常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗

1、l安全檢驗技術(shù)依據(jù)及原理l安全檢驗的內(nèi)容l常見病毒性產(chǎn)品安全檢驗的方法l安全檢驗的判定原則l安全檢驗注意事項l對人、畜環(huán)境安全是對各類獸用生物制品最基本的要求，獸用生物制品質(zhì)量標準規(guī)定：對于預防、治療等用途的不同類型的獸用生物制品必須進行安全檢驗。在根據(jù)獸用生物制品研究報告所制定的生物制品標準中，用一定的劑量和合適的途徑接種實驗動物（家兔、小鼠、豚鼠等）、雞胚或靶動物（牛、牦牛、山羊、綿羊、馬、犬、豬、雞、鴨、鵝等），經(jīng)過一定的觀察期，通過對被接種動物（或雞胚）局部或全身的評價，可以反映被接種產(chǎn)品的安全性。 l檢驗外源性病原污染：如致病性細菌污染或非致病性細菌數(shù)量過多檢驗外源性病原污染：如致病

2、性細菌污染或非致病性細菌數(shù)量過多（代謝產(chǎn)物影響安全）；外源病毒或支原體污染；活疫苗細胞培養(yǎng)（代謝產(chǎn)物影響安全）；外源病毒或支原體污染；活疫苗細胞培養(yǎng)時帶毒或培養(yǎng)用犢牛血清有其他病毒；原材料、環(huán)境及生產(chǎn)過程各時帶毒或培養(yǎng)用犢牛血清有其他病毒；原材料、環(huán)境及生產(chǎn)過程各個環(huán)節(jié)污染。個環(huán)節(jié)污染。l檢查病毒滅活情況檢查病毒滅活情況 ：對滅活疫苗而言。：對滅活疫苗而言。l檢查殘余毒力或毒性物質(zhì)：檢查殘余毒力或毒性物質(zhì)：主要對活疫苗而言。殘余毒力指生產(chǎn)制主要對活疫苗而言。殘余毒力指生產(chǎn)制品的菌毒株本身是活的減毒株或弱毒株，允許有輕微毒力的存在，品的菌毒株本身是活的減毒株或弱毒株，允許有輕微毒力的存在，能在接

3、種的機體內(nèi)表現(xiàn)出來。按制品的不同，這種殘余毒力的大小能在接種的機體內(nèi)表現(xiàn)出來。按制品的不同，這種殘余毒力的大小有不同的指標要求，測定和檢驗的方法也不同。有不同的指標要求，測定和檢驗的方法也不同。 l檢查對胚胎的毒性：如國外豬瘟的某些弱毒株，可通過孕豬的胎盤檢查對胚胎的毒性：如國外豬瘟的某些弱毒株，可通過孕豬的胎盤屏障傳給胚胎造成死胎、胎兒畸形或出生后發(fā)育不良等。如歐洲藥屏障傳給胚胎造成死胎、胎兒畸形或出生后發(fā)育不良等。如歐洲藥典明確規(guī)定豬瘟病毒應經(jīng)過對胚胎毒性的檢查。典明確規(guī)定豬瘟病毒應經(jīng)過對胚胎毒性的檢查。成品的安全檢驗方法主要是動物檢驗。根據(jù)產(chǎn)品的特點選用一定數(shù)目的規(guī)定動物（或雞胚），按指

4、定的接種途徑接種活疫苗，不能出現(xiàn)規(guī)定條件之外的不良反應和異常。動物的要求：敏感（一般無母源抗體）、健康、一定的品種、大小。安檢劑量應大于使用劑量。一般說來，活毒疫苗的安檢用劑量是使用劑量的10倍，滅活疫苗的安檢用劑量是使用劑量的2倍。凡能以小動物作出正確判斷者，則多用實驗小動物（材料易得，費用較低）。病毒類產(chǎn)品的安全檢驗方法主要有四種類型： 1、用本動物進行安全檢驗 2、用本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一進行安全檢驗 3、只用實驗動物進行安全檢驗 4、用本動物和實驗動物同時進行安全檢驗l用本動物進行安全檢驗（用本動物進行安全檢驗（1818種）種）：雞新城疫滅活疫苗、雞產(chǎn)蛋下降綜合：雞新城疫滅

