常用菌種的分離、選育和保藏

1、常用菌種的分離、選育和保藏常用菌種的分離、選育和保藏 第一節(jié)第一節(jié) 菌種的分離簡介菌種的分離簡介 一、菌種的來源一、菌種的來源 根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買； 從大自然中分離篩選新的微生物菌種。 二、分離思路二、分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。 實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進的設(shè)備與之配合。 定方案：定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。 采樣：采樣：有針對性地采集樣品。

2、增殖：增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。 分離：分離：利用分離技術(shù)得到純種。 發(fā)酵性能測定：發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。三、新種分離與篩選的步驟三、新種分離與篩選的步驟 （一）采樣一）采樣1、采樣對象 以采集土壤為主。一般園田土和耕作過的沼澤土中，以細菌和放線菌為主，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多，如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi)。采樣的對象也可以是植物，腐敗物品，某些水域等。 2、采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不

3、多的秋初為好。 3、采土方式：在選好適當?shù)攸c后，用小薩子除去表土，取離地面5-15cm處的土約10g，盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中，扎好，標記，記錄采樣時間、地點、環(huán)境條件等，以備查考。為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化，宜將樣品逐步分批寄回，以便及時分離。（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多

4、。（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)分離 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進一步應(yīng)用，而且控制得細一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。（四）篩（四）篩 選選 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗（五）毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當十分當心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為

5、食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。第二節(jié)第二節(jié) 培養(yǎng)分離培養(yǎng)分離 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟。 到目前為止，還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類。 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中，應(yīng)及時調(diào)整檢測方法，以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng)。 因此，建立一更為科學(xué)的和針對性不強的分離方法是必要的。 一、成功的分離培養(yǎng)方法一、成功的分離培養(yǎng)方法(1)認真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程；(2)制訂初步的篩選標準；(3)將生態(tài)學(xué)方法運用到分離和篩選過程。二、培養(yǎng)分離中要解決的問題1、“分離什么和從哪里

6、分離出?” 2、必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力、生長速度、生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費用，工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等。3、選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法。四、自然界中細菌的分離四、自然界中細菌的分離 (一一)采樣和采集方法采樣和采集方法 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細菌菌群，特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。 樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。采樣的注意事項采樣的注意事項1、采樣時應(yīng)盡可能保持相對無菌；2、所采集的樣本必須具有某種代表性；3、采好的樣

7、必須完整地標上樣本的種類及采集日期、地點以及采集地點的地理、生態(tài)參數(shù)等；4、應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時間因素，因為真正的原地菌群的出現(xiàn)可能是短暫的； 5、采好的樣應(yīng)及時處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于4下，但貯存時間不宜過長。這是因為一旦采樣結(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長1土樣采集方法土樣采集方法 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集； 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴格，可取離地面515cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。 在采集植物根際土樣時，一般方法是自土壤中

8、慢慢拔出植物根，在大量無菌水中浸漬約20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土，這部分上卻為根際土樣。2 2植物體采集方法植物體采集方法 在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。 選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。 采集植物根及根系時，方法與根際土樣采集方法相似。將洗凈的根裝入采樣袋中，采集根系時，一般與根際土樣一起保存。 3 3水樣采集方法水樣采集方法 用于細菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。 由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在較深的靜水層中采

9、集水樣。 方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進行檢測，或者4下貯存。( (二二)培養(yǎng)基的組成原則培養(yǎng)基的組成原則1、就分離培養(yǎng)基的組成而言，部分培養(yǎng)基中必須含有10-50%的天然提取物。加入培養(yǎng)基中的天然提取物，部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳、氮源，如幾丁質(zhì)、纖維素或果膠。2、所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑(如放線菌酮和制霉素)，摻加濃度一般為50gm1， 以抑制真菌的生長。3、瓊脂平板在使用前應(yīng)置于37培養(yǎng)箱中孵育l

10、、2天。4、培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。富集方法富集方法 運用細菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。 富集可以促進抗性的產(chǎn)生并維持下來。 土樣中細菌的富集：適度稀釋后，取0.1m1涂布已添加及未添加富集底物(如幾丁質(zhì)、纖維素等)的土浸出汁平板。 植物體上細菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。 水中細菌的分離：水樣通過0.22m無菌濾膜，取出濾膜用1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。用樣本稀釋液適度稀釋,涂布平板倒置培養(yǎng)

