高速逆流色譜

1、高速逆流色譜高速逆流色譜High Speed Counter Current Chromatography一一 高速逆流色譜技術(shù)簡介高速逆流色譜技術(shù)簡介 逆流色譜逆流色譜是利用溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中的分配系數(shù)不同，應(yīng)用色譜層析的方法，將不同溶質(zhì)分離。逆流色譜的發(fā)展從逆流分配、液滴逆流色譜直至現(xiàn)在的高速逆流色譜，經(jīng)歷了近60 年的歷程，技術(shù)和設(shè)備均已日益成熟，現(xiàn)越來越多地應(yīng)用于中藥及天然藥物的研究開發(fā)。正相色譜:硅膠、氧化鋁等吸附劑固定相反相色譜：鍵合固定相，ODS凝膠過濾色譜：多孔凝膠離子交換色譜：離子交換劑薄層色譜：硅膠、氧化鋁 逆流色譜:兩個互不混溶的溶劑逆向流動,樣品在兩相之間分配,

2、利用組分在兩相分配差異進(jìn)行分離。 逆流色譜優(yōu)點(diǎn)：n（1）不存在樣品的不可逆吸附；樣品定量回收n（2）極大地抑制了樣品的變性，樣品不會遭到破壞1 逆流色譜原理及發(fā)展過程 分配定律：Nernst, 1891 年 K= Cs/Cm 分配系數(shù)=溶質(zhì)在固定相中濃度/溶質(zhì)的流動相中濃度 兩組分分配系數(shù)相差較大：一次萃取可得到分離 較?。憾啻屋腿∪秉c(diǎn)：多極萃取設(shè)備龐大復(fù)雜、易碎、溶劑體系容易乳化，溶劑耗量大，分離時(shí)間長。 逆流色譜是20世紀(jì)50年代源于多極萃取技術(shù)（非連續(xù)性）逆流分配的行列中一個獨(dú)立單元的示意圖發(fā)展歷史10001000支管的自動分配行列在CraigCraig機(jī)器中500500支管轉(zhuǎn)移后分配系

3、數(shù)從0.10.1到10 10的溶質(zhì)的理論分布曲線旋轉(zhuǎn)腔室逆流色譜回旋腔室逆流色譜螺旋管柱逆流色譜儀 1981年，日本的Yoichiro Ito先生，在NIH，Bethesda, Maryland, USA, 在旋轉(zhuǎn)聚四氟乙烯螺旋管離心法基礎(chǔ)上研制了一種新型的逆流色譜儀器。 同步行星式運(yùn)動特點(diǎn)：（1） 基于流體動力學(xué)原理（Hydrodynamic equilibrium system，HDES）（2） 通過公轉(zhuǎn)、自轉(zhuǎn)（同步行星式運(yùn)動）產(chǎn)生的二維力場，保留兩相中的其中一相作為固定相（3）通過高速旋轉(zhuǎn)提高兩相溶劑的萃取頻率，1000rpm旋轉(zhuǎn)時(shí)可達(dá)到17次/s頻率的萃取過程。a a 多層盤繞管；多層

4、盤繞管；b b 平衡物平衡物上海同田生物 TBE300BAKTA Prime 技術(shù)參數(shù)技術(shù)參數(shù) 電 源： 220V 20V 50 0.5HZ 主機(jī)功率： 200 W 主機(jī)容量: 260ml 進(jìn)樣體積:20ml 主機(jī)尺寸：563638368mm轉(zhuǎn)速范圍：0-1000 轉(zhuǎn)/分 分離轉(zhuǎn)速：700-1000 轉(zhuǎn)/分（無級變頻調(diào)速）流速范圍:0.1-30ml/min 分離流速：2.0-4.0ml/min；壓力:0-2MPa 紫外檢測器波長：使用汞燈 - 濾光片選擇 254 、 280nm ( 標(biāo)配 ) 多種濾光片可選： 313 、 365 、 405 、 436 、 546nm( 選購 ) 溫控模塊（接

