高效液相色譜分析

1、整理pptLOGO整理ppt2基本概念與特點(diǎn)基本概念與特點(diǎn) 概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀(jì)60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線(xiàn)檢測(cè)器，從而發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)。隨著科學(xué)和技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為重要、廣泛的分離分析手段. 特點(diǎn)特點(diǎn)：分離效率高、：分離效率高、分析速度快分析速度快、應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)操作自動(dòng)化化。整理ppt3液相色譜流程與原理液相色譜流程與原理 基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分由于在流動(dòng)相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用力的不同，隨流

2、動(dòng)相在色譜柱中運(yùn)行時(shí)，在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配過(guò)程，使得原來(lái)分配系數(shù)具有微小區(qū)別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進(jìn)而各組分在柱中的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過(guò)一定長(zhǎng)度的色譜柱，彼此分離開(kāi)來(lái)，最后按一定順序流出。整理ppt4色譜圖及相關(guān)名詞色譜圖及相關(guān)名詞（一）色譜流出曲線(xiàn)色譜圖 色譜圖色譜圖是色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或液體流出體積的曲線(xiàn) 。 色譜流出曲線(xiàn)色譜流出曲線(xiàn)是色譜基本參數(shù)的源流，而色譜基本參數(shù)又是用來(lái)觀察色譜行為和研究色譜理論的重要指標(biāo)。另外，還可以直接利用色譜圖峰位置點(diǎn)（特征保留值）進(jìn)行定性，根據(jù)曲線(xiàn)上測(cè)得的峰高或峰面積進(jìn)行定量。整理ppt5（二）柱效能 色譜柱在色

3、譜分離中由動(dòng)力學(xué)因素所決定的柱效能，通常用塔板高度或塔板數(shù)表示。 塔板數(shù)：塔板數(shù)： 塔板高度：塔板高度：渦流擴(kuò)散相渦流擴(kuò)散相分子擴(kuò)散相分子擴(kuò)散相流動(dòng)相線(xiàn)速度流動(dòng)相線(xiàn)速度傳質(zhì)阻力相傳質(zhì)阻力相整理ppt6（三）分離度R分離度的表達(dá)式：分離度的表達(dá)式：(2)(1)(2)(1)(2)(1)1/2(2)1/2(1)2()2()1.699()RRbbRRttRWWttYY tR(2), tR(1): 組分組分2和組分和組分1的保留時(shí)間的保留時(shí)間Wb(2), Wb(1): 組分組分2和組分和組分1的峰底寬度的峰底寬度整理ppt7R=1.5完全分離完全分離整理ppt8高效液相色譜系統(tǒng)高效液相色譜系統(tǒng)（一） 高

4、效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程高壓泵高壓泵色譜柱色譜柱廢液廢液檢測(cè)器檢測(cè)器進(jìn)樣器進(jìn)樣器儲(chǔ)液瓶?jī)?chǔ)液瓶高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測(cè)器高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測(cè)器整理ppt9（二）（二） 高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵） 高壓輸液泵是核心部件，要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等。 高壓泵主要有恒流泵（往復(fù)泵）和恒壓泵（氣動(dòng)泵）兩種。 恒流泵特點(diǎn)輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)。分為機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵(常用)兩種。 恒壓泵特點(diǎn)能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。 整理ppt10電動(dòng)機(jī) 偏

5、心輪 柱塞柱 球形單向閥 溶劑圖10-7 柱塞往復(fù)泵示意圖整理ppt11（三）色譜柱（三）色譜柱 色譜柱是高效液相色譜分離過(guò)程的核心。一支穩(wěn)定、高效的色譜柱對(duì)建立適用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的分析方法是必不可少的。 1.擔(dān)體 高效液相色譜的柱填料有離子交換樹(shù)脂、凝膠，較多的使用硅膠微粒作為擔(dān)體。以下為幾種常用的微粒類(lèi)型： (1) (1) 全多孔型擔(dān)體：全多孔型擔(dān)體：屬于顆粒均勻的多孔球體，很好的兼顧了效能、樣品荷載量、耐久性等理想的性質(zhì)，所以最為常用。 (2) (2) 表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）：表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）： 它是直徑為 30 40 m 的實(shí)心核 ( 玻璃微珠 ) ，優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)

6、是：是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易于填充均勻，柱效高。這種擔(dān)體目前應(yīng)用較為普遍。整理ppt122.色譜柱色譜柱 柱體為直型不銹鋼管，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)經(jīng)為4.6或3.9 mm，柱長(zhǎng)1530 cm，填料顆粒粒度510m。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度(35m)和柱經(jīng)以提高柱效。 為保護(hù)色譜柱，為保護(hù)色譜柱，通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護(hù)柱。通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護(hù)柱。 整理ppt133.固定相固定相選擇固定相的一般標(biāo)準(zhǔn)還是以“相似相容”原理為基礎(chǔ)。 如果溶質(zhì)溶于烴類(lèi)溶劑，表明是低極性化合物，這樣就可以選擇非極性或亞極性固定相。 若樣品溶于極性溫和溶劑中，如醇類(lèi)，則可選擇極

