無菌檢查法概念

1、無菌檢查法概念無菌檢查法概念 指用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療指用于檢查藥典要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法。的一種方法。 若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)被微明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。生物污染。無菌檢查法概念無菌檢查法概念 無菌檢查是通過目檢微生物在培養(yǎng)基中無菌檢查是通過目檢微生物在培養(yǎng)基中的生長來判斷結(jié)果。的生長來判斷結(jié)果。 無菌檢驗只能給出該批產(chǎn)品受污染的程無菌檢驗只能給出該批產(chǎn)品受污染的程度。度。 無菌檢驗合格只能說明被測樣品無菌，無菌

2、檢驗合格只能說明被測樣品無菌，不能證明整批樣品無菌。不能證明整批樣品無菌。無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員 檢查環(huán)境應(yīng)在潔凈度檢查環(huán)境應(yīng)在潔凈度1000010000級下的局部潔級下的局部潔凈度凈度100100級的單項流空氣區(qū)域內(nèi)或級的單項流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系隔離系統(tǒng)統(tǒng)中進行，其全過程必須嚴格遵守無菌中進行，其全過程必須嚴格遵守無菌操作。操作。 隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進行驗證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員 規(guī)定應(yīng)定期按規(guī)定應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（

3、區(qū)）醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度的驗證。的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度的驗證。 日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。日常檢驗還需對試驗環(huán)境進行監(jiān)控。無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員無菌檢查的設(shè)施、環(huán)境、人員 無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，無菌檢查人員必須具備微生物專業(yè)知識，并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓。并經(jīng)過無菌技術(shù)的培訓。 無菌隔離系統(tǒng)無菌隔離系統(tǒng)無菌隔離系統(tǒng)是一個不受外界環(huán)境影響的、可進行無菌操作的獨無菌隔離系統(tǒng)是一個不受外界環(huán)境影響的、可進行無菌操作的獨立環(huán)境系統(tǒng)。立環(huán)境系統(tǒng)。使用隔離系統(tǒng)的優(yōu)點：它能創(chuàng)造一個持續(xù)高效的高度

4、無菌空間使用隔離系統(tǒng)的優(yōu)點：它能創(chuàng)造一個持續(xù)高效的高度無菌空間, ,保保護產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的護產(chǎn)品免受外源性污染，包括操作人員、操作環(huán)境及外包裝等的污染，確保操作環(huán)境及實驗物品表面能達到無菌要求，防止出現(xiàn)污染，確保操作環(huán)境及實驗物品表面能達到無菌要求，防止出現(xiàn)假陽性結(jié)果假陽性結(jié)果, ,保證保證無菌實驗結(jié)果的可靠性，從而實現(xiàn)一次檢出的要無菌實驗結(jié)果的可靠性，從而實現(xiàn)一次檢出的要求；保護操作人員免受實驗過程中的有害物質(zhì)帶來的污染；放置求；保護操作人員免受實驗過程中的有害物質(zhì)帶來的污染；放置隔離器的環(huán)境潔凈度不需要特殊要求，移動方便等優(yōu)點隔離器的環(huán)境潔凈度不需要特

5、殊要求，移動方便等優(yōu)點 。HTYHTY無菌隔離系統(tǒng)無菌隔離系統(tǒng)無菌檢查用培養(yǎng)基的種類及用途無菌檢查用培養(yǎng)基的種類及用途 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基-培養(yǎng)好氧菌、培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌厭氧菌 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基-培養(yǎng)真菌及好氧細菌培養(yǎng)真菌及好氧細菌 選擇性培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基-按硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)按硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在基或改良馬丁培養(yǎng)基的處方及制法，在培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量的中和劑培養(yǎng)基滅菌或使用前加入適量的中和劑或表面活性劑。或表面活性劑。培養(yǎng)基的制備及裝量培養(yǎng)基的制備及裝量 培養(yǎng)基可按處方制備，亦可使用按該處方生產(chǎn)培養(yǎng)基可按處方制備，亦可

6、使用按該處方生產(chǎn)的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。的符合規(guī)定的脫水培養(yǎng)基。 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的裝量與容器高度的比例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）例應(yīng)符合培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基氧化層（粉紅色）不超過培養(yǎng)基深度不超過培養(yǎng)基深度1/21/2。供試品接種前，培養(yǎng)。供試品接種前，培養(yǎng)基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的基氧化層顏色不得超過培養(yǎng)基深度的1/51/5，否，否則，須經(jīng)則，須經(jīng)100100水浴加熱至粉紅色消失（不超水浴加熱至粉紅色消失（不超過過2020分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。分鐘），迅速冷卻，只限加熱一次。 培養(yǎng)基的儲存培養(yǎng)基的儲存 制備好的培養(yǎng)基應(yīng)該保存

7、在制備好的培養(yǎng)基應(yīng)該保存在2-252-25、避光的、避光的環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在環(huán)境，若保存于非密閉容器中，一般在3 3周周內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在內(nèi)使用；若保存于密閉容器中，一般可在1 1年內(nèi)使用。年內(nèi)使用。 應(yīng)結(jié)合實際情況進行驗證，以確定培養(yǎng)基應(yīng)結(jié)合實際情況進行驗證，以確定培養(yǎng)基有效期。有效期。培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查 本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無菌檢查同時進行。試品的無菌檢查同時進行。 無菌性檢查無菌性檢查 重要性：培養(yǎng)基無菌不合格將導致實驗重要性：培養(yǎng)基無菌不合格將導致實驗的假陽性結(jié)果。的假陽性結(jié)果。

8、檢查：每批培養(yǎng)基隨機抽取不少于檢查：每批培養(yǎng)基隨機抽取不少于5 5支或支或5 5瓶，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置瓶，硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置30-3530-35培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置培養(yǎng)，改良馬丁培養(yǎng)基置23-2823-28培養(yǎng)，培養(yǎng)，培養(yǎng)培養(yǎng)1414天，應(yīng)無菌生長。天，應(yīng)無菌生長。 培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查 靈敏度檢查靈敏度檢查菌種菌種 硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 生孢梭菌生孢梭菌 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查菌種選擇的原

9、則菌種選擇的原則 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、標準菌株代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、標準菌株( (或該藥品中常見的污染菌或該藥品中常見的污染菌) )。 金黃色葡萄球菌（代表革蘭氏陽性菌）、銅綠色假單金黃色葡萄球菌（代表革蘭氏陽性菌）、銅綠色假單胞菌（代表革蘭氏陰性菌）、枯草芽孢桿菌（代表藥胞菌（代表革蘭氏陰性菌）、枯草芽孢桿菌（代表藥品中最常見或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厭氧品中最常見或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厭氧菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉菌）。菌）。 菌種的要求：不得超過菌種的要求：不得超過5 5代