5、循環(huán)水?。簻囟日{(diào)控范圍 15 40 ，精度 0.5 ，溫控循環(huán)液量 1 10 L /min 2 高速逆流色譜原理 利用螺旋柱在行星運(yùn)動時(shí)產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時(shí)保留其中的一相，利用恒流泵連續(xù)輸入另一相，溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的次序，被依次洗脫。 高速逆流色譜是利用螺旋柱在行星運(yùn)動時(shí)產(chǎn)生的離心力，使互不相溶的兩相不斷混合，同時(shí)保留其中的一相（固定相），利用恒流泵連續(xù)輸入另一相（流動相），隨流動相進(jìn)入螺旋柱的溶質(zhì)在兩相之間反復(fù)分配，按分配系數(shù)的次序，被依次洗脫。在流動相中分配比例大的先被洗脫，反之，在固定相中分配比例大的后被洗脫。圖 1 是螺旋柱中互不相溶的兩相溶

6、劑在行星運(yùn)動時(shí)的流體動力學(xué)運(yùn)動及分配示意圖。上圖，在達(dá)到穩(wěn)定的流體動力學(xué)平衡態(tài)后，柱中呈現(xiàn)兩個截然不同的區(qū)域：在靠近離心軸心大約有四分之一的區(qū)域（混合區(qū)）呈現(xiàn)兩相的激烈混合。其余區(qū)域（靜置區(qū)）兩溶劑相分成兩層：較重的溶劑相在外部，而較輕的溶劑相在內(nèi)部，兩相形成一個線狀分界面。下圖，I 到IV 的展開柱，分別與上圖中I 到IV 位置相對應(yīng)，每一混合區(qū)以跟柱旋轉(zhuǎn)速度相同的速度向柱頭端移動（與海面波的運(yùn)動相似）。螺旋柱中兩溶劑相流體動力學(xué)運(yùn)動及分配n在螺旋柱中任何一部分，兩相溶劑都在反復(fù)進(jìn)行混合和靜置的分配過程，這一過程頻率極高，當(dāng)柱以800rpm 旋轉(zhuǎn)時(shí)，頻率超過13 次/秒，流動相則不斷地穿過固

7、定相。所以高速逆流色譜在一個較寬的流動相流速范圍內(nèi)，仍有相當(dāng)高的分配效率。 最初的HSCCC只有一個分離柱，用配重平衡離心體系。最近的儀器在設(shè)計(jì)上有較大突破多個分離柱：不用配重，性能和實(shí)用能力大大提高。 分析型和半制備、制備型三大系列。 制備型HSCCC，柱容積可達(dá)1000,5000 mL，一次最多進(jìn)樣可達(dá)幾十克粗品。優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)（與（與HPLC等液等液- -固色譜技術(shù)比較固色譜技術(shù)比較) )優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)分離原理不同：互補(bǔ)性強(qiáng)分離原理不同：互補(bǔ)性強(qiáng)無需固體作固定相無需固體作固定相 ：不存在固體對樣品組分的吸附、不存在固體對樣品組分的吸附、玷污、變性、失活、拖尾等現(xiàn)象，玷污、變性、失活、拖尾等現(xiàn)象，

8、能實(shí)現(xiàn)很高的回收能實(shí)現(xiàn)很高的回收率，率，節(jié)省昂貴的材料消耗和溶劑消耗（節(jié)省昂貴的材料消耗和溶劑消耗（HPLC的的1/10以下），運(yùn)行使用的后續(xù)投入較低以下），運(yùn)行使用的后續(xù)投入較低 溶劑極性可調(diào)：無需更換不同極性的色譜柱即可實(shí)現(xiàn)流溶劑極性可調(diào)：無需更換不同極性的色譜柱即可實(shí)現(xiàn)流動相從弱極性到強(qiáng)極性或相反的轉(zhuǎn)化動相從弱極性到強(qiáng)極性或相反的轉(zhuǎn)化 色譜柱無填料，柱內(nèi)空間全部是有效空間，容積大：樣色譜柱無填料，柱內(nèi)空間全部是有效空間，容積大：樣品負(fù)載能力強(qiáng)，制備量大，重現(xiàn)性好品負(fù)載能力強(qiáng)，制備量大，重現(xiàn)性好盤管總體積盤管總體積100mL， 一次分離量：一次分離量：0.5-2克克盤管總體積盤管總體積30

