PCR技術(shù)的基本原理

1、PCR技術(shù)的基本原理PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的

2、半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。(Plateau)。 到達(dá)平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR的反應(yīng)動力學(xué) PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y(1X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。 反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增

3、的DNA 片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期， 即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)” ，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR 擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 可分為長產(chǎn)物片段和短產(chǎn)物片段兩部分。短產(chǎn)物片段的長度嚴(yán)格地限定在兩個引物鏈5端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段。短產(chǎn)物片段和長產(chǎn)物片段是由于引物所結(jié)合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應(yīng)周期中， 以兩條互補(bǔ)的DNA為模板，引物是從3端開始延伸， 其5端是固定的，3 端則沒有固定的止點(diǎn)，長短不一，這就是“長產(chǎn)物片段”。進(jìn)入第二周期后，引物除與原始模板結(jié)合外

4、，還要同新合成的鏈(即“長產(chǎn)物片段”)結(jié)合。引物在與新鏈結(jié)時， 由于新鏈模板的5端序列是固定的， 這就等于這次延伸的片段3端被固定了止點(diǎn)， 保證了新片段的起點(diǎn)和止點(diǎn)都限定于引物擴(kuò)增序列以內(nèi)、形成長短一致的“短產(chǎn)物片段”。不難看出“短產(chǎn)物片段”是按指數(shù)倍數(shù)增加， 而“長產(chǎn)物片段”則以算術(shù)倍數(shù)增加， 幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應(yīng)產(chǎn)物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析1. Polymerase Chain Reaction 具體內(nèi)容點(diǎn)擊： 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，簡稱PCR。又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。 由美國科學(xué)家PE（Perkin Elmer珀金-埃

5、爾默）公司遺傳部的Dr. Mullis發(fā)明，由于PCR技術(shù)在理論和應(yīng)用上的跨時代意義，因此Mullis獲得了1993年化學(xué)諾貝爾獎。 是一種體外快速擴(kuò)增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，數(shù)小時內(nèi)可使目的基因片段擴(kuò)增到數(shù)百萬個拷貝的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變

6、性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需24分鐘，23小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。 所有的DNA的復(fù)制都是從一個固定的起始點(diǎn)開始的，而DNA聚合酶只能延長已存在的DNA鏈，不能從頭合成DNA鏈，新DNA的復(fù)制是如何形成的？經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究證明，DNA復(fù)制時，往往先由R

7、NA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶從RNA引物3端開始合成新的DNA鏈。引物科技名詞定義中文名稱：引物 英文名稱：primer 定義1：在聚合作用的起始時，可以刺激合成另一種大分子，并與反應(yīng)物以共價鍵形式連接的序列。在核酸化學(xué)中，引物是一段短的單鏈RNA或DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。體外人工設(shè)計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應(yīng)、測序和探針合成等。 所屬學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)（一級學(xué)科）；總論（二級學(xué)科） 定義2：在多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，用于引導(dǎo)脫氧核糖核酸合成的一段核苷酸序列。 所屬學(xué)科

8、：水產(chǎn)學(xué)（一級學(xué)科）；水產(chǎn)生物育種學(xué)（二級學(xué)科） 定義3：（1）DNA復(fù)制時，由引物酶催化合成的DNA復(fù)制的RNA引導(dǎo)序列。（2）體外人工合成DNA中，可與模板結(jié)合的單鏈核苷酸片段。 所屬學(xué)科：細(xì)胞生物學(xué)（一級學(xué)科）；細(xì)胞遺傳（二級學(xué)科） 定義4：含游離3-羥基并引發(fā)聚合反應(yīng)的寡核苷酸序列。 所屬學(xué)科：遺傳學(xué)（一級學(xué)科）；分子遺傳學(xué)（二級學(xué)科） 本內(nèi)容由全國科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會審定公布 百科名片 引物引物（primer），是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，在核酸合成反應(yīng)時，作為每個多核苷酸鏈進(jìn)行延伸的出發(fā)點(diǎn)而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進(jìn)行合成

9、，因此引物的3-OH，必須是游離的。目錄類型 引物設(shè)計原則 1. 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。 2. 2.引物長度一般在1530堿基之間。 3. 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72 4. 4.引物3端要避開密碼子的第3位。 5. 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。 6. 6. 堿基要隨機(jī)分布。 7. 7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。 8. 8. 5 端和中間G值應(yīng)相對較高3 端較低 9. 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 10. 10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。 11. 11. 引物應(yīng)具有特異性。常用引物設(shè)計軟件類型 引物設(shè)計原則 1.