10、。采用適宜的菌種保藏方法代。采用適宜的菌種保藏方法保存，以保證菌種的生物學特性。保存，以保證菌種的生物學特性。 加菌量加菌量: :100cfu100cfu。培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查菌液制備菌液制備 試驗菌試驗菌 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 營養(yǎng)肉湯營養(yǎng)肉湯 30-35 18-2430-35 18-24銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 生孢梭菌生孢梭菌 硫乙醇酸鹽流體硫乙醇酸鹽流體白色念珠球菌白色念珠球菌 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基 23-28 24-4823-28 24-48黑曲霉黑曲霉 改良馬丁瓊脂斜面改良馬丁

11、瓊脂斜面 5-75-7天天培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基接種培養(yǎng)基接種 試驗菌試驗菌 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 每管裝量每管裝量 接種管數(shù)接種管數(shù) 接種量接種量 培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 硫乙醇酸鹽硫乙醇酸鹽 12 ml 2 12 ml 2 支支 1 ml 31 ml 3天天銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌生孢梭菌生孢梭菌 白色念珠球菌白色念珠球菌 改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基 9 ml 29 ml 2支支 1 ml 51 ml 5天天黑曲霉黑曲霉 其中硫乙醇酸鹽及改良馬丁培養(yǎng)基均有其中硫乙醇酸鹽及改良馬丁培養(yǎng)基均有 1 1支不接種作為空白支不接種作為空白

12、接種量接種量 100cfu100cfu（不能多）（不能多）培養(yǎng)基的適用性檢查培養(yǎng)基的適用性檢查結(jié)果判斷結(jié)果判斷 空白對照應(yīng)無菌生長，若加菌的培空白對照應(yīng)無菌生長，若加菌的培養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的養(yǎng)基管均生長良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。靈敏度檢查符合規(guī)定。 試驗同時應(yīng)做空白對照試驗同時應(yīng)做空白對照培養(yǎng)基說明培養(yǎng)基說明 無菌檢驗培養(yǎng)基所能支持生長的微生物無菌檢驗培養(yǎng)基所能支持生長的微生物是有限的。是有限的。 微生物種類繁多，這些微生物有廣泛的微生物種類繁多，這些微生物有廣泛的生長要求，如：營養(yǎng)、溫度和氧等。生長要求，如：營養(yǎng)、溫度和氧等。 無菌檢驗培養(yǎng)基不可能支持所有微生物無菌檢

13、驗培養(yǎng)基不可能支持所有微生物的生長，選擇了支持那些最有可能污染的生長，選擇了支持那些最有可能污染藥品和在藥品中生長的微生物的營養(yǎng)的藥品和在藥品中生長的微生物的營養(yǎng)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。供試品的無菌檢查法供試品的無菌檢查法 無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。只無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。只要供試品性狀允許，要供試品性狀允許，應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。應(yīng)優(yōu)先采用薄膜過濾法。 進行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和進行供試品無菌檢查時，所采用的檢查方法和檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。檢驗條件應(yīng)與驗證的方法相同。 薄膜過濾法可以提高無菌檢驗的檢出率，特別薄膜過濾法可以提高無菌檢驗的檢出率，特別是

14、抑菌性供試品，采用薄膜過濾法可以有效消是抑菌性供試品，采用薄膜過濾法可以有效消除供試品的抑菌性，提高檢出率。除供試品的抑菌性，提高檢出率。 供試品的無菌檢查法供試品的無菌檢查法-直接接種法直接接種法 樣品直接移入無菌培養(yǎng)基中。樣品直接移入無菌培養(yǎng)基中。 每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品每個容器中培養(yǎng)基的用量應(yīng)符合接種的供試品體積不得大于培養(yǎng)基體積的體積不得大于培養(yǎng)基體積的10%10%。 同時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于同時硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基每管裝量不少于15ml15ml，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于，改良馬丁培養(yǎng)基每管裝量不少于10ml10ml。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗

15、。培養(yǎng)基的用量和高度同方法驗證試驗。 每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。每種培養(yǎng)基接種的管數(shù)同供試品的檢驗數(shù)量。供試品的無菌檢查法供試品的無菌檢查法-薄膜過濾法薄膜過濾法 原理：薄膜過濾法是將供試品通過濾膜，微生物截留原理：薄膜過濾法是將供試品通過濾膜，微生物截留于濾膜上，若有抑菌作用的藥品同時使用沖洗液沖洗于濾膜上，若有抑菌作用的藥品同時使用沖洗液沖洗濾膜上殘留的供試品（如有殘留會抑制微生物生長），濾膜上殘留的供試品（如有殘留會抑制微生物生長），然后，培養(yǎng)濾膜看其是否有微生物生長。然后，培養(yǎng)濾膜看其是否有微生物生長。 選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)考慮供試品及其溶劑的特性，水溶選擇濾膜材質(zhì)時應(yīng)考慮供

16、試品及其溶劑的特性，水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。油類供試品，其濾膜和過濾器在使用前應(yīng)充分干燥。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。 供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為張濾膜每次沖洗量為100ml100ml，且沖洗量不超過，且沖洗量不超過1000ml1000ml，以避免濾膜上的微生物受損傷。以避免濾膜上的微生物受損傷。 過濾器應(yīng)優(yōu)先選擇過濾器應(yīng)優(yōu)先選擇封閉式封閉式薄膜過

17、濾），薄膜過濾），也可使用一般也可使用一般薄膜過濾器。濾膜孔徑不大于薄膜過濾器。濾膜孔徑不大于0.45m0.45m，直徑約為，直徑約為50mm50mm。供試品的無菌檢查法供試品的無菌檢查法 檢驗數(shù)量檢驗數(shù)量 指一次檢驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)指一次檢驗所用供試品最小包裝容器的數(shù)量量 采用薄膜過濾法應(yīng)增加采用薄膜過濾法應(yīng)增加1/21/2的最小檢驗數(shù)量作為陽性對的最小檢驗數(shù)量作為陽性對照；采用直接接種法應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個培照；采用直接接種法應(yīng)增加供試品無菌檢查時每個培養(yǎng)基容器接種的樣品量作為陽性對照。養(yǎng)基容器接種的樣品量作為陽性對照。 檢驗量檢驗量 指一次試驗所用供試品總量（指一次試驗所