9、00mL，一次分離量：，一次分離量：15-60克克缺點(diǎn)缺點(diǎn) 分離效率（理論塔板數(shù)）還不高（分離效率（理論塔板數(shù)）還不高（ 1000) ) N=5.54(tN=5.54(tR R/W/W1/21/2) )2 2一次一次分離所需時(shí)間還較長（以小時(shí)計(jì)）分離所需時(shí)間還較長（以小時(shí)計(jì)） 基本原理以及溶劑系統(tǒng)選擇等還不完善基本原理以及溶劑系統(tǒng)選擇等還不完善相應(yīng)的配套檢測器還不夠完善（溶劑干擾）相應(yīng)的配套檢測器還不夠完善（溶劑干擾）分離后樣品的純度還需分離后樣品的純度還需HPLC等方法測定等方法測定混合溶劑的回收混合溶劑的回收高速逆流色譜應(yīng)用：1.旋轉(zhuǎn)速度 在逆流色譜中，留在柱中固定相的量是影響溶質(zhì)峰分離度

10、的一個重要因素，一般說來，高保留量會大大改進(jìn)峰分離度。研究表明，螺旋柱的旋轉(zhuǎn)速度對兩相溶劑在流體動力學(xué)平衡時(shí)的體積比影響很大。圖2 為旋轉(zhuǎn)速度與兩相在柱中的保留率的相關(guān)曲線。2. 溶劑體系選擇 要用逆流色譜系統(tǒng)進(jìn)行成功分離，選擇適宜的溶劑系統(tǒng)非常重要。好的溶劑系統(tǒng)至少具備兩個條件：a) 溶劑可分層。這是最基本的要求，分層的兩相（比重輕的為上相，重的為下相），一相為固定相，另一相為流動相。b) 被分離物質(zhì)的分配系數(shù)（K）范圍在0.5-2。K=Cu/CL，Cu是上相中溶質(zhì)濃度，CL是下相中溶質(zhì)濃度。K0.5 會導(dǎo)致峰分離度的下降，而K2，會使保留時(shí)間太長，樣品峰過寬。n 表 1 中列舉了常用的溶劑

11、系統(tǒng)。查找溶劑系統(tǒng)可以從左邊所示的氯仿溶劑系統(tǒng)開始，當(dāng)氯仿/甲醇/水（2:1:1）溶劑系統(tǒng)的分配系數(shù)K 在0.2和之間5 時(shí)，通過進(jìn)一步調(diào)整每個成分的比例、用乙酸代替甲醇和/或用四氯化碳（或二氯甲烷）部分代替氯仿，可以獲得期望的K 值。如果樣品非常不均勻地進(jìn)入其中一相，氯仿溶劑系統(tǒng)不適合，必須查找具有更廣疏水性和極性的溶劑系統(tǒng)，如表右邊所列。 當(dāng)樣品大部分進(jìn)入氯仿溶劑系統(tǒng)的非水下相，應(yīng)該用正乙烷/乙酸乙酯/水（1:1:1:1）這個疏水性稍強(qiáng)一些的溶劑系統(tǒng)，表中以向上的剪頭標(biāo)明。如果樣品仍然大部分進(jìn)入非水上相，應(yīng)該進(jìn)一步向上查找，如果樣品更多的集中在下相水相，則向下查找。如果已經(jīng)到了頂部溶劑系統(tǒng)