10、 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。 2. 2.引物長度一般在1530堿基之間。 3. 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72 4. 4.引物3端要避開密碼子的第3位。 5. 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。 6. 6. 堿基要隨機(jī)分布。 7. 7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。 8. 8. 5 端和中間G值應(yīng)相對較高3 端較低 9. 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。 10. 10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。 11. 11. 引物應(yīng)具有特異性。常用引物設(shè)計軟件展開編輯本段類型存在有自然中生物的DNA復(fù)制引物（RNA引物）和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)

11、中人工合成的引物（通常為 DNA引物）。一般所說引物，指DNA引物，以下簡稱引物。 編輯本段引物設(shè)計原則引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一個引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。 在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據(jù)這一序列合成引物，利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈，引物與單鏈相應(yīng)互補(bǔ)序列結(jié)合，然后在DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸，如此重復(fù)循環(huán)，延伸后得到的產(chǎn)物同樣可以和引物結(jié)合。 PCR引物設(shè)計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的優(yōu)劣直接

12、關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對引物的設(shè)計不可能有一種包羅萬象的規(guī)則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計。 1.引物最好在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計。DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟件（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。 2.引物長度一般在1530堿基之間。引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。 3.引物GC含量在40%60%間，Tm值最好近72G

13、C含量（composition）過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm值510。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為5580，其Tm值最好接近72以使復(fù)性條件最佳。 4.引物3端要避開密碼子的第3位。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。 5.引物3端不能選擇A，最好選擇T。引物3端錯配時，不同堿基引

14、發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3端最好選擇T。 6. 堿基要隨機(jī)分布。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。 7. 引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hair

15、pin）使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)避免3 端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross dimer）的形成。引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可避免的話，應(yīng)盡量使其G值不要過高（應(yīng)小于4.5kcal/mol）。否則易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 8. 5 端和中間G值應(yīng)相對較高3 端較低G值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性，G值越大，則雙鏈越穩(wěn)定。應(yīng)當(dāng)選用5 端和中

16、間G值相對較高，而3 端G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3 端的G 值過高，容易在錯配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（不同位置的G值可以用Oligo 6軟件進(jìn)行分析） 9.引物的5端可以修飾，而3端不可修飾。引物的5 端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5 端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。 引物的延伸是從3 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3 端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。 10. 擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。某

17、些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件（比如RNAstructure）可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G）小于58.6l kJ/mol時，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開這一區(qū)域時，用7-deaza-2-脫氧GTP取代dGTP對擴(kuò)增的成功是有幫助的。 11. 引物應(yīng)具有特異性。引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的

18、引物；用作克隆目的的PCR，因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。 做Real Time時,用于SYBR Green I法時的一對引物與一般PCR的引物,在引物設(shè)計上所要求的參數(shù)是不同的。引物設(shè)計的要求： 避免重復(fù)堿基，尤其是G. Tm=58-60度。 GC=30-80%. 3端最后5個堿基內(nèi)不能有多于2個的G或C. 正向引物與探針離得越近越好，但不能重疊。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度： 引物的產(chǎn)物大小不要太大，一般在80-250bp之間都可；80150 bp最為合適（可以延長至300 bp）。 引物的退火溫度要高，一般要在60度以上； 要特別注意避

19、免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。 而且引物設(shè)計時應(yīng)該考慮到引物要有不受基因組DNA污染影響的能力，即引物應(yīng)該跨外顯子，最好是引物能跨外顯子的接頭區(qū)，這樣可以更有效的不受基因組DNA污染的影響。 做染料法最關(guān)鍵的就是尋找到合適的引物和做污染的預(yù)防工作。對于引物，你要有從一大堆引物中挑出一兩個能用的引物的思想準(zhǔn)備-尋找合適的引物非常不容易。 關(guān)于BLAST的作用應(yīng)該是通過比對，發(fā)現(xiàn)你所設(shè)計的這個引物，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并在GENEBANK中公開的不物種基因序列當(dāng)中，除了和你的目標(biāo)基因之外，還有沒有和其他物種或其他序列當(dāng)中存在相同的序列，如和你的目標(biāo)序列之外的序列相同的序列，則可能擴(kuò)出其他序列的產(chǎn)物，那么這個引物的特異性就很差，從而不能用。 編輯本段常用引物設(shè)計軟件Oligo 6 Oligo 6是目前使用最為廣泛的一款引物設(shè)計軟件，除了可以簡單快捷地完成各種引物和探針的設(shè)計與分析外，還具有很多其 他同類軟件所不具有的高級功能： 已知一個PCR引物的序列，搜尋和設(shè)計另一個引物的序列； 按照不同的物種對MM子的偏好性設(shè)計簡并引物； 對環(huán)型DNA片段，設(shè)計反