18、用供試品總量（g g或或mlml），若），若每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，每支（瓶）供試品裝量按規(guī)定足夠接種兩份培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基。采用薄膜過濾法時，檢驗量不應(yīng)少于直接接種法基。采用薄膜過濾法時，檢驗量不應(yīng)少于直接接種法的供試品總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容的供試品總量，只要供試品的特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾器內(nèi)的全部內(nèi)容物過濾. .無菌檢查的稀釋液、沖洗液無菌檢查的稀釋液、沖洗液 無菌檢驗所用稀釋液、沖洗液種類應(yīng)對微生物無毒、無菌檢驗所用稀釋液、沖洗液種類應(yīng)對微生物無毒、

19、無抑制作用。稀釋液用量、沖洗液沖洗次數(shù)及用量等無抑制作用。稀釋液用量、沖洗液沖洗次數(shù)及用量等應(yīng)當與驗證合格的方法一致。每張濾膜每次沖洗量為應(yīng)當與驗證合格的方法一致。每張濾膜每次沖洗量為100ml100ml，總沖洗量不宜過大（不超過，總沖洗量不宜過大（不超過1000ml1000ml），用量過），用量過多不僅容易破壞濾膜上截留的微生物，而且對濾膜造多不僅容易破壞濾膜上截留的微生物，而且對濾膜造成損傷；但也不能太少，否則不能將供試品沖洗干凈，成損傷；但也不能太少，否則不能將供試品沖洗干凈，無法消除抑菌性。無法消除抑菌性。 0.1%0.1%蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液 PH7.0PH7.0氯化鈉氯化鈉-

20、-蛋白胨緩沖液蛋白胨緩沖液如需要可加入表面活性劑或中和劑如需要可加入表面活性劑或中和劑, ,應(yīng)經(jīng)方法驗證證明應(yīng)經(jīng)方法驗證證明其有效性，并對細菌存活無影響。其有效性，并對細菌存活無影響。供試品溶液的制備供試品溶液的制備 水溶液供試品水溶液供試品 取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的取規(guī)定量，直接過濾，或混合至含適量稀釋液的無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。無菌容器內(nèi)，混勻，立即過濾。 如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用適量的沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。沖洗液沖洗濾膜，沖洗次數(shù)不得少于三次。 沖洗后，如用封閉式薄膜過濾器，分別將沖洗后，如用封閉

21、式薄膜過濾器，分別將100ml100ml硫硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基加入相應(yīng)的濾筒內(nèi)。的濾筒內(nèi)。 如果采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成如果采用一般薄膜過濾器，取出濾膜，將其剪成3 3等份，分別置于含等份，分別置于含50ml50ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基及改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中一份做陽性對照用。改良馬丁培養(yǎng)基容器中，其中一份做陽性對照用。 可溶于水的固體制劑供試品可溶于水的固體制劑供試品 取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復(fù)取規(guī)定量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復(fù)溶，然后照水溶液供試品項下的方法操作。溶，然

22、后照水溶液供試品項下的方法操作。 -內(nèi)酰胺類抗生素供試品內(nèi)酰胺類抗生素供試品 取規(guī)定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理法取規(guī)定量，按水溶液或固體制劑供試品的處理法處理，過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含處理，過濾，用適宜的沖洗液沖洗濾膜。再用含適量適量-內(nèi)酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜內(nèi)酰胺酶的沖洗液清除殘留在濾筒、濾膜上的抗生素后接種培養(yǎng)基，必要時培養(yǎng)基中可加上的抗生素后接種培養(yǎng)基，必要時培養(yǎng)基中可加少量的少量的-內(nèi)酰胺酶；或?qū)V膜直接接入含適量內(nèi)酰胺酶；或?qū)V膜直接接入含適量-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基的方法照水內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基中。接種培養(yǎng)基的方法照水溶液供試品項下的方法操作。溶

23、液供試品項下的方法操作。供試品溶液的制備供試品溶液的制備 非水溶性制劑供試品非水溶性制劑供試品 取規(guī)定量，直接過濾或混合溶于含聚山梨酯取規(guī)定量，直接過濾或混合溶于含聚山梨酯8080或或其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過其它適宜乳化劑的稀釋液中，充分混合，立即過濾。用含濾。用含0.1%-1%0.1%-1%聚山梨酯聚山梨酯8080的沖洗液沖洗濾膜至的沖洗液沖洗濾膜至少少3 3次。濾膜于含或不含聚山梨酯次。濾膜于含或不含聚山梨酯8080的培養(yǎng)基中培的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項下的方法操作。養(yǎng)。培養(yǎng)基接種照水溶液供試品項下的方法操作。其他類供試品：其他類供試品： 可溶于十四烷酸異

24、丙酯的膏劑和粘性油劑供試可溶于十四烷酸異丙酯的膏劑和粘性油劑供試品品 無菌氣（噴）霧劑供試品無菌氣（噴）霧劑供試品 裝有藥物的注射器供試品裝有藥物的注射器供試品 具有導管的醫(yī)療器具具有導管的醫(yī)療器具( (輸血、輸液袋等輸血、輸液袋等) )供試品供試品 供試品溶液的制備供試品溶液的制備陽性對照試驗陽性對照試驗 目的：目的：驗證供試品經(jīng)滅活后或用其它方式（稀驗證供試品經(jīng)滅活后或用其它方式（稀釋、沖洗等）處理后是否仍有抑菌或殺菌的作用，釋、沖洗等）處理后是否仍有抑菌或殺菌的作用，確保檢驗條件符合要求，防止出現(xiàn)假陰性。確保檢驗條件符合要求，防止出現(xiàn)假陰性。培培養(yǎng)條件是否符合要求。養(yǎng)條件是否符合要求。

25、應(yīng)根據(jù)供試品的特性選擇陽性對照菌。應(yīng)根據(jù)供試品的特性選擇陽性對照菌。 無抑菌及抗革蘭陽性無抑菌及抗革蘭陽性- -金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 抗革蘭陰性抗革蘭陰性- -大腸埃希菌大腸埃希菌 抗厭氧菌抗厭氧菌- -生孢梭菌生孢梭菌 抗真菌抗真菌- -白色念珠菌白色念珠菌 陽性對照菌加量：陽性對照菌加量：100cfu100cfu 陽性對照培養(yǎng)陽性對照培養(yǎng)48-72h 48-72h 應(yīng)生長良好。應(yīng)生長良好。陰性對照陰性對照 不加樣品的無菌檢驗不加樣品的無菌檢驗 目的：確認無菌檢驗所用的稀釋液、沖洗液、培目的：確認無菌檢驗所用的稀釋液、沖洗液、培養(yǎng)基、青霉素酶、集菌器等物品及人員操作、檢養(yǎng)基、青霉素酶