5、活疫苗、雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗、雞傳染性鼻炎和雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、兔出血癥滅活疫征滅活疫苗、雞傳染性鼻炎和雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、兔出血癥滅活疫苗、雞痘活疫苗（苗、雞痘活疫苗（）、雞痘活疫苗（）、雞痘活疫苗（）、雞傳染性支氣管炎活疫苗）、雞傳染性支氣管炎活疫苗（H H120120、H H5252）、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞傳染性法氏囊中等毒力株）、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞傳染性法氏囊中等毒力株活疫苗（活疫苗（B B8787）、鴨溫活疫苗、小鵝瘟活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支）、鴨溫活疫苗、小鵝瘟活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、豬瘟活疫苗（氣管炎二聯(lián)活疫

6、苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、豬瘟活疫苗（）、偽）、偽狂犬活疫苗、山羊痘活疫苗、綿羊痘活疫苗?？袢钜呙纭⑸窖蚨换钜呙?、綿羊痘活疫苗。l本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一的安全檢驗（本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一的安全檢驗（3 3種）種）：雞馬立克：雞馬立克氏病活疫苗、雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗、雞新城疫低毒力活疫氏病活疫苗、雞馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗苗 。l只用實驗動物進行的安全檢驗（只用實驗動物進行的安全檢驗（3 3種）種）：牛瘟活疫苗（：牛瘟活疫苗（）、牛瘟活疫）、牛瘟活疫苗（苗（）、偽狂犬滅活疫苗）、偽狂犬滅活疫苗 。l用本動物和實驗動物同時進行的安全檢

7、驗（用本動物和實驗動物同時進行的安全檢驗（6 6種）種）：?？谔阋撸号？谔阋逴 O型滅活疫型滅活疫苗、口蹄疫苗、口蹄疫O O、A A型活疫苗、馬傳染性貧血活疫苗、豬口蹄疫型活疫苗、馬傳染性貧血活疫苗、豬口蹄疫O O型滅活疫型滅活疫苗、豬瘟活疫苗（苗、豬瘟活疫苗（）、豬瘟、豬丹毒和豬肺疫三聯(lián)活疫苗。）、豬瘟、豬丹毒和豬肺疫三聯(lián)活疫苗。l用本動物進行安全檢驗：用本動物進行安全檢驗：兔病毒性出血癥滅活疫苗的安全檢驗：用體重兔病毒性出血癥滅活疫苗的安全檢驗：用體重1.53kg1.53kg家家兔兔4 4只，每只皮下注射只，每只皮下注射4ml4ml，觀察，觀察7 7日，應全部健活。日，應全部健活。l本動物

8、或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一的安全檢驗：本動物或?qū)嶒瀯游铮ɑ螂u胚）任選其一的安全檢驗：馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫馬立克氏病火雞皰疹病毒活疫苗的安全檢驗，下列方法任擇其一：苗的安全檢驗，下列方法任擇其一：l1 1、用雞檢：選用、用雞檢：選用1-31-3日齡易感雛雞或日齡易感雛雞或SPFSPF雛雞雛雞2020只，其中只，其中1010只各肌肉或皮下注射疫只各肌肉或皮下注射疫苗苗0.2ml0.2ml（含（含1010個使用劑量），觀察個使用劑量），觀察1414日，對照組至少存活日，對照組至少存活8 8只，免疫組非特異死亡只，免疫組非特異死亡數(shù)不超過對照組，判疫苗合格。數(shù)不超過對照組，判疫苗合格。l2 2

9、、用雞胚檢：用、用雞胚檢：用1010日齡易感雞胚或日齡易感雞胚或SPFSPF雞胚雞胚1010只，每胚尿囊腔接種疫苗只，每胚尿囊腔接種疫苗0.1ml0.1ml（含（含1010個使用劑量），接種后個使用劑量），接種后24-6824-68小時內(nèi)雞胚非特異死亡不超過小時內(nèi)雞胚非特異死亡不超過20%20%，死亡雞胚尿囊液，死亡雞胚尿囊液對雞紅細胞凝集試驗應為陰性，對雞紅細胞凝集試驗應為陰性，120120小時收集活胚尿囊液混合，對雞紅細胞凝集試小時收集活胚尿囊液混合，對雞紅細胞凝集試驗應為陰性。驗應為陰性。l只用實驗動物進行的安全檢驗只用實驗動物進行的安全檢驗：牛瘟活疫苗牛瘟活疫苗()()的安全檢驗的安全

