miR-155調(diào)控HGAL的表達(dá)和增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)

1、miR-155調(diào)控HGAL的表達(dá)和增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)匯報(bào)人摘要、前言方法、結(jié)果文本摘要 HGAL是彌漫性大B淋巴瘤和霍金斯淋巴瘤的病人的預(yù)后指標(biāo) 靶向結(jié)合miR-155 RhoA actinHGAL 腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前言 HGAL:淋巴生發(fā)中心特殊基因，至少通過(guò)2個(gè)分子機(jī)制參與了淋巴細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的負(fù)調(diào)控。一是直接結(jié)合到肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白上，二是激活RhoA信號(hào)通路。但它本身的調(diào)控機(jī)制還不清楚。 miRNA：小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)參與調(diào)控多種的生命活動(dòng)。他們參與免疫系統(tǒng)的調(diào)控可能對(duì)淋巴細(xì)胞引起的惡性腫瘤的發(fā)病有作用。方法 尋找miRNA靶基因和結(jié)合位點(diǎn) RNA分離和mi

2、RNA定量PCR( real-time PCR) DNA構(gòu)建 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 趨化實(shí)驗(yàn) RhoA pull-down assay結(jié)果miRNA155抑制抑制HGAL的表達(dá)的表達(dá)：蛋白水平的檢測(cè)(A) 在Raji, MC116, 和VAL細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染高表達(dá)hsa-miR-155 48小時(shí)后用Western blot檢測(cè)HGAL蛋白表達(dá)水平， Actin水平作為內(nèi)參。從圖中可以看出從圖中可以看出3 3個(gè)細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了個(gè)細(xì)胞系轉(zhuǎn)染了miR-155miR-155后，跟對(duì)照比后，跟對(duì)照比相比，相比，HGALHGAL蛋白表達(dá)量都有降低。蛋白表達(dá)量都有降低。miRNA155抑制抑制HGAL的表達(dá)的表達(dá)：mR

3、NA水平的檢測(cè)B.Raji細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染高表達(dá)hsa-miR-155通過(guò)real-time PCR在轉(zhuǎn)染24, 48, 和 72小時(shí)后檢測(cè)HGAL mRNA水平。結(jié)果從圖中可以看出，在轉(zhuǎn)染從圖中可以看出，在轉(zhuǎn)染hsa-miR-155 72hsa-miR-155 72小時(shí)后小時(shí)后HGAL HGAL mRNAmRNA的降低水平大到最大的降低水平大到最大miRNA155抑制抑制HGAL的表達(dá)的表達(dá)：mRNA水平的檢測(cè)C.MC116細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染高表達(dá)hsa-miR-155通過(guò)real-time PCR在轉(zhuǎn)染24, 48, 和 72小時(shí)后檢測(cè)HGAL mRNA水平結(jié)果從圖中可以看出，在轉(zhuǎn)染從圖中可以看出，

4、在轉(zhuǎn)染hsa-miR-155 48hsa-miR-155 48小時(shí)后小時(shí)后HGAL mRNAHGAL mRNA的降的降低水平大到最大低水平大到最大MiR-155直接作用于HGALmRNA的3-UTR上D、HeLa細(xì)胞系中：野生型和3UTR突變HGAL融合雙熒光素酶報(bào)告基因 。黑柱代表共轉(zhuǎn)染hsa-mir-155與報(bào)告基因與3UTR突變或，灰柱表表共轉(zhuǎn)染hsa-mir-155隨機(jī)突變載體與報(bào)告基因。從圖中可以看出從圖中可以看出miR-155miR-155可能結(jié)合位點(diǎn)可能結(jié)合位點(diǎn)突變后熒光素活性沒(méi)有突變后熒光素活性沒(méi)有恢復(fù)，突變后熒光素恢復(fù)，突變后熒光素活性恢復(fù)活性恢復(fù)。結(jié)果說(shuō)明了說(shuō)明了miR-1

5、55miR-155轉(zhuǎn)錄后調(diào)控轉(zhuǎn)錄后調(diào)控HGALHGAL的表達(dá)是通過(guò)與的表達(dá)是通過(guò)與HGAL-3HGAL-3UTRUTR上的上的M2M2結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)。MiRNA155增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性結(jié)果說(shuō)明了說(shuō)明了MiRNA155增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性我們探索了miR-155對(duì)Raji, VAL和MC116 淋巴瘤細(xì)胞SDF-1和 IL-6趨化運(yùn)動(dòng)的影響。和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了和對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染了hsa-miR-155hsa-miR-155顯著減少了顯著減少了HGALHGAL蛋白表達(dá)，加強(qiáng)了蛋白表達(dá)，加強(qiáng)了SDF-1-SDF-1-誘導(dǎo)的的淋巴瘤細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)。誘導(dǎo)的的淋巴瘤細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)。MiRNA155

6、增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性結(jié)果從圖上的結(jié)果可以看出從圖上的結(jié)果可以看出MiRNA155增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增加淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、Raji細(xì)胞接種到 fibronectin coated6-well plates板上，轉(zhuǎn)染hsa-mir-155或 nontargeted對(duì)照組48小時(shí)后 實(shí)時(shí)圖像一小時(shí)內(nèi)每2分鐘拍一次的運(yùn)動(dòng)途徑。C、在每個(gè)處理組中50的細(xì)胞平均速度。 miR-155對(duì)RhoA活性的影響結(jié)果A、Raji，Val，和sudhl6淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前無(wú)血清培養(yǎng)饑餓8小時(shí)，然后用LPA（1.5 克/毫升）處理45秒。轉(zhuǎn)染hsa-mir-155或nontargeting48小時(shí)后。細(xì)胞裂解用W