26、、集菌器等物品及人員操作、檢驗環(huán)境、儀器設(shè)備等是否有菌存在。驗環(huán)境、儀器設(shè)備等是否有菌存在。 應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作。應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋劑同法操作。 應(yīng)與無菌檢驗同時做。應(yīng)與無菌檢驗同時做。 陰性對照不得有菌生長。陰性對照不得有菌生長。 培養(yǎng)及觀察培養(yǎng)及觀察 供試品無菌檢查培養(yǎng)溫度和時間非常重要，只供試品無菌檢查培養(yǎng)溫度和時間非常重要，只有在合適的溫度和時間內(nèi)微生物才能生長良好。有在合適的溫度和時間內(nèi)微生物才能生長良好。 培養(yǎng)培養(yǎng)1414天，如果培養(yǎng)基渾濁或培養(yǎng)天，如果培養(yǎng)基渾濁或培養(yǎng)1414天后從外天后從外觀不能判斷是否長菌，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種觀不能判斷是否長菌，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種

27、至同種培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，培至同種培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)細菌養(yǎng)細菌2 2天、真菌天、真菌3 3天，觀察有無菌生長，或鏡天，觀察有無菌生長，或鏡檢進行判斷。檢進行判斷。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 前提前提: :陽性對照為陽性，陰性對照為陰性，無菌陽性對照為陽性，陰性對照為陰性，無菌檢驗方有效。檢驗方有效。 若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌若供試品管均澄清，或雖顯渾濁但經(jīng)確證無菌生長，判供試品生長，判供試品符合規(guī)定符合規(guī)定。 若供試品中任何若供試品中任何1 1管顯混濁并確證有菌生長，管顯混濁并確證有菌生長，判供試品判供試品不符合規(guī)定不符合規(guī)定。 除非能充分證明，生長的微生物

28、非供試品所含。除非能充分證明，生長的微生物非供試品所含。 當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果當符合下列至少一個條件時，方可判試驗結(jié)果無效無效： 對無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控對無菌檢查試驗所用的設(shè)備及環(huán)境的微生物監(jiān)控結(jié)果不符合無菌檢查法的要求；結(jié)果不符合無菌檢查法的要求； 回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染回顧無菌試驗過程，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；的因素； 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證有微生供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證有微生物生長是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無物生長是因無菌試驗中所使用的物品和（或）無菌操作技術(shù)不當引起的。菌操作技術(shù)不當引

29、起的。試驗若經(jīng)確認無效，應(yīng)試驗若經(jīng)確認無效，應(yīng)重試重試。重試時，重。重試時，重新取新取同量同量供試品，依法重試，若無菌生長，供試品，依法重試，若無菌生長，判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品判供試品符合規(guī)定，若有菌生長判供試品不符合規(guī)定。不符合規(guī)定。 若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。被微生物污染。 所有供試品管均無菌生長，方可判供所有供試品管均無菌生長，方可判供試品符合規(guī)定。試品符合規(guī)定。 以一次檢出為準，除非有證據(jù)充分證以一次檢出為準，除非有證據(jù)充分證明檢出的微生物非供試品本身所致，

30、明檢出的微生物非供試品本身所致，原檢驗結(jié)果無效，應(yīng)重試。原檢驗結(jié)果無效，應(yīng)重試。無菌檢驗的局限性無菌檢驗的局限性 本版藥典無菌檢查法指出：若供試品符合無菌檢本版藥典無菌檢查法指出：若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)被微生物污染。發(fā)現(xiàn)被微生物污染。 藥品要么是無菌的，要么就是非無菌的。藥品是藥品要么是無菌的，要么就是非無菌的。藥品是否無菌的結(jié)論一直是以藥典規(guī)定的無菌檢查抽樣否無菌的結(jié)論一直是以藥典規(guī)定的無菌檢查抽樣和試驗方法的結(jié)果作為判斷依據(jù)。和試驗方法的結(jié)果作為判斷依據(jù)。 無菌檢查存在著很多局限性，最明顯的是無菌檢查存在著

31、很多局限性，最明顯的是無菌檢無菌檢查方法本身查方法本身。不管樣品是否有好的代表性，它的。不管樣品是否有好的代表性，它的結(jié)果總是存在不確定性。它是一個破壞性的試驗，結(jié)果總是存在不確定性。它是一個破壞性的試驗，它與整個批的一個隨機樣品的統(tǒng)計選擇性有關(guān)。它與整個批的一個隨機樣品的統(tǒng)計選擇性有關(guān)。無菌檢驗的局限性無菌檢驗的局限性 從理論上來說，要確定某批產(chǎn)品的無菌性，應(yīng)從理論上來說，要確定某批產(chǎn)品的無菌性，應(yīng)對每個容器進行無菌檢查。但是無菌試驗對樣對每個容器進行無菌檢查。但是無菌試驗對樣品是破壞性的，因此不可能對每一最小包裝的品是破壞性的，因此不可能對每一最小包裝的產(chǎn)品進行檢查。產(chǎn)品進行檢查。 統(tǒng)計概

32、率的局限性統(tǒng)計概率的局限性 ：對于低污染水平的產(chǎn)品，：對于低污染水平的產(chǎn)品，其局限性在統(tǒng)計學上更為明顯。其局限性在統(tǒng)計學上更為明顯。 檢驗條件的局限：檢驗條件的局限： 樣品中污染的微生物的檢樣品中污染的微生物的檢出受多種因數(shù)的影響，只有在各檢驗條件符合出受多種因數(shù)的影響，只有在各檢驗條件符合污染微生物的修復(fù)和生長時，才能保證被檢樣污染微生物的修復(fù)和生長時，才能保證被檢樣品的無菌檢驗結(jié)果的準確性。品的無菌檢驗結(jié)果的準確性。 污染的檢出率要比實際產(chǎn)品的污染率低污染的檢出率要比實際產(chǎn)品的污染率低 無菌檢查存在檢查失誤的可能性無菌檢查存在檢查失誤的可能性：這可能是因：這可能是因為污染菌濃度太低，或是污