11、或濾紙壓印分離法。水中細菌分離的簡易富集技術(shù)水中細菌分離的簡易富集技術(shù) 在無菌的、用棉團塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng)，定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上； 在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白質(zhì)等，同樣可以促進水中微生物的增殖。 培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長。 另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細菌“附著材料”，如無菌的植物組織或土壤浸出液。 通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細菌、中溫菌和嗜高溫菌。次代培養(yǎng)及純化步驟次代培養(yǎng)及純化步驟 1、涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后，如生長出菌落，則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進行分類。2、用無菌牙簽

12、將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上。3、篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后，按生長出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素、菌落形態(tài)等進行最初分組。4、將認為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進行篩選。五、放線菌的分離五、放線菌的分離 (一)采樣及采集方法 應(yīng)盡可能實行無菌操作。 所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性。 樣本采集完后，應(yīng)及時處理或在4下貯存，貯存試樣處應(yīng)與劃線，篩選平板分開，貯存時間不宜過長。（三）培養(yǎng)基的組成原則（三）培養(yǎng)基的組成原則 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進行的。除嗜溫性放線菌外，其他放線菌一般在培養(yǎng)4-20天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落

13、。 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮，以抑制真菌的繁殖。 選擇性地添加抗生素。 分離瓊脂平板制備好后，一般皆應(yīng)在37培養(yǎng)箱中存放3天。放線菌的分離放線菌的分離 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或濾紙過濾，取離心沉積或濾紙表面沉積進行系列稀釋和涂布。次代培養(yǎng)及純化次代培養(yǎng)及純化 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異，作初步的鑒定和區(qū)分

14、。 通過高倍放大進行鏡檢，可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況。 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識別不同的生長形態(tài)、從而初步地加以鑒定，在分離放線菌時顯得尤為重要。 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取，點接到瓊脂平板上進行影印培養(yǎng)，以進一步篩選和分離。六六、真菌分離1、利用低碳氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長菌落分散，利于計數(shù)，分離和鑒定。這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢，并由此限制真菌的遷涉生長。2、改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離。3、有時，真菌子實體形成必須有光線，這在分離培養(yǎng)時應(yīng)加以考慮。4、選擇性富

15、集：是通過一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。 富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。5、選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標微生物消除或減少到一定程度。在分離培養(yǎng)基中加入一定的抗生素即可有效地抑制細菌生長及菌落形成。真菌的分離方法真菌的分離方法 土中真菌的分離：稀釋法，混入法，壓貼法，粘附法，浮選法，注射器采集法，土過篩法，庶糖密度梯度離心法。 植物材料中真菌的分離：植入法，壓貼法，洗滌法，浸泡法。 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離。餌誘技術(shù)常用

16、于水中真菌的富集。 子實體直接分離培養(yǎng)擔子菌：新采集的子實體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無菌濾紙上培養(yǎng)。第三節(jié)第三節(jié) 工業(yè)菌種的育種方針工業(yè)菌種的育種方針 工業(yè)菌種的育種： 是運用遺傳學(xué)原理和技術(shù)對某個用于特定生物技術(shù)目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強化，或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀。工業(yè)菌種育種的方法工業(yè)菌種育種的方法 誘變 基因轉(zhuǎn)移 基因重組育種過程育種過程 包括下列3個步驟： (1)在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。 (2)希望基因型的選出。 (3)改良菌種的評價(包括實驗規(guī)模和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模)。選擇育種方法時綜合考慮的因素選擇育種方法時

17、綜合考慮的因素 (1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系(如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗)； (2)對這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬面認識的明了程度； (3)經(jīng)濟費用。 如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術(shù)： 如果對其遺傳及生物化學(xué)方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。工業(yè)菌種改良方法工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過代謝途徑中的限速步驟：通過增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。 (2)增加前體物的濃度。 (3)改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高