7、esternblot檢測(cè)Total RhoA 的表達(dá)，和rhoa pull-down檢測(cè)RhoA-GTP的水平和檢測(cè)HGAL的表達(dá)。從圖上可以看出在從圖上可以看出在Raji, Raji, SUDHL6,SUDHL6,和和VALVAL淋巴瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)淋巴瘤細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了染了hsa-miR-155hsa-miR-155沒(méi)有對(duì)總沒(méi)有對(duì)總RhoARhoA蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響。蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生影響。說(shuō)明了說(shuō)明了RhoA蛋白不是蛋白不是miR-155的直接靶標(biāo)的直接靶標(biāo)miR-155對(duì)F-actin的聚合的作用結(jié)果B、Raji，Val，和sudhl6淋巴瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前無(wú)血清培養(yǎng)饑餓8小時(shí)，然后處理或不處理45秒

8、LPA（1.5 克/毫升）處理45秒。轉(zhuǎn)染hsa-mir-155或nontargeting48小時(shí)后。固定后用Alexa-488鬼筆環(huán)肽后的染色后用流式細(xì)胞儀分析。通過(guò)通過(guò)增加增加RhoA活性，活性，HGAL同樣作同樣作用于用于RhoA的下游效應(yīng)物，下的下游效應(yīng)物，下調(diào)應(yīng)力纖維的形成和激動(dòng)蛋白調(diào)應(yīng)力纖維的形成和激動(dòng)蛋白的聚合的聚合miR-155對(duì)F-actin的聚合的作用結(jié)果圖4。bic / miR-155 - / -小鼠脾B細(xì)胞趨化性實(shí)驗(yàn)。bic / miR-155 - / -或?qū)φ战M小鼠脾B細(xì)胞用于SDF-1和IL-6的趨化實(shí)驗(yàn)。從圖中可以看出，從圖中可以看出，miR-155并沒(méi)有增加小鼠

9、并沒(méi)有增加小鼠脾脾B細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，這與體細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性，這與體外培養(yǎng)的人屬淋巴瘤細(xì)胞外培養(yǎng)的人屬淋巴瘤細(xì)胞的結(jié)果是相反了，說(shuō)明了的結(jié)果是相反了，說(shuō)明了在鼠科中，在鼠科中，miR-155及及M17（HGAL人屬）的作用機(jī)制人屬）的作用機(jī)制還有待進(jìn)步一步的研究。還有待進(jìn)步一步的研究。miR-155上調(diào)RTKN2的表達(dá)結(jié)果圖5A在RajiVAL, 和 MC116細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染hsa-mir-155 48小時(shí)后用Western blot檢測(cè)RTKN2和肌球蛋白輕鏈蛋白表達(dá)水平。Actin作為內(nèi)參。從圖中可以看出，轉(zhuǎn)染了從圖中可以看出，轉(zhuǎn)染了hsa-mir-155后，后，RTKN2的表達(dá)減少的表達(dá)減少但但肌

10、球蛋白輕鏈蛋白肌球蛋白輕鏈蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響。說(shuō)明了的表達(dá)沒(méi)有影響。說(shuō)明了RTKN2是是miR-155在在RhoA信號(hào)通路中的靶位點(diǎn)。信號(hào)通路中的靶位點(diǎn)。miR-155對(duì)RTKN2的調(diào)控是直接的的調(diào)控是直接的結(jié)果在HeLa細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染與野生型或rtkn23-UTR突變?nèi)诤想p熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒與hsamiR-155。黑柱代表共轉(zhuǎn)染了 hsamiR-155；灰柱代表共轉(zhuǎn)染與nontargeting對(duì)照。在假定的結(jié)合位點(diǎn)的突變命名為M1和M2的3-UTR和兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變?yōu)镸1+2。從圖中可以看出共轉(zhuǎn)染從圖中可以看出共轉(zhuǎn)染hsa-miR-155與熒光素質(zhì)粒到與熒光素質(zhì)粒到HeLa細(xì)胞細(xì)胞中，熒光素活性減少中，熒光素活性減少60%。對(duì)。對(duì)M1進(jìn)行突變后，熒光素活性恢復(fù)進(jìn)行突變后，熒光素活性恢復(fù)75%,對(duì)對(duì)M2突變后，活性增加了突變后，活性增加了80%。對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)都進(jìn)行突變，。對(duì)兩個(gè)位點(diǎn)都進(jìn)行突變，活性全部恢復(fù)。活性全部恢復(fù)。結(jié)果這些結(jié)果說(shuō)明了這些結(jié)果說(shuō)明了miR-155miR-155通過(guò)作用于通過(guò)作用于HGALHGAL和和RTKN2RTKN2增加了增加了淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性淋巴瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性討論 免疫應(yīng)答中miR-155有活躍的作用 。在GC淋巴細(xì)胞分化過(guò)程中B細(xì)胞受體或是NF