33、染菌生長太慢，或是為污染菌濃度太低，或是污染菌生長太慢，或是因為培養(yǎng)基不良等原因，在培養(yǎng)期間污染菌根本因為培養(yǎng)基不良等原因，在培養(yǎng)期間污染菌根本就不生長。產(chǎn)品的染菌率愈小，錯判合格的可能就不生長。產(chǎn)品的染菌率愈小，錯判合格的可能性就愈大。性就愈大。 無菌檢查的另外一個弊端，無菌檢查的另外一個弊端，即當無菌檢查發(fā)現(xiàn)陽即當無菌檢查發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果時，按照規(guī)定可以重新復(fù)查（這也是應(yīng)該性結(jié)果時，按照規(guī)定可以重新復(fù)查（這也是應(yīng)該的）。復(fù)查時盡管已經(jīng)適當?shù)丶哟罅藰颖緮?shù)量，的）。復(fù)查時盡管已經(jīng)適當?shù)丶哟罅藰颖緮?shù)量，但再檢出的幾率就更低了。但再檢出的幾率就更低了。 所以在評價某個無菌制品的某個批的無菌狀態(tài)時，所以

34、在評價某個無菌制品的某個批的無菌狀態(tài)時，僅依靠最終產(chǎn)品的無菌檢查是不充分的，局限性僅依靠最終產(chǎn)品的無菌檢查是不充分的，局限性較大。對無菌制品來說，生產(chǎn)最終產(chǎn)品的所有系較大。對無菌制品來說，生產(chǎn)最終產(chǎn)品的所有系統(tǒng)的工藝才是最重要的。統(tǒng)的工藝才是最重要的。抽樣抽樣 由于無菌檢查法的統(tǒng)計學局限性，對于同一由于無菌檢查法的統(tǒng)計學局限性，對于同一批的無菌分裝的產(chǎn)品，應(yīng)盡量抽取批生產(chǎn)開批的無菌分裝的產(chǎn)品，應(yīng)盡量抽取批生產(chǎn)開始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品始和結(jié)束或生產(chǎn)過程出現(xiàn)異常情況下的產(chǎn)品組成樣本進行檢驗。對于采用最終滅菌的產(chǎn)組成樣本進行檢驗。對于采用最終滅菌的產(chǎn)品，應(yīng)抽取每一滅菌柜中經(jīng)驗證過的可

35、能存品，應(yīng)抽取每一滅菌柜中經(jīng)驗證過的可能存在滅菌不徹底的點的產(chǎn)品組成樣本進行檢驗。在滅菌不徹底的點的產(chǎn)品組成樣本進行檢驗。如果試驗結(jié)果判為無效，那么重試試驗的樣如果試驗結(jié)果判為無效，那么重試試驗的樣品應(yīng)盡量取與初試同一時間分裝或同一滅菌品應(yīng)盡量取與初試同一時間分裝或同一滅菌位置的樣品進行檢驗。位置的樣品進行檢驗。休息一下關(guān)于方法驗證試驗關(guān)于方法驗證試驗 為什么驗證？為什么驗證？ 驗證什么？驗證什么？ 怎么驗證？怎么驗證？為什么驗證為什么驗證 采用經(jīng)過驗證的方法，是分析測量科學的基本采用經(jīng)過驗證的方法，是分析測量科學的基本要求，是各種法規(guī)遵循工作的基礎(chǔ)。藥品微生要求，是各種法規(guī)遵循工作的基礎(chǔ)。藥

36、品微生物檢查作為藥品質(zhì)量體系中的一個環(huán)節(jié)，應(yīng)與物檢查作為藥品質(zhì)量體系中的一個環(huán)節(jié)，應(yīng)與其他檢驗項目一樣，對方法和條件進行考察，其他檢驗項目一樣，對方法和條件進行考察，以保證結(jié)果的科學性，如鑒別、含量測定。以保證結(jié)果的科學性，如鑒別、含量測定。 驗證的思想其實早已貫徹于微生物檢測的諸多驗證的思想其實早已貫徹于微生物檢測的諸多方面：無菌環(huán)境驗證（塵埃粒子、浮游菌、沉方面：無菌環(huán)境驗證（塵埃粒子、浮游菌、沉降菌檢測）、滅菌器的驗證、培養(yǎng)基靈敏度檢降菌檢測）、滅菌器的驗證、培養(yǎng)基靈敏度檢測、陰性對照、陽性對照等。測、陰性對照、陽性對照等。為什么驗證為什么驗證 藥典充分借鑒發(fā)達國家經(jīng)驗，將微生物檢查方藥

37、典充分借鑒發(fā)達國家經(jīng)驗，將微生物檢查方法的驗證實驗進行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。法的驗證實驗進行了更加系統(tǒng)化的規(guī)定和要求。驗證實驗伴隨著整個實驗過程，實驗過程中的驗證實驗伴隨著整個實驗過程，實驗過程中的每一個環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗證），保證每一個環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗證），保證其對結(jié)果判斷沒有影響。其對結(jié)果判斷沒有影響。 有了系統(tǒng)的方法驗證，可以避免以往因為陽性有了系統(tǒng)的方法驗證，可以避免以往因為陽性菌選擇不合理、方法不合理而造成的漏檢、誤菌選擇不合理、方法不合理而造成的漏檢、誤判，以保證結(jié)果的科學可靠，這一點無論對于判，以保證結(jié)果的科學可靠，這一點無論對于當前無菌檢查的一次性報告，還是對

38、于實驗室當前無菌檢查的一次性報告，還是對于實驗室認證認可、以及新的藥品注冊管理辦法的要求認證認可、以及新的藥品注冊管理辦法的要求都是相一致的。都是相一致的。為什么驗證為什么驗證 驗證的意義：保證檢驗結(jié)果的準確、可驗證的意義：保證檢驗結(jié)果的準確、可靠性及檢驗方法的完整性。靠性及檢驗方法的完整性。驗證什么驗證什么 微生物檢驗：微生物檢驗： 某種樣品某種樣品采用采用某種方法某種方法得到一個檢查結(jié)果。得到一個檢查結(jié)果。 供試品影響供試品影響 方法的有效性方法的有效性驗證什么驗證什么 驗證試驗方案的設(shè)計需滿足兩方面的要驗證試驗方案的設(shè)計需滿足兩方面的要求：一方面，樣品的預(yù)處理方式能有效求：一方面，樣品的

39、預(yù)處理方式能有效消除（或中和）樣品的抑菌性；另一方消除（或中和）樣品的抑菌性；另一方面，樣品的預(yù)處理方式和檢測過程以及面，樣品的預(yù)處理方式和檢測過程以及培養(yǎng)條件等均不會影響樣品中的微生物培養(yǎng)條件等均不會影響樣品中的微生物生長。生長。驗證驗證 藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與藥品微生物檢查方法驗證的一般程序與環(huán)節(jié)環(huán)節(jié)需前處理不需前處理去除抑菌作用有抑菌作用無抑菌作用樣品可以通過驗可以通過驗證實驗判斷證實驗判斷驗證抑菌活性去除的有驗證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出影響污染菌生長、檢出影響驗證前處理方法對污染菌生長、檢出影響驗證前處理方法對污染菌生長、檢出