12、正乙烷/甲醇/水（2:1:1），仍然顯示需要更強(qiáng)疏水性的系統(tǒng)，可以減少水量和/或用乙醇代替甲醇進(jìn)一步調(diào)整溶劑的成分。 另一方面，如果樣品大部分進(jìn)入氯仿系統(tǒng)的上相，應(yīng)該向相反的方向查找，向下的剪頭指向極性溶劑系統(tǒng)。如果極性最大的溶劑系統(tǒng)正丁醇/水（表底）中樣品仍大部分進(jìn)入底水相，可以增加少量某種酸和/或鹽來調(diào)整丁醇溶劑系統(tǒng)。溶劑選擇溶劑選擇在高速在高速逆流色譜中的重要性逆流色譜中的重要性分離度分離度Rs: 2(tR2- tR1)/W1+W2提高分離度的方法提高分離度的方法CCC &CPC: (tR2- tR1) , HPLC: W1+W2 溶劑系統(tǒng)溶劑系統(tǒng)的選擇與優(yōu)化的選擇與優(yōu)化步驟步驟1:采用

13、采用簡單的梯度洗脫系統(tǒng)如水簡單的梯度洗脫系統(tǒng)如水-乙腈乙腈（100:00:100）用用HPLC對樣品進(jìn)行極性掃描分析對樣品進(jìn)行極性掃描分析 ，得到樣品的，得到樣品的極性范極性范圍圍步驟步驟2:溶劑系統(tǒng)溶劑系統(tǒng)的優(yōu)化的優(yōu)化區(qū)域區(qū)域 化合物化合物極性極性 溶劑系統(tǒng)溶劑系統(tǒng) A 強(qiáng)強(qiáng)極性極性 正己烷正己烷/ /正丁醇正丁醇/ /甲醇甲醇/ /水水 B 中中極性極性 正己烷正己烷/ /乙酸乙酯乙酸乙酯/ /甲醇甲醇/ /水水 C 非非極性極性 正己烷正己烷/ /乙腈乙腈步驟步驟3:溶劑比例溶劑比例的優(yōu)化的優(yōu)化 一次只改變一種一次只改變一種溶劑的量溶劑的量取少量樣品在試管中進(jìn)行分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)取少量樣品在試

14、管中進(jìn)行分配系數(shù)實(shí)驗(yàn)TLC或或HPLC測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果分離方法建立步驟：1. 根據(jù)化合物極性、溶解性特點(diǎn)，結(jié)合同類型化合物研究文獻(xiàn)，確定備選溶劑系統(tǒng)。2. 建立目標(biāo)化合物的TLC、HPLC分析條件。3. 由所建立的HPLC分析條件準(zhǔn)確測定各目標(biāo)化合物的分配系數(shù)。4. 由分配系數(shù)估算相應(yīng)保留時(shí)間，分離度及峰寬等色譜參數(shù)。5. 選擇性的選取溶劑系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)試。6. 優(yōu)化預(yù)試條件，確立最佳條件。HPLC法測定分配系數(shù)的理論基礎(chǔ)上海同田生化推薦 在實(shí)驗(yàn)之前，先通過文獻(xiàn)等各種渠道了解待分離物質(zhì)的理化性質(zhì)。常規(guī)手段比較難分離的物質(zhì)的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)差異，通常都會通過結(jié)構(gòu)式了解結(jié)構(gòu)差異，推測分離時(shí)可能會需要

15、用什么試劑才能達(dá)到分離。例如： 可能會形成分子內(nèi)羥基的可使用丙酮；含有羥基的可使用甲醇、乙醇等。 一般在了解化合物的性質(zhì)后通常由三類體系來分離：弱極性體系，中等極性體系，親水性體系。弱極性體系，中等極性體系，親水性體系。 弱極性體系：一般指適合分離較容易溶于己烷、石油醚、乙醚、四氯化碳等，也溶于甲醇、乙醇的物質(zhì)的溶劑體系。通常選用的溶劑條件為：正己烷乙酸乙酯甲醇水；正己烷甲醇水；正己烷乙醇水；四氯化碳甲醇水；正己烷甲醇；正己烷乙腈乙酸乙脂/二氯甲烷等。弱極性體系溶劑條件篩選模型： n中等極性：一般指適合分離較容易溶于氯仿、乙酸乙酯、丙醇、丁醇，也溶于甲醇、乙醇的物質(zhì)的溶劑體系。通常選用的溶劑條