18、菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產(chǎn)品的耐受力。(4)抑制或消除產(chǎn)品分解酶。 (5)改進菌種外泌產(chǎn)品的能力。(6)消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制。如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性。第四節(jié)第四節(jié) 誘變育種誘變育種 以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機率并不很高，一個基因的自然突變頻率僅10-6-10-10左右。 誘變育種：以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種，是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量、性能的主要手段。誘變物理、化學(xué)或生物誘變方法物理、化學(xué)或生物誘變方法 一、誘變劑和誘變處理 物理誘變劑：射線如紫外線、X射線、射線，快中子； 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。許多高產(chǎn)菌株的選育都用過紫外線，對

19、于一般實驗室、中小型工廠都適用，也很安全。 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性?；瘜W(xué)誘變劑：化學(xué)因子如堿基類似物、5氟尿嘧啶、烷化劑等。化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。使用化學(xué)誘變劑的優(yōu)缺點：1、大多數(shù)情況下，就突變數(shù)量而言，要比電離輻射更有效。 2、化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟的，因為只需要少量的合適的誘變劑，設(shè)備是實驗室的一般玻璃器皿，一個蒸氣罩。而用電離輻射行工作時，設(shè)備費用大，并要注意安全性。3、大部分誘變劑是致癌劑，所以在使用中必須非常謹慎，要避免化學(xué)誘變劑與皮膚接觸，且切勿吸入其蒸氣，有人對某些誘變劑極其敏感，甚至未直接

20、接觸就會過敏，這就更要當心。誘變劑的選擇誘變劑的選擇1堿基類似物和羥胺具有很高的特異性，但很少使用，回復(fù)突變率高，效果不大。2亞硝酸和烷化劑應(yīng)用的范圍較廣，造成的遺傳損傷較多。其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“超誘變劑”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一。3吖啶類誘變劑可以造成生化代謝途徑的完全中斷。4紫外線仍十分有效。電離輻射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回復(fù)的缺突變。但它可能影響鄰近基因的性能。二、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選( (一一) )出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇1自然界新分離的野生型菌株，對誘變處理較敏感，容易達到好的效果

21、。2在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像，也是良好的出發(fā)菌株。3每次誘變處理都有一定提高的菌株，往往多次誘變能積累較多的提高。4出發(fā)菌株開始時可以同時選23株，在處理比較后，將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變。 5要盡量選擇單倍體細胞、單核或核少的多細胞體來作出發(fā)誘變細胞，這是由于變異性狀大部分是隱性的，特別是高產(chǎn)基因。 6根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因為同一誘變劑的重復(fù)處理會使細胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。有的誘變劑是作用于營養(yǎng)細胞，就要選對數(shù)期的細胞：有的作用于休止期，就可選用孢子。 ( (二二) )處理菌懸液的制備處理菌懸液的制備 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細胞和

22、單孢子狀態(tài)的、活力類似的菌懸液，為此要進行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)，并要離心，洗滌，過濾。( (三三) )誘變處理誘變處理 根據(jù)前面有關(guān)誘變劑及誘變處理的介紹，結(jié)合誘變對象的實際，設(shè)計誘變處理方案。 ( (四四) )中間培養(yǎng)中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來之前，有一個表現(xiàn)延遲的過程，即細胞內(nèi)原有酶量的稀釋過程(生理延遲)，需3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來。這個過程對今后的篩選和獲得穩(wěn)定菌株都是極為重要的。 方法： 讓變異處理后細胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時，以讓細胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制，讓細胞繁殖幾代，以得到純的變異細胞。這樣，隱性的變異就會顯現(xiàn)出來，若不經(jīng)液體培養(yǎng)基的中間培養(yǎng)，直接在平皿上分離就

23、會出現(xiàn)變異和不變異細胞同時存在于一個菌落內(nèi)的可能，形成混雜菌落，以致造成篩選結(jié)果的不穩(wěn)定和將來的菌株退化。( (五五) )分離和篩選分離和篩選 篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。 復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異. 例如初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來挑取參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種 紫外線誘變一般采用15