40、影響樣品有抑菌作用無抑菌作用有抑菌作用去除抑菌作用驗證抑菌活性去除的有驗證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出影響污染菌生長、檢出影響去除抑菌作用樣品驗證抑菌活性去除的有驗證抑菌活性去除的有效性，以及去除方法對效性，以及去除方法對污染菌生長、檢出影響污染菌生長、檢出影響去除抑菌作用樣品不需前處理樣品需前處理不需前處理樣品需前處理不需前處理樣品需前處理不需前處理樣品無抑菌作用有抑菌作用需前處理不需前處理樣品無抑菌作用有抑菌作用需前處理不需前處理樣品需要驗證的重點環(huán)節(jié)需要驗證的重點環(huán)節(jié) 驗證實際上伴隨著整個實驗過程，實驗過程中驗證實際上伴隨著整個實驗過程，實驗過

41、程中的每一個環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗證），保的每一個環(huán)節(jié)均應(yīng)有合理的證明（驗證），保證其對結(jié)果判斷沒有影響。證其對結(jié)果判斷沒有影響。 前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，前處理方法直接影響后續(xù)步驟的效果和重現(xiàn)性，應(yīng)在驗證范圍內(nèi)。已有標準規(guī)程（應(yīng)在驗證范圍內(nèi)。已有標準規(guī)程（SOPSOP）和充）和充足實驗證明的前處理方法可以直接采用，但出足實驗證明的前處理方法可以直接采用，但出現(xiàn)疑問應(yīng)進一步研究提高。現(xiàn)疑問應(yīng)進一步研究提高。 供試品中抗菌活性的去除是當前驗證工作的重供試品中抗菌活性的去除是當前驗證工作的重點。尤其強調(diào)應(yīng)充分驗證供試品本身對微生物點。尤其強調(diào)應(yīng)充分驗證供試品本身對微生物生長的影

42、響。生長的影響。驗證的類型驗證的類型 前驗證前驗證: : 建立藥品的無菌檢查法時，需建立藥品的無菌檢查法時，需對供試品的抑細菌和抑真菌特性及無菌對供試品的抑細菌和抑真菌特性及無菌檢查方法的可靠性進行驗證檢查方法的可靠性進行驗證 再驗證再驗證: : 修訂的檢驗方法修訂的檢驗方法; ;供試品的組分供試品的組分或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)或原檢驗條件發(fā)生改變可能影響檢驗結(jié)果時，應(yīng)重新驗證；定期的方法驗證果時，應(yīng)重新驗證；定期的方法驗證. .供試品中抗菌活性的去除供試品中抗菌活性的去除 稀釋法：降低供試品的相對濃度稀釋法：降低供試品的相對濃度 薄膜法：利用體積差異分離薄膜法：利用體積差異分離 中

43、和法：利用化學（生物）專屬性滅活中和法：利用化學（生物）專屬性滅活 離心法：利用沉降系數(shù)差異分離離心法：利用沉降系數(shù)差異分離抗菌活性去除效果的檢驗抗菌活性去除效果的檢驗 應(yīng)根據(jù)供試品的特點，選擇敏感菌株，應(yīng)根據(jù)供試品的特點，選擇敏感菌株，對供試品抗菌活性去除效果加以檢驗再對供試品抗菌活性去除效果加以檢驗再按藥典要求全面驗證，提高效率。按藥典要求全面驗證，提高效率。選擇敏感菌株選擇敏感菌株 間接方法：文獻、技術(shù)資料（可靠）間接方法：文獻、技術(shù)資料（可靠） 直接方法：預(yù)實驗（個體抑菌實驗）直接方法：預(yù)實驗（個體抑菌實驗） 參考選擇：一般中藥選擇枯草和金黃；參考選擇：一般中藥選擇枯草和金黃；抗生素根

44、據(jù)抗菌譜選擇?？股馗鶕?jù)抗菌譜選擇。選擇適宜的方法選擇適宜的方法 可靠、穩(wěn)定、簡便可靠、穩(wěn)定、簡便 參考方法：參考方法： 在樣品許可的條件下在樣品許可的條件下 薄膜過濾，沖洗薄膜過濾，沖洗 什么時候不驗證什么時候不驗證 已經(jīng)驗證過的、體系中沒有變化因素的已經(jīng)驗證過的、體系中沒有變化因素的 不用驗證的不用驗證的 參照質(zhì)量體系中其他項目的執(zhí)行情況參照質(zhì)量體系中其他項目的執(zhí)行情況驗證以后怎么辦驗證以后怎么辦 按驗證確立的方法進行供試品的無菌檢按驗證確立的方法進行供試品的無菌檢查。查。 驗證資料的審查、復(fù)核與采納。驗證資料的審查、復(fù)核與采納。 方法驗證與無菌檢驗標準建設(shè)。方法驗證與無菌檢驗標準建設(shè)。結(jié)

45、果總結(jié)與報告結(jié)果總結(jié)與報告 綜合分析實驗中遇到的所有情況，最終綜合分析實驗中遇到的所有情況，最終形成一份詳細、嚴謹、具有可操作性的形成一份詳細、嚴謹、具有可操作性的驗證報告。驗證報告。 給出該品種的標準檢驗規(guī)程，以及各方給出該品種的標準檢驗規(guī)程，以及各方法操作的關(guān)鍵點，以供檢驗參考。法操作的關(guān)鍵點，以供檢驗參考。 方法驗證實驗報告方法驗證實驗報告標準的技術(shù)文件。標準的技術(shù)文件。下次見！無菌檢查方法的驗證無菌檢查方法的驗證 驗證的目的驗證的目的: : 在于確認（尋找）一種有效的檢驗方法，如在于確認（尋找）一種有效的檢驗方法，如果樣品（藥品）中有一定數(shù)量的微生物存在，那么采用此果樣品（藥品）中有一

46、定數(shù)量的微生物存在，那么采用此法可以使得樣品（藥品）中的微生物得以檢出。法可以使得樣品（藥品）中的微生物得以檢出。 驗證實驗驗證實驗 檢驗條件檢驗條件 檢驗方法檢驗方法 樣品量樣品量 檢驗規(guī)程檢驗規(guī)程 稀釋液種類及體積稀釋液種類及體積 SOPSOP 中和劑中和劑 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 培養(yǎng)時間培養(yǎng)時間 培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度影響無菌檢驗的因素影響無菌檢驗的因素 樣品樣品/ /藥品本身的特殊性藥品本身的特殊性 樣品樣品/ /藥品中添加的防腐藥品中添加的防腐/ /抑菌劑抑菌劑 培養(yǎng)基的特性培養(yǎng)基的特性 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 人員因素人員因素 驗證試驗可在供試品的無菌檢查之驗證試驗可在供試品的無菌檢查之前或與供試品的