10、檢驗: :按瓶簽注明頭份，用按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋為生理鹽水稀釋為1ml1ml含含1 1個使用劑量，皮下注射小白鼠個使用劑量，皮下注射小白鼠5 5只，每只只，每只0.2ml0.2ml；肌肉注射豚；肌肉注射豚鼠鼠2 2只，每只只，每只1ml1ml。觀察。觀察1010日，均應健活。日，均應健活。l用本動物和實驗動物同時進行的安全檢驗用本動物和實驗動物同時進行的安全檢驗： 1 1、用體重、用體重350-450g350-450g的豚鼠的豚鼠2 2只，每只只，每只皮下注射疫苗皮下注射疫苗2ml2ml；用體重；用體重18-22g18-22g的小白鼠的小白鼠5 5只，每只皮下注射疫苗只，每只皮下注射

11、疫苗0.5ml0.5ml。連續(xù)觀。連續(xù)觀察察7 7日，均不得出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身反應。日，均不得出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡或明顯的局部不良反應或全身反應。2 2、用至少用至少6 6月齡的健康易感牛（細胞中和抗體滴度月齡的健康易感牛（細胞中和抗體滴度11：8 8，或乳鼠中和抗體滴度，或乳鼠中和抗體滴度11：4 4）3 3頭，每頭舌背面皮內(nèi)注射頭，每頭舌背面皮內(nèi)注射2020個點，每點個點，每點0.1ml0.1ml疫苗，逐日觀察至少疫苗，逐日觀察至少4 4日。之后，日。之后，每頭牛按推薦的接種途徑接種每頭牛按推薦的接種途徑接種3 3頭份疫苗，繼續(xù)逐日觀察頭份疫苗，繼續(xù)逐日

12、觀察6 6日。均不得出現(xiàn)口蹄疫癥日。均不得出現(xiàn)口蹄疫癥狀或明顯的因注射疫苗引起的毒性反應。狀或明顯的因注射疫苗引起的毒性反應。l l安檢期間死亡的動物經(jīng)解剖明確非制品所致者可以重檢，如結(jié)果可疑難以判斷時，應以加倍頭數(shù)的該種動物重檢。l凡規(guī)定用多種動物進行安檢的制品（如?？谔阋逴型滅活疫苗），每種動物均應安全合格。l用小動物檢驗不合格者，有的規(guī)定可用使用對象動物重檢。但用使用對象動物檢驗不合格者，不能再以小動物重檢。 l1.為保證檢驗的公正性，避免在對安全檢驗結(jié)果判定的主觀影響，因此應由2名檢驗員共同進行。l2.為防止污染，涉及疫苗稀釋等操作步驟，應當在無菌條件下進行。l3.動物飼養(yǎng)環(huán)境要符合動

13、物飼養(yǎng)和檢驗的要求，如果環(huán)境因素不穩(wěn)定，應當設置合適數(shù)量的同來源動物對照。l4.檢驗過程要注意對實驗動物進行定時觀察，發(fā)病時要增加觀察次數(shù)，對死亡動物要及時進行解剖。l5.安檢動物舍應當專用。并按強毒舍進行管理（如試驗結(jié)束后動物應按有關(guān)規(guī)定進行處理、動物舍和飼養(yǎng)器具應進行全面消毒。l6.如果檢驗結(jié)果可疑，難以判斷時，應以加倍動物數(shù)量重新檢驗。l7凡生產(chǎn)口蹄疫疫苗的生物制品企業(yè)，其生產(chǎn)的豬用活疫苗，均需用乳鼠進行安檢；凡使用豬瘟強毒或污染豬瘟強毒的生物制品企業(yè)，其生產(chǎn)的豬用活疫苗均用無豬瘟抗體的敏感豬進行安檢。（方法見規(guī)程2000版P20）l8.安全措施：（1）檢驗過程中應注意防止對檢驗人員和環(huán)

14、境的污染，檢驗人員必須穿戴工作服、口罩及相關(guān)的安全防護器具，撒在操作臺、地面的產(chǎn)品要進行消毒處理。檢驗完畢后開封的產(chǎn)品均要進行高壓滅菌處理。（2）發(fā)病或死亡動物、糞便及其污染物必須嚴格按照“防止散毒”等相關(guān)規(guī)定處理。（3）懷孕或手部有外傷的檢驗人員禁止解剖死亡動物（4）在檢驗過程中發(fā)生烈性傳染病或人員意外時，必須迅速通知有關(guān)部門采取緊急措施。 l效力檢驗的內(nèi)容效力檢驗的內(nèi)容l效力檢驗效力檢驗原理及原理及方法方法l效力檢驗應注意的問題效力檢驗應注意的問題l免疫原性：制備制品的毒種免疫原性應良好。制備疫苗的毒株必須要與流行株相對應，才能起到好的免疫效果。l制品的免疫持續(xù)期：理想的制品應具有較長的免