24、W紫外線殺菌燈，波長為2537A燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細胞的死亡率表示，希望照射的劑量死亡率控制在7080%為宜。 被照射的菌懸液細胞數(shù)，細菌為106個ml左右，霉菌孢子和酵母細胞為106107個ml。由于紫外線穿透力不強，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進行攪拌，使照射均勻。 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進行。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌 N甲基N-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強烈的誘變作用。其精確的作用機制尚不很

25、清楚，據(jù)認為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸，直接作用于細胞內(nèi)的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強。第五節(jié)第五節(jié) 營養(yǎng)缺陷型的選育營養(yǎng)缺陷型的選育 營養(yǎng)缺陷型是指通過誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、維生素和堿基等的能力，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分才能正常生長的變異株。 與營養(yǎng)缺陷型對應(yīng)的是野生型。 能滿足野生型菌株正常生長的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基(MM)； 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營養(yǎng)成分的稱補充培養(yǎng)基(SM)； 能滿足各種營養(yǎng)缺陷型生長的稱完全培養(yǎng)基(CM)，如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基等。營養(yǎng)缺陷型的用途營養(yǎng)缺陷型的用

26、途 營養(yǎng)缺陷型在生產(chǎn)上和科學(xué)研究上用途很大。目前生產(chǎn)氨基酸、核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型。要研究代謝途徑，育種技術(shù)都必須有營養(yǎng)缺陷型的菌株為材料。篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟篩選營養(yǎng)缺陷型的步驟 誘變 淘汰野生型 檢出缺陷型 確定生長譜一、誘變方法一、誘變方法 物理誘變 化學(xué)誘變二、淘汰野生型二、淘汰野生型 抗生素法：野生型能在MM中生長，而缺陷型不能，于是將誘變處理液在MM中培養(yǎng)短時讓野生型生長，處于活化階段，而缺陷型無法生長，仍處于休眠狀態(tài)。由于細菌或酵母對一些抗生素敏感，于是就相應(yīng)加入一定量的抗生素，結(jié)果活化狀態(tài)的野生型就被殺死，保存了缺陷型。一般細菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。 菌

27、絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發(fā)芽而不能濾過。 三、檢出缺陷型三、檢出缺陷型 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長。 具體方法：影印法、點種法、夾層法 1將一較平皿直徑小1cm的金屬圓筒蒙上一層滅菌的絲絨，用金屬夾夾住，滅菌。 2將完全培養(yǎng)基上長出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓，使之成為印模，標記方位。 3將基本培養(yǎng)基平皿和完全培養(yǎng)基平皿在標記的同一方位上先后輕輕一壓，此菌印模即復(fù)印于上。 ( (一一) )影印法影印法 4 將CM和MM在恒溫箱中培養(yǎng)。 5二平

28、皿相同方位進行比較， 即可發(fā)現(xiàn)在MM平皿上長出的菌落少于GM平板上的。MM上未長而相應(yīng)于CM上長出的那幾個菌落就可能是缺陷型。 此法要求平皿上菌落不能太多，菌落之間應(yīng)有一定間隔。 ( (二二) )點種法點種法 也就是任意法。 用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應(yīng)位置點種，然后一起培養(yǎng)，觀察其生長情況。 此法結(jié)果明確，但工作量大。 ( (三三) )夾層法夾層法 先在培養(yǎng)皿上倒一層基本瓊脂培養(yǎng)基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h，將出現(xiàn)的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養(yǎng)基，再培養(yǎng)。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型。 此法缺點

29、是，結(jié)果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易。第六節(jié)第六節(jié) 基因育種基因育種 基因重組育種：是運用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細胞并使其在新的宿主細胞系統(tǒng)內(nèi)進行復(fù)制和表達，或者通過細胞間的相互作用，使一個細胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細胞的方法。一個完整的基因克隆過程包括以一個完整的基因克隆過程包括以下步驟下步驟 、獲得待克隆的DNA片段（基因）； 、目的基因與載體在體外連接； 、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞； 、篩選、鑒定陽性重組子； 、重組子的擴增與或表達。 2.2基因重組一、質(zhì)粒的特點一、