16、件：正己烷乙酸乙酯甲醇水；正己烷乙酸乙酯乙醇水；氯仿甲醇水；氯仿甲醇丁醇水。中等極性體系溶劑條件篩選模型： n親水性體系：一般指適合分離容易溶于丁醇、甲醇、乙醇、水等的物質(zhì)的溶劑體系。一般以乙酸乙脂丁醇/(甲醇)/(乙醇)水；丁醇水；乙酸乙脂丁醇甲醇水等體系。親水性體系溶劑條件篩選模型： HSCCC的應(yīng)用n1 天然產(chǎn)物天然產(chǎn)物nHSCCC使用的溶劑體系的組成是千變?nèi)f化的，各溶劑的性質(zhì)也各不相同，因而具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，為從復(fù)雜的天然產(chǎn)物中提取有效成分提供了有利條件。因此，國際上HSCCC被大量用于天然產(chǎn)物各類化學(xué)成分的分離純化，如生物堿、黃酮類、萜類、木脂素、香豆素類等，以下為一些成功應(yīng)用實(shí)例：

17、n1.1 銀杏 Gingkgo biloba 白果內(nèi)酯單體 。黃酮苷，純度達(dá)98%以上。n1.2 丹參 Salvia miltiorrhiza 丹參酮IIA(tonshinone II A ) ，丹參酮I（tanshinoneI），隱丹參酮(cryptotanshinone)3。（蒽醌）n1.3 粉防己 Stephania tetrandra 粉防己堿（tetrandrine）、去甲粉防己堿（fangchinoline）和輪環(huán)藤酚堿（cyclanoline）。（生物堿）n1.4 黃連 Cotis chinensis 巴馬亭（palmatine）、小檗堿（epiberberine）及黃連堿（co

18、ptisine）。（生物堿）n1.5 虎杖 Polygonum cuspidatwn 白藜蘆醇（resveratrol）、虎杖甙（polydatin）單體 。n1.6 葛 Pueraria lobata 葛根素（puerarin）（黃酮）n1.7 蘋果 Malus pumila 原矢車菊素(procyanidin)；Procyanidin A及procyanidin B。n1.8 牛膝 Achyranthes bidentata 牛膝多糖 (多糖)n1.9 寬葉羌活 Notopterygium forbessi notopterol、isoimperatorin。n1.10 紅豆杉粗提物 10

19、-脫乙酰漿果紫杉素（10-deacelylbaccatin），紫杉醇（taxel）、三尖杉寧堿（Cephalomannine）、漿果紫杉素（baccatin）。紫杉醇和三尖杉寧堿。n1.11 大黃 Rheum officinale 大黃素（aloe-emodin）、大黃酸（rhein）、大黃酚(chrysophanol)、和大黃素(cmodin)；大黃素甲醚、蘆薈大黃酸、大黃酸、大黃酚和大黃素。n1.12 鹽生肉蓯蓉 phenylethanoid glycosides(PhGs)、acteoside、2-acetylacteoside。 2.1.13 山茱萸 沒食子酸(gallic acid)

20、 。n1.14 積雪草 Centella asiatica 積雪草苷（asiaticoside）和羥基積雪草甙(madecassoside) （萜類）n1.15 山楂 金絲桃苷（hypericin）、槲皮素(quercetin)、蘆丁(rutin)、牡荊素(vitexin)、異牡荊素(isovitexvin)；槲皮素、四羥基黃酮和槲皮黃酮。n1.16 唐古特山莨菪 Antsodus luridus 又稱塞莨菪，山莨?fàn)I菪堿（anisodamine）、樟柳堿（anisodine）。n1.17 葡萄 Vitis vinifera malvidin-3-glucoside(vitisin A、acet