15、疫持續(xù)期，免疫持續(xù)期過短的制品應考慮增加免疫接種的次數(shù)。 l抗原的穩(wěn)定性：一般滅活苗的熱穩(wěn)定性較好，弱毒苗較差，但也可隨制品的種類而已。 l抗原量的測定：活疫苗的效力取決于接種動物的毒量，即一定量病毒才能在體內(nèi)增殖，促使機體產(chǎn)生免疫應答，若數(shù)量不夠，則達不到免疫效果。滅活苗同樣也需要一定的抗原量才有效。所以應測定制品的最小免疫量。但制品的抗原量并非越多越好，應適量，否則會出現(xiàn)副反應。l1、攻毒保護試驗原理：使用疫苗進行接種的最終目的是使接種過的動物獲得抵抗強毒病原感染的能力。因此，對靶動物或已經(jīng)建立的實驗動物模型進行接種后，用強毒病原進行人工攻毒，根據(jù)動物的保護情況判斷疫苗的效力，是用以檢驗疫

16、苗效力的最直觀方法。l2、攻毒保護試驗方法：按照疫苗的特點和使用對象選擇一定數(shù)目指定年齡（或體重）無特異性抗體的易感健康動物，按照規(guī)定的途徑和劑量給動物接種疫苗。除有特殊規(guī)定外，一般注苗34周后連同條件相同的對照動物用指定的強毒和毒量按要求進行攻毒。攻毒后在規(guī)定的時間內(nèi)觀察動物的健康狀況，不應出現(xiàn)規(guī)定以外的不良反應和異常。l3、采用攻毒保護試驗方法的常見疫苗如下（采用攻毒保護試驗方法的常見疫苗如下（17種）：種）： 雞新城疫滅活疫苗、雞傳染性鼻炎-雞新城疫二聯(lián)滅活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗、兔病毒性出血癥滅活疫苗、豬口蹄疫O型滅活疫苗、牛口蹄疫O型滅活疫苗、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞

17、傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌三聯(lián)活疫苗、偽狂犬活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、鴨瘟活疫苗。 注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。l?？谔阋逴型滅活疫苗效力檢驗：用至少6月齡的健康易感牛（細胞中和抗體滴度1：8，或乳鼠中和抗體滴度1：4）15頭，分為3組，每組5頭，將待檢疫苗分為1頭份、1/3頭份、1/9頭份3個劑量組，每一劑量組分別于頸部肌肉注射5頭牛。接種21天后，連同條件相同的對照牛2頭，每頭牛舌上表面兩側(cè)分兩點皮內(nèi)注射?？谔阋逴型病

18、毒強毒，每點0.1ml（共0.2ml，含10000ID50）。連續(xù)觀察10日。對照牛應至少3蹄出現(xiàn)水泡或潰瘍。免疫牛僅在舌面出現(xiàn)水泡或潰瘍，而其他部位無病變時判為保護，除舌面以外任一部位出現(xiàn)典型口蹄疫水泡或潰瘍判為不保護。根據(jù)免疫牛的保護數(shù)，按Reed-Muench法計算被檢疫苗的PD50，每頭份疫苗應至少含3 PD50。l1、病毒含量測定原理：病毒含量的高低直接反映了產(chǎn)品的質(zhì)量。因此用動物（雞胚、細胞培養(yǎng)物）接種測定病毒性活制品的病毒含量可作為評定效力高低的依據(jù)。l2、病毒含量測定方法：每批疫苗按瓶簽注明的頭份用指定的稀釋液作適當稀釋后，通常選擇三個最佳稀釋液，按規(guī)定的途徑和劑量接種一定數(shù)目