7、性固定相，也可以選擇非極性固定相。整理ppt144.流動(dòng)相流動(dòng)相 液相色譜的流動(dòng)相又稱(chēng)為淋洗液，洗脫劑。液相色譜的流動(dòng)相又稱(chēng)為淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，流動(dòng)相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，改變流動(dòng)相的組成和極性（組成比例）是提高分離改變流動(dòng)相的組成和極性（組成比例）是提高分離度的有效手段度的有效手段。常用溶劑：常用溶劑： 環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇乙酯、甲醇 、乙腈、水等。、乙腈、水等。整理ppt15正相液相色譜正相液相色譜（正相柱）（正相柱）固定相極性固定相極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性反相液相色譜

8、反相液相色譜（反相柱）（反相柱）固定相極性固定相極性 流動(dòng)相極性流動(dòng)相極性組分極性越大，保留組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)；使用極性時(shí)間越長(zhǎng)；使用極性化合物的分離。化合物的分離。組分極性越小，保留組分極性越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)；適用非極時(shí)間越長(zhǎng)；適用非極性化合物的分離。性化合物的分離。整理ppt16 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題1 1、盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)、盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。2 2、避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或、避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損

9、壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。氧化鋁固定相等。整理ppt173 3、試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止、試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。4 4、流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用、流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。整理ppt18（四）檢測(cè)器（四）檢測(cè)器（一）、紫外檢測(cè)器（一）、紫外檢測(cè)器應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器基本原理：基本原理：試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光具有選擇試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外

10、光具有選擇性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系符合郎伯符合郎伯- -比耳定律。比耳定律。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，線(xiàn)形范圍寬；靈敏度高，線(xiàn)形范圍寬；死體積小；死體積??；波長(zhǎng)可選；波長(zhǎng)可選；對(duì)流速和溫度變化不對(duì)流速和溫度變化不 敏感；敏感；可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：無(wú)紫外無(wú)紫外- -可見(jiàn)吸收組分不響應(yīng)；可見(jiàn)吸收組分不響應(yīng)；流動(dòng)相選擇受一定限制。流動(dòng)相選擇受一定限制。整理ppt19(a) 可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(b) 二極管陣列檢測(cè)器二極管陣列檢測(cè)器整理ppt20（二）、示差折光檢測(cè)器（二）、示差折光檢測(cè)器通用型檢測(cè)器

11、通用型檢測(cè)器每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)?；驹恚夯驹恚哼B續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動(dòng)相中的組分濃的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動(dòng)相中的組分濃度成正比。度成正比。 生命科學(xué)中各類(lèi)糖類(lèi)化合物，沒(méi)有紫外吸收，生命科學(xué)中各類(lèi)糖類(lèi)化合物，沒(méi)有紫外吸收，一般要用示差折光檢測(cè)器。一般要用示差折光檢測(cè)器。 整理ppt21 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：靈敏度低；靈敏度低；對(duì)溫度敏感；對(duì)溫度敏感；不能用于梯度洗脫。不能用于梯度洗脫。整理ppt22（三）、熒光檢測(cè)器（三）、熒光檢測(cè)器專(zhuān)用型檢測(cè)器專(zhuān)用型檢測(cè)器基本原理：基本原理：在一

12、定的條件下，熒光強(qiáng)度與流動(dòng)相中在一定的條件下，熒光強(qiáng)度與流動(dòng)相中的組分的濃度成之比。的組分的濃度成之比。 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B B、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、黃曲霉素、卟啉類(lèi)化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)。農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類(lèi)化合物等有響應(yīng)。整理ppt23 特點(diǎn)：特點(diǎn)： 高靈敏度；高靈敏度； 高選擇性；高選擇性； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵摗Ｕ韕pt24定性與定量定性與定量（一）樣品預(yù)處理 1.固體樣品 固體樣品首先要進(jìn)行均質(zhì)化，然后再采用如蒸餾、超臨界萃取或超聲波萃取等技術(shù)進(jìn)行樣品制備。 2.液體樣品 （二）定性與定量 參閱氣相色譜的定性與定量方法。

13、液-液萃取固相萃取凝膠過(guò)濾色譜整理ppt25氣相色譜與高效液相色譜的比較氣相色譜與高效液相色譜的比較氣相色譜氣相色譜 高效液相色譜高效液相色譜1.1.只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析 20%20%的化合物的化合物2.2.不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析3.3.用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效用毛細(xì)管色譜可得到很高的柱效4.4.有很靈敏的檢測(cè)器如有很靈敏的檢測(cè)器如ECDECD和較靈和較靈敏的通用檢測(cè)器（敏的通用檢測(cè)器（FIDFID和和TCDTCD）5.5.流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒，易于處理流動(dòng)相為氣體，無(wú)毒，易于處理 6.6.運(yùn)行和操作容易運(yùn)行和操作容易 7.7.儀器制造難度較小儀器制造難度較小1.1.幾乎可以分析各種物質(zhì)幾乎可以分析各