21、ylvitisin A)、peonidin-3, 5-diglucosides、anthocyanins等14。n1.18 茶 兒茶酚(catechins)、黃酮醇葡萄糖苷類(flavonol glycosides)、strictinin、proanthocyanidins；茶黃素(theaflavine)、表茶黃酸（epitheaflavic acids）、thearubigins。n1.19 黃柏 生物堿，小檗堿。n1.20 苦參 苦參堿；苦參堿和氧化苦參堿。n1.21 青葉膽（云南獐牙菜） 龍膽堿。n1.22 中藥復(fù)方桂枝湯有效部分A 生物堿。n1.23 蘆薈 蘆薈甙（99.99%）和蘆

22、薈大黃素（95.83%）。n1.24 洋地黃毒甙的純化 洋地黃毒甙，異羥基洋地黃毒甙。n1.25 鬼臼毒素的純化 鬼臼毒素和4/-去甲基鬼臼毒素的純品。n1.26 香芹菜 falcarind和falcarindiel；還從香芹菜中分離得到了2個C20化合物。n1.27小蔓長春花 長春胺和長春辛。n1.28委內(nèi)瑞拉箭毒 馬枯素和Panarine。n1.29 洋金花總堿 莨菪堿、東莨菪堿及待定成分。n1.30蛾眉千里光 金緣千里光堿、闊葉千里光堿和新闊葉千里光堿。n1.31三尖杉總堿 異三尖杉酯堿、高三尖杉酯堿和三尖杉酯堿。n1.32 芫花總黃酮 3/羥基芫花素、洋芹素、木犀草素。n1.33大黃羥

23、基蒽醌總甙元 大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚等。n1.34Epilobiumparviflorum(柳葉菜屬) 槲皮甙、楊梅甙、異楊梅甙和沒食子酸。 n1.35 黃酮混合物 橙皮素，四羥基黃酮和槲皮黃酮。n1.36 Garcinia Kola(藤黃屬) 多個雙黃酮。n1.37青蒿 Artemisinin；epideox-yarteannuin。n1.38 Cochlospermum tinctorium(卷胚屬) cochloxan-thin和dihydrocochloxanthin。n1.39龍膽 裂環(huán)烯醚萜甙。n1.40江花五味子 schisanhend和它的乙酸化物。n1

24、.41人參 eleutheroside。n1.42香豆素混合物 甲醚散形酮、7-甲氧(基)香豆素、7羥基6甲氧基香豆素和7羥基香豆素。n1.43毛地黃皂甙 強(qiáng)心甙的化臺物。nA 生物堿生物堿nB 黃酮類似物黃酮類似物nC 萜類萜類 n D 木脂素木脂素nE 香豆素類香豆素類nF 其它其它n2 抗生素抗生素 依羅霉素依羅霉素(efortomycin) ；放線菌素；放線菌素（actinomycin）；殺念菌素（）；殺念菌素（candicidin）；伊維）；伊維菌素（菌素（ivermectin）；普那霉素（）；普那霉素（pristinamycins）等等。等等。n3 蛋白質(zhì)和肽蛋白質(zhì)和肽n短桿菌肽短桿菌肽 n4 食品食品n毒素，分離毒素，分離SEA(導(dǎo)致食品污染的常見毒素導(dǎo)致食品污染的常見毒素)；falcarind和和falcarindiel ；糖和；糖和PNP衍生物衍生物n5 無機(jī)物無機(jī)物 稀土元素或重金屬元素稀土元素或重金屬元素 n6 其他其他高速逆流色譜的一些新進(jìn)展高速逆流色譜的一些新進(jìn)展n