30、質(zhì)粒的特點1、質(zhì)粒的存在并非微生物生命活動必需。2、每個細胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù)。不同類型的質(zhì)粒其拷貝數(shù)各異，同一質(zhì)粒在不同條件下，拷貝數(shù)也可能差異很大，有嚴緊型和松弛型兩種。3、質(zhì)粒DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價、閉環(huán)狀DNA(CCC DNA)；其次是由于條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán)DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性DNA。質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的二、各類質(zhì)粒所賦予宿主細胞的不同表現(xiàn)型不同表現(xiàn)型 抗生素抗性：抗生素的產(chǎn)生；大腸桿菌素的產(chǎn)生；腸毒素的產(chǎn)生；復(fù)雜有機化合物的降解；限制性核酸內(nèi)切酶和修飾酶的產(chǎn)生；殺傷性能。 在自然條

31、件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。在實驗室條件下，質(zhì)粒也可經(jīng)人工手段將其轉(zhuǎn)化入宿主細胞內(nèi)。三、質(zhì)粒三、質(zhì)粒DNADNA的提取方法的提取方法 細菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴增； 細菌的收獲和裂解； 質(zhì)粒DNA的提取。四、遺傳轉(zhuǎn)化四、遺傳轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是指受體細胞直接攝取供體細胞游離的DNA片段，將其同源部分進行堿基配對，組合到自己的基因中，從而獲得供體細胞的某些遺傳性狀。重組重組DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶 包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等.限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點。 常用限制性內(nèi)切酶 種類及特性W.

32、 Arber,H. O. Smith限制性內(nèi)切酶的剪切方式限制性內(nèi)切酶的剪切方式 粘性未端：切開后的兩段DNA各留下一個尾，這2個尾的核苷酸順序完全一樣，中是方向相反。它們之間是互補的，在適當條件下可以再連接一起。其它工具酶其它工具酶 連接酶連接酶T4 DNA 修補工具酶修補工具酶DNA聚合酶聚合酶I 末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶載體宿主系統(tǒng)載體宿主系統(tǒng) 載體(vector)是攜帶外源DNA進入宿主細胞進行擴增和表達的DNA； 一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。

33、載體應(yīng)具備以下條件：載體應(yīng)具備以下條件： 、能在適當?shù)乃拗骷毎袕?fù)制； 、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）以便外源DNA插入； 、具有篩選標志以區(qū)別陽性與陰性重組分子； 、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNA與宿主DNA便于分離； 、對于表達型載體還應(yīng)具有與宿主細胞相適應(yīng)的啟動子、增強子、加尾信號等基因表達元件。宿主細胞必須符合以下條件宿主細胞必須符合以下條件 、對載體的復(fù)制和擴增沒有嚴格的限制； 、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源DNA； 、在重組DNA增殖過程中，不會對它進行修飾； 、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組； 、容易導(dǎo)入重組DNA分子； 、符合重組DNA操作的安全

34、標準。目的基因的獲取目的基因的獲取 一、通過建立基因文庫分離靶基因 基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。 cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_的內(nèi)含子。 二、化學(xué)合成法制備DNA片段 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。 三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴增基因片段 對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（），以基因組DNA或cDNA模板擴增得到目的基因片段。PCRPCR技術(shù)技術(shù) 根據(jù)需擴增片段的兩端設(shè)計引物。 使DNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合

35、成（鏈延長）反應(yīng)。 特點：需要很少的DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNADNA擴增擴增PCRPCR反應(yīng)反應(yīng)DNADNA片斷的克隆片斷的克隆載體的條件載體的條件 ：a 復(fù)制起點 b 適宜的限制酶切點c 選擇標記 DNA分子的體外連接 DNA片段的體外連接是重組DNA技術(shù)的關(guān)鍵。DNA連接是由DNA連接酶催化完成的。一、一、DNADNA連接酶連接酶 DNA連接酶催化兩條雙鏈DNA片段相鄰的5-磷酸和3-羥基間形成磷酸二酯鍵。 在分子克隆中最有用的的DNA連接酶是來自噬菌體的DNA 連接酶。 T4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于： 、連接具有同源互補粘性末端的片段； 、連接雙鏈DNA