19、指定的實驗動物（細胞、雞胚），在規(guī)定的時間內(nèi)觀察，根據(jù)動物（細胞、雞胚）對疫苗的反應情況來計算疫苗的LD5O（ TCID50 、ELD50、PD50、EID5O）或蝕班數(shù)（PFU），以此來判定疫苗的效力。 l3、病毒含量測定常見疫苗（12種）： 口蹄疫O、A型活疫苗、山羊活疫苗、雞傳染性喉氣管炎活疫苗、雞傳染性法氏囊病中等毒力株活疫苗、雞傳染性支氣管炎活疫苗、雞新城疫中等毒力活疫苗、雞新城疫低毒力活疫苗、雞新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、雞痘活疫苗（）、小鵝瘟活疫苗、雞馬立克氏病活疫苗、雞馬力克氏病火雞皰疹病毒活疫苗。l注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。l口蹄疫O、A型活

20、疫苗單價苗的效力檢驗：將疫苗用PBS做10倍系列稀釋，O型苗以10-5、10-6、10-7三個個稀釋度，A型苗以10-6、10-7、10-83個稀釋度，各皮下接種34日齡乳鼠4只，每只0.1ml，觀察4-5日，根據(jù)乳鼠發(fā)病死亡數(shù)計算LD50，每0.1ml O型苗105.5 LD50， A型苗106.5LD50，判為合格。l 山羊痘活疫苗效力檢驗方法之一：按瓶簽注明頭份，用生理鹽水稀釋測其毒價，每頭份病毒含量應103.5 TCID50。l1、血清學試驗原理：根據(jù)相關(guān)血清學檢驗的原理，檢驗抗體水平和抗原活性，從而評定產(chǎn)品的效力。病毒性產(chǎn)品主要采用以下兩種：l（1）抗體效價測定：動物體的免疫系統(tǒng)能夠

21、對進入體內(nèi)的外源物質(zhì)進行吸收、加工處理和遞呈，使有關(guān)淋巴細胞活化并產(chǎn)生特異性抗體。在部分疾病的免疫防治中，以這種體液免疫機制為主，其特異性抗體水平與攻毒保護率之間有一定平行關(guān)系。在這種情況下，對本動物或已經(jīng)建立的實驗動物模型進行接種后，通過適宜的血清學試驗檢測動物的抗體水平，可以作為判斷疫苗效力高低的有效方法。l2）中和試驗：病毒與適量抗體完全中和后，接種敏感動物或細胞，可不受侵害而獲得保護。如果用一定抗原分別與系列稀釋的抗體（血清）中和，可得到使50%動物或細胞獲得保護的最高血清稀釋度，即血清的中和效價進而評價某疫苗（抗原）的效價或試驗動物的相關(guān)抗體是否符合規(guī)定。l2、血清學試驗方法：血清學

22、相關(guān)方法，如紅細胞凝集抑制試驗、中和試驗、補體結(jié)合試驗等。l抗體效價測定 ：主要有雞產(chǎn)蛋下降綜合征滅活疫苗（HI抗體測定）、馬傳染性貧血活疫苗（補體結(jié)合試驗和瓊脂擴散試驗）。l中和試驗法：雞新城疫-雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗、小鵝瘟活疫苗、偽狂犬病滅活疫苗。注：紅色字體疫苗表示可采用此方法，也可采用其他方法。l雞產(chǎn)蛋下降綜合癥效力檢驗：用3-6周齡的健康易感雞（HI抗體1：4）10只，每只肌肉或皮下注射疫苗0.5ml, 另取10只雞飼養(yǎng)不免疫；3-5周后采血，測定HI抗體，免疫雞HIHI抗體抗體幾何平均滴度1：128，對照雞抗體HI抗體效價應1：4。l小鵝瘟活疫苗效力檢驗方法之一；取健康成年鵝4只，分別采血1ml,分離血清并混合備用。然后注射1個使用劑量的疫苗，每只鵝1ml，21-28日后采血，分離血清混合，將接種疫苗前后的2次血清分別與小鵝瘟GD株在鴨胚中作中和試驗中和試驗。兩次ELD50值之差2對數(shù)值為合格。l熱型反應和發(fā)病觀察：某些疫苗以適當劑量及途徑接種實驗動物（本動物、雞胚）后，可產(chǎn)生典型的熱型反應或特征癥狀及病理變化，借以判定疫苗的效力。 主要產(chǎn)品如下：山羊活疫苗、綿羊痘活疫苗、牛瘟活疫苗（）、牛瘟活疫苗（）、豬瘟活疫苗(I)、豬瘟活疫苗（II）、雞痘活疫苗（）、雞痘活疫苗（）。注：紅色字體疫苗表示可采用此方