47、無菌檢查同時進行。前或與供試品的無菌檢查同時進行。當同時進行時，若驗證試驗失敗，當同時進行時，若驗證試驗失敗，那么供試品的無菌檢查結(jié)果是不成那么供試品的無菌檢查結(jié)果是不成立的。立的。菌種的要求：不得超過菌種的要求：不得超過5 5代。采用適宜的方法保存。代。采用適宜的方法保存。l驗證用菌株：驗證用菌株：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢 桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。l選擇的原則選擇的原則: :代表性代表性, ,普遍性普遍性, ,易存活、低或非致病性易存活、低或非致病性, ,標標 準菌株準菌株( (或該藥品中常見的污

48、染菌或該藥品中常見的污染菌) )。菌液制備：同培養(yǎng)基靈敏度試驗方法菌液制備：同培養(yǎng)基靈敏度試驗方法加菌量加菌量: :100cfu100cfu。驗證方法：薄膜過濾法驗證方法：薄膜過濾法 將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖將規(guī)定量的供試品按薄膜過濾法過濾，沖洗，洗，在最后一次的沖洗液中加入小于在最后一次的沖洗液中加入小于100 100 cfucfu的試驗菌、過濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的試驗菌、過濾。取出濾膜接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另的培養(yǎng)基中，或?qū)⑴囵B(yǎng)基加至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入取一裝有同體積相同培養(yǎng)基的容器，加入等量的試驗菌，作為陽性對照，按規(guī)定溫等量

49、的試驗菌，作為陽性對照，按規(guī)定溫度培養(yǎng)度培養(yǎng)3 35 5天。各試驗菌同法操作。天。各試驗菌同法操作。 結(jié)果判斷：結(jié)果判斷： 與對照管比較，如含供試品各管中的試驗菌均生與對照管比較，如含供試品各管中的試驗菌均生長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無長良好，則供試品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用。按此法進行供試品的無菌檢查。抑菌作用。按此法進行供試品的無菌檢查。 如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢如含供試品的任一容器中微生物生長微弱、緩慢或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條或不生長，則說明供試品的該檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用。件下有抑菌作用。 可采用增加沖洗量，增加培養(yǎng)基

50、的用量，使用中可采用增加沖洗量，增加培養(yǎng)基的用量，使用中和劑或滅活劑；更換濾膜品種等方法消除供試品和劑或滅活劑；更換濾膜品種等方法消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法驗證。的抑菌作用，并重新進行方法驗證。無菌操作過無菌操作過程對消除抑菌有很大關(guān)系程對消除抑菌有很大關(guān)系各方法組合運用，效果更佳！各方法組合運用，效果更佳！ 樣品處理樣品處理 主要強調(diào)固體樣品的溶解、轉(zhuǎn)移、均勻分配問題。通常將主要強調(diào)固體樣品的溶解、轉(zhuǎn)移、均勻分配問題。通常將規(guī)定取樣量全部轉(zhuǎn)移到規(guī)定取樣量全部轉(zhuǎn)移到400400500ml500ml稀釋劑或者適宜溶液，稀釋劑或者適宜溶液，再進行分配。再進行分配。 沖洗方法沖洗方法 強調(diào)

51、少量多次：強調(diào)少量多次：50ml/50ml/次；次； 強調(diào)充分振搖；強調(diào)充分振搖； 操作細節(jié)的標準規(guī)范，如集菌儀轉(zhuǎn)速、沖洗過程中蓋還是不操作細節(jié)的標準規(guī)范，如集菌儀轉(zhuǎn)速、沖洗過程中蓋還是不蓋濾筒下口等等。蓋濾筒下口等等。 菌液加入菌液加入 菌液組、供試品加菌液組嚴格一致。菌液組、供試品加菌液組嚴格一致。 無菌檢查法驗證實驗要點無菌檢查法驗證實驗要點中和劑加入中和劑加入 不同中和劑加入方式可能效果不一樣。直接加入培養(yǎng)不同中和劑加入方式可能效果不一樣。直接加入培養(yǎng)基中效果最好。但如果某些中和劑對微生物生長不利可考基中效果最好。但如果某些中和劑對微生物生長不利可考慮其他步驟加入。慮其他步驟加入。菌液

52、加入菌液加入 按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，主要是考慮過濾器的有效性。而驗證實驗主要考慮濾膜考慮過濾器的有效性。而驗證實驗主要考慮濾膜/ /濾器殘濾器殘留抗菌物質(zhì)對陽性菌生長的影響，可以與對照濾筒比較而留抗菌物質(zhì)對陽性菌生長的影響，可以與對照濾筒比較而做出判斷，所以驗證實驗中加菌時機與方式只要與對照一做出判斷，所以驗證實驗中加菌時機與方式只要與對照一致即可。致即可。無菌檢查方法驗證無菌檢查方法驗證 通過驗證最終確定：樣品檢驗量，稀釋液類通過驗證最終確定：樣品檢驗量，稀釋液類型、用量及樣品濃度，薄膜過濾器類型，沖型、用量及樣品濃度，薄膜過濾

53、器類型，沖洗液類型及沖洗次數(shù)，酶的濃度、加酶量及洗液類型及沖洗次數(shù)，酶的濃度、加酶量及加酶方式，陽性對照菌，培養(yǎng)基生產(chǎn)單位、加酶方式，陽性對照菌，培養(yǎng)基生產(chǎn)單位、配制、消毒及用量，培養(yǎng)溫度與時間等。配制、消毒及用量，培養(yǎng)溫度與時間等。無菌檢查方法驗證無菌檢查方法驗證 為了考察檢驗方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗證時，至為了考察檢驗方法的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，驗證時，至少需準備少需準備3 3個不同批次的同類樣品，個不同批次的同類樣品，3 3名不同實驗人名不同實驗人員分別進行員分別進行3 3次驗證試驗。次驗證試驗。 一旦驗證合格，無菌檢查方法必須嚴格按照驗證合一旦驗證合格，無菌檢查方法必須嚴格按照驗證合格的程序