36、分子間的平端； 、在雙鏈平端的DNA分子上添加合成的人工接頭或適配子。重組重組DNADNA導(dǎo)入宿主菌導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組DNA分子必須導(dǎo)入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達。根據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組DNA分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。一、轉(zhuǎn)一、轉(zhuǎn) 化化 指以細菌質(zhì)粒為載體，將外源基因?qū)胧荏w細胞的過程。轉(zhuǎn)化時，細菌必須經(jīng)過適當?shù)奶幚硎怪幱诟惺軕B(tài)即容易接受外源DNA的狀態(tài)，然后利用短暫熱休克使DNA導(dǎo)入細菌宿主中。 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉(zhuǎn)化效率高、適用于任何菌株。二、轉(zhuǎn)染和感染二、轉(zhuǎn)染和感染 利用噬菌體DNA作為載體時可經(jīng)兩種方式導(dǎo)入受體菌。一種是

37、感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。另一種方式是轉(zhuǎn)染，即在DNA連接酶作用下使噬菌體DNA環(huán)化，再象重組質(zhì)粒一樣地轉(zhuǎn)化進受體菌。但習(xí)慣上常把以噬菌體DNA為載體構(gòu)建成的重組子導(dǎo)入細胞的過程統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)染。重組克隆的篩選與鑒定重組克隆的篩選與鑒定 基因克隆的最后一步是從轉(zhuǎn)化細菌菌落中篩選出含有陽性重組子的菌落，并鑒定重組子的正確性。 通過細菌培養(yǎng)以及重組子的擴增，獲得所需的基因片段的大量拷貝。進一步研究該基因的結(jié)構(gòu)、功能，或表達該基因的產(chǎn)物。一、抗藥性標志的篩選一、抗藥性標志的篩選 如果克隆載體帶有某種抗藥性標志基因如ampr或tetrr ，轉(zhuǎn)化后只有含這種抗藥基因的轉(zhuǎn)化

38、子細菌才能在含該抗菌素的平板上幸存并形成菌落，這樣就可將轉(zhuǎn)化菌與非轉(zhuǎn)化菌區(qū)別開來。如果重組DNA時將外源基因插入標志基因內(nèi)，該標志基因失活，通過有無抗菌素培養(yǎng)基對比培養(yǎng)，還可區(qū)分單純載體或重組載體（含外源基因）的轉(zhuǎn)化菌落。二、菌落快速裂解鑒定法二、菌落快速裂解鑒定法 從平板上直接挑選菌落裂解后，直接電泳檢測載體質(zhì)粒大小，判斷有無插入片段存在，該法適于插入片段較大的重組子初篩。三、內(nèi)切酶圖譜鑒定三、內(nèi)切酶圖譜鑒定 經(jīng)初篩鑒定有重組子的菌落，小量培養(yǎng)后，再分離出重組質(zhì)?；蛑亟M噬菌體DNA，用相應(yīng)的內(nèi)切酶切割，釋放出插入片斷；對于可能存在雙向插入的重組子，還要用內(nèi)切酶消化鑒定插入的方向。第七節(jié)第七節(jié)

39、 雜交育種雜交育種 ( (一一) )細菌雜交細菌雜交 在細菌中實現(xiàn)雜交的種類尚不多，主要是大腸桿菌，其他還有鼠傷寒沙門氏菌、銅綠假單胞菌、淋病奈氏球菌等。 大腸桿菌中存著致育因子F，有F因子為F+，沒有F因子稱F-。 F因子存在于細胞中形式：游離狀態(tài)(F+細胞)；整合狀態(tài)，即F因子插入胞核質(zhì)的一定位置上(Hfr細胞)。 F因子有明顯的感染性，大腸桿菌的接合，實質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移，所以F+和Hfr稱供體菌，而F-稱受體菌。（二）酵母雜交育種技術(shù)二）酵母雜交育種技術(shù) 1、酵母繁殖方式 酵母為單細胞型真菌，一般以出芽方式生殖，在通常情況下，繁殖體為雙倍體，但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo)，可使其產(chǎn)生單倍體孢子并

