實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項(xiàng)適合菜鳥入門

1、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用注意事項(xiàng)適合菜鳥入門實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用-注意事項(xiàng)-適合菜鳥入門目錄目錄實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR基本原理基本原理實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR兩種相對定量方法比較兩種相對定量方法比較實(shí)時實(shí)時熒光定量熒光定量PCRPCR誤差分析誤差分析及操作規(guī)范及操作規(guī)范實(shí)驗(yàn)中污染的防實(shí)驗(yàn)中污染的防控控?zé)晒舛繜晒舛縋CRPCR報告模板報告模板實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR基本原理基本原理常規(guī)常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定

2、定性分析。性分析。定量定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時檢測技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板模板進(jìn)行定量分析。進(jìn)行定量分析。常規(guī)常規(guī)vs vs實(shí)時實(shí)時優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)比較比較定量定量PCRPCR三個基本概念三個基本概念(1)擴(kuò)增曲線PCR過程中，以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)過程中熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做的曲線。定量定量PCRPCR三個基本概念三個基本概念(2)閾值的概念在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。定量定量P

3、CRPCR三個基本概念三個基本概念(3) CT值PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。C(t)C(t)與初始模板含量與初始模板含量初始模板量越多，C(t)值越小C(t)與初始模板濃度的對數(shù)值成線性關(guān)系熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度-循環(huán)數(shù)曲線循環(huán)數(shù)曲線初始模板量對數(shù)初始模板量對數(shù)-C(T)循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線10410310610510210熒光定量熒光定量PCRPCR的定量的