54、進行，涉及到培養(yǎng)基的生產(chǎn)單位、配制、格的程序進行，涉及到培養(yǎng)基的生產(chǎn)單位、配制、滅菌及用量，稀釋液、沖洗液的種類、配制、滅菌滅菌及用量，稀釋液、沖洗液的種類、配制、滅菌及用量，青霉素酶的濃度、加入量、加入方式，菌及用量，青霉素酶的濃度、加入量、加入方式，菌液制備及計數(shù)方式，集菌器的規(guī)格型號、生產(chǎn)單位，液制備及計數(shù)方式，集菌器的規(guī)格型號、生產(chǎn)單位，集菌儀，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間等均應(yīng)與驗證時所用集菌儀，培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)時間等均應(yīng)與驗證時所用的儀器設(shè)備及物料一致。的儀器設(shè)備及物料一致。驗證試驗應(yīng)注意的問題驗證試驗應(yīng)注意的問題 樣品的選擇（是否有抑菌性）樣品的選擇（是否有抑菌性） 樣品必須無菌合格樣品必須

55、無菌合格 供試液濃度的選擇（濃度不能太高）供試液濃度的選擇（濃度不能太高） 充分振蕩充分振蕩 試驗菌株測試的順序（先驗證敏感菌）試驗菌株測試的順序（先驗證敏感菌） 菌液的加法（最后一次沖洗液加入）菌液的加法（最后一次沖洗液加入） 培養(yǎng)基的用量培養(yǎng)基的用量 三次平行試驗三次平行試驗驗證試驗記錄驗證試驗記錄 總的要求：詳細、嚴謹、可操作性總的要求：詳細、嚴謹、可操作性 供試品信息供試品信息 檢驗數(shù)量和檢驗量：按照無菌檢查的量確定檢驗數(shù)量和檢驗量：按照無菌檢查的量確定 供試品處理、供試品溶液的制備供試品處理、供試品溶液的制備 檢驗方法（選擇直接接種法說明理由）檢驗方法（選擇直接接種法說明理由） 實驗

56、用菌：代數(shù)、稀釋級、計數(shù)實驗用菌：代數(shù)、稀釋級、計數(shù) 培養(yǎng)基信息培養(yǎng)基信息 檢驗條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次檢驗條件：主要是沖洗條件（沖洗液、沖洗次數(shù)、量，必要時說明濾膜材質(zhì)、儀器、泵速等數(shù)、量，必要時說明濾膜材質(zhì)、儀器、泵速等條件）。條件）。 需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說明需要中和、酶處理等特殊處理方法的需說明 逐日記錄各菌的生長情況逐日記錄各菌的生長情況驗證試驗結(jié)論驗證試驗結(jié)論 采用的方法：薄膜過濾法采用的方法：薄膜過濾法/ /直接接種法直接接種法 供試品檢驗量及處理、制備情況供試品檢驗量及處理、制備情況 關(guān)鍵實驗點：如沖洗條件、中和、酶處理等關(guān)鍵實驗點：如沖洗條件、中和、

57、酶處理等因素。因素。 陽性對照菌的選擇陽性對照菌的選擇 薄膜過濾法加菌的時機薄膜過濾法加菌的時機 按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，按規(guī)定應(yīng)在最后一次沖洗液中加入陽性菌液，而驗證試驗主要考慮濾膜而驗證試驗主要考慮濾膜/ /濾器殘留抗菌物質(zhì)濾器殘留抗菌物質(zhì)對陽性菌的生長的影響，可以與對照濾器比較對陽性菌的生長的影響，可以與對照濾器比較而作出判斷，所以驗證試驗中加菌時機與方式而作出判斷，所以驗證試驗中加菌時機與方式只要與對照一致即可。只要與對照一致即可。驗證及資料中常見的問題驗證及資料中常見的問題薄膜過濾法濾膜材質(zhì)選擇薄膜過濾法濾膜材質(zhì)選擇 普通濾膜普通濾膜 有機膜有機膜 低吸附濾膜低吸附濾

58、膜 1.1.根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。根據(jù)供試品及其溶劑的特性選擇濾膜材質(zhì)。 2.2.應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。 3.3.采用全封閉過濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某采用全封閉過濾器注意觀察膜的狀態(tài)，某些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供些油性供試品或采用蓖麻油等作為溶媒的供試品可以損傷普通濾膜。試品可以損傷普通濾膜。敏感菌株與陽性對照菌敏感菌株與陽性對照菌 陽性對照菌不是驗證試驗選定的敏感菌株陽性對照菌不是驗證試驗選定的敏感菌株 問題：降低了陽性對照菌的意義，實際工作中問題：降低了陽性對照菌的意義，實際工作中抑制枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），抑制

59、枯草芽孢桿菌的樣品很多（敏感菌株），但陽性對照只能選擇金黃色葡萄球菌。但陽性對照只能選擇金黃色葡萄球菌。稀釋液選擇的問題稀釋液選擇的問題 藥典附錄無菌檢查法規(guī)定的稀釋液和沖洗液只藥典附錄無菌檢查法規(guī)定的稀釋液和沖洗液只有有2 2種，即種，即0.1%0.1%蛋白胨水溶液和蛋白胨水溶液和PH7.0PH7.0氯化鈉氯化鈉- -蛋白胨緩沖液。但各藥品項下卻規(guī)定用蛋白胨緩沖液。但各藥品項下卻規(guī)定用0.9%0.9%的的氯化鈉溶液做為稀釋液，氯化鈉溶液做為稀釋液，采用經(jīng)驗證合格的適采用經(jīng)驗證合格的適宜的溶液作為稀釋劑、沖洗液。宜的溶液作為稀釋劑、沖洗液。 理論上使用理論上使用0.1%0.1%蛋白胨水溶液和蛋

60、白胨水溶液和PH7.0PH7.0氯化鈉氯化鈉- -蛋白胨緩沖液做為稀釋液和沖洗液效果更好，蛋白胨緩沖液做為稀釋液和沖洗液效果更好，因為這因為這2 2種溶液具有修復(fù)已損傷的微生物的作種溶液具有修復(fù)已損傷的微生物的作用，可以提高檢出率。用，可以提高檢出率。 薄膜過濾法和直接接種法薄膜過濾法和直接接種法 如：一般供試品（無特殊說明）采用直接接種法如：一般供試品（無特殊說明）采用直接接種法某廠家胸腺五肽注射液為普通注射劑，完全可以某廠家胸腺五肽注射液為普通注射劑，完全可以采用薄膜過濾法，生產(chǎn)單位進行的無菌檢查驗證采用薄膜過濾法，生產(chǎn)單位進行的無菌檢查驗證法為直接接種法。法為直接接種法。 也有的廠家把兩