40、可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體。 2、酵母雜交 一般而言，雜交育種運用了酵母的單雙倍生活周期，將不同基因型和相對的交配型的單倍體細胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細胞，經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀。 酵母的雜交方法有孢子雜交法、群體交配法、單倍體細胞雜交法和罕見交配法。就啤酒酵母而言，運用罕見交配法更易獲得結(jié)果。第八節(jié)第八節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種 原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。 原生質(zhì)休融合育種是基因重組的一種重要方法。 原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是1978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點一、原生質(zhì)體融合

41、育種的特點(一)雜交頻率較高：細胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。(二)受接合型或致育型的限制較小：二親株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。(三)遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細胞質(zhì)和細胞核進行類似的合二為一的過程。 (四)存在著兩株以上親株同時參與融合形成融合子的可能性。（五）有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。 (六)提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。 (七)有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。二、原生質(zhì)體融合育種的要點二、原生質(zhì)體融合育種的要點（一）標記菌種的選擇 獲得標記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌株。這

42、里最重要的是標記必須穩(wěn)定。 采用抗藥性菌株除可作標記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標記菌種。 ( (二二) )原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細胞壁分解酶，將細胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細胞，它保持原細胞的一切活性。 在放線菌和細菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。第九節(jié)第九節(jié) 篩選新的代謝產(chǎn)物篩選新的代謝產(chǎn)物 一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑一、開發(fā)新的代謝產(chǎn)物的途徑 (1)從自然界分離新的微生物菌株，或采用新的檢閱方法篩選新的代謝產(chǎn)物。 (2)對已知微生物的代謝產(chǎn)

43、物進行化學(xué)修飾。 (3)利用微生物轉(zhuǎn)化改造代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。 (4)通過原生質(zhì)體融合獲得新的代謝產(chǎn)物。 (5)DNA重組技術(shù)。 二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物二、篩選微生物新的代謝產(chǎn)物的程序的程序 突變型菌株的篩選突變型菌株的篩選 一、產(chǎn)量性狀突變株的篩選 三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標三、篩選微生物代謝產(chǎn)物的目標 篩選克服抗生素抗性菌株的活性物質(zhì)； 篩選抗腫瘤、抗病毒的活性物質(zhì)； 研究有藥理活性的酶抑制劑及免疫調(diào)節(jié)劑； 尋找食品工業(yè)最好的酵母培養(yǎng)物； 篩選降解有害物質(zhì)的微生物以及治療上具有低毒、長效的化學(xué)藥物等。 四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法四、篩選微生物代謝產(chǎn)物的方法 (一)直接方法 為了盡快確定

44、微生物代謝產(chǎn)物的利用前途，在體外試驗測得活性后，可以將培養(yǎng)液的有效成分直接作用于機體，觀察被測樣品的療效。 這種直接確定代謝產(chǎn)物用途的方法亦稱動物體內(nèi)治療試驗。 (二)間接方法 篩選醫(yī)用抗生素，可用細茵、真菌、病毒或腫瘤模型，尋找抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤抗生素、酶抑制劑、免疫制劑等有效物質(zhì)。 在預(yù)篩選時，多用瓊脂平扳擴散抑菌法。通過預(yù)篩選，直接測定最初分離物的生物活性，能加速篩選過程。 性能簽別性能簽別 性能鑒別是分離和篩選微生物代謝產(chǎn)物中最基礎(chǔ)的工作。 鑒別可分為兩方面： 一是對微生物方面進行形態(tài)、培養(yǎng)、生化功能答試驗觀察，并確定微生物產(chǎn)生菌的類群； 二是從化學(xué)的早期鑒別來鑒別微生物的

45、代謝產(chǎn)物?；瘜W(xué)的早期鑒別一般對產(chǎn)生菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進行紙上層析、薄板層析、紙上電泳、抗茵譜、高壓電泳、紫外分光光度法、液相和氣相色譜等試驗，井獲得各種圖譜，與已知圖譜進行比較鑒別。 如果認為是有實用前途的代謝產(chǎn)物，則要進一步大量培養(yǎng)，并進行動物試驗、毒性考查、藥物代謝等實驗，并進行提高發(fā)酵水平和改善提取工藝的工作，以備投入生產(chǎn)。 如果是新的代謝產(chǎn)物一般要進一步確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，井在此基礎(chǔ)上進行合成法的研究或進行化學(xué)改造，研究結(jié)構(gòu)與生物活性的相互關(guān)系，并對作用機制、生物合成過程作進一步的研究。 菌種篩選方案菌種篩選方案 初篩：目的是刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來

