞培養(yǎng)、外植體、愈傷組織、細(xì)胞全能性植物細(xì)胞培養(yǎng)：即植物細(xì)胞的體外培養(yǎng)，是指在無(wú)菌條件i啊，將植物細(xì)胞從機(jī)體內(nèi)分離出來(lái)，在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上使其生存和生長(zhǎng)的過(guò)程。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以直接觀察到生活細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)活動(dòng)，并且將植物微生物化，在一定容積的反應(yīng)器中得到大量的植物細(xì)胞。植物細(xì)胞培養(yǎng)主要依據(jù)是細(xì)胞的全能性，即植物體每一個(gè)分化的細(xì)胞在一定培養(yǎng)條件下具

37、有形成一個(gè)完整植株的潛在能力。再生的植物具有與母體植株基本相同的全套遺傳信息。外植體：植物組織培養(yǎng)中，作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段統(tǒng)稱為外植體愈傷組織：愈傷組織是由母體外植體組織的增生細(xì)胞產(chǎn)生的一團(tuán)不定型的疏松排列的薄壁細(xì)胞。一般愈傷組織培養(yǎng)中沒(méi)有明顯的組織或器官的分化。細(xì)胞全能性：這是指植物體的每個(gè)細(xì)胞在離體條件下都具有誘導(dǎo)生長(zhǎng)分化形成完整植株的潛在能力，這是由于每個(gè)細(xì)胞都有一套完整的基因組。細(xì)胞全能性是植物細(xì)胞核組織培養(yǎng)的主要依據(jù)。7、 植物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)要求和特點(diǎn)植物細(xì)胞生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)成分與整個(gè)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求一樣，通產(chǎn)更包括：無(wú)機(jī)鹽、碳源、維生素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、氮源、核酸及其水解物和其他成分。應(yīng)用最廣的是MS和LS培養(yǎng)基，特別適于植株再生。 無(wú)機(jī)鹽：鉀、銨、鈣、鎂、磷、 碳源和能源：一般以蔗糖和葡萄糖為碳源 維生素：植物細(xì)胞培養(yǎng)需要硫胺素，如果加入煙