46、，使優(yōu)良菌種不致于漏網(wǎng)。初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次。初篩的手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 復(fù)篩的目的是確認符合生產(chǎn)要求的菌株，所以，復(fù)篩步驟以質(zhì)為主，應(yīng)精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。 菌種篩選的手段菌種篩選的手段 初篩 從菌體形態(tài)變異分析 平皿快速檢測法 具體的有紙片培養(yǎng)顯色法、變色圈法、透明圈法、生長圈法和抑制圈法等 搖瓶培養(yǎng)法搖瓶培養(yǎng)法也可用于初篩。 初篩的搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株只做一次發(fā)酵測定，從大量菌株中選出10-20%較好的菌株，淘汰80-90%的菌株；而復(fù)篩中搖瓶培養(yǎng)一般是一個菌株培養(yǎng)3瓶，選出3-5個較好的菌株，再做進一步比較，選出最佳的菌株。 特殊變異菌的篩選方法特殊變異菌

47、的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 經(jīng)誘變處理后的菌懸液在篩選前一般應(yīng)先進行誘變后培養(yǎng)，以促使變異細胞發(fā)生分離，防止出現(xiàn)表型延遲現(xiàn)象，篩選出不純的菌株。營養(yǎng)缺陷型的篩選一般包括濃縮、進一步檢出和鑒別營養(yǎng)缺陷型等步驟。 一次性篩選法 噬菌體抗性菌株、耐高溫菌株 階梯性篩選法藥物抗性突變株。 第十節(jié)第十節(jié) 工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) 在生產(chǎn)發(fā)酵中，具有高產(chǎn)有重要經(jīng)濟價值的某一期待代謝產(chǎn)物主能力的微生物菌種的保存和長期保藏，對于一成功的工業(yè)發(fā)酵過程極為重要。一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備一、理想的菌種保藏方法應(yīng)具備的條件的條件(1) 經(jīng)長期保藏后菌種存活健在；(2) 保證高產(chǎn)突變株不

48、改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力。(3)菌種保藏的基本措施是低溫、干燥、真空。二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù)二、工業(yè)微生物菌種保藏技術(shù) (1)冷凍干燥或真空干燥保藏； (2)超低溫或在液氮中冷凍保藏； (3) 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２兀?(4)土壤或陶瓷珠等載體于燥保藏。2.12.1 冷凍保藏冷凍保藏 冷凍保藏為保藏微生物菌種的最簡單而有效的方法。 通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了獲得滿意的冷凍結(jié)果，通常應(yīng)在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑。冷凍保藏時溫度要求在-20以下，同時應(yīng)認真掌握好冷凍速度和解凍速變。 冷凍深藏的缺點之一

49、是培養(yǎng)物運輸較困難。冷凍保藏種類冷凍保藏種類 一、普通冷凍保藏技術(shù)(-20)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60一-80)三、液氮冷凍保藏技術(shù) 普通冷凍保藏技術(shù)普通冷凍保藏技術(shù)(-20)(-20) 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管肉，然后貯藏于一冰箱的冷藏室中，或于溫度范圍在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。 用此方法可以維持若干微生物的活力12年。 應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。 保藏過程中應(yīng)注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應(yīng)嚴格密封。 這一方法雖簡便

50、易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。二、超低溫冷凍保藏技術(shù)二、超低溫冷凍保藏技術(shù)(-60(-60一一-80)-80) 要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在-60以下進行保藏。 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是： 1離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞； 2用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞； 3加入等體積的20甘油或10二甲亞砜； 4混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70超低溫冰箱中保藏。 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1-2min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。三、液氮冷凍保藏技術(shù)三、液氮冷凍保藏技術(shù) (一)冷凍保護劑 在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10、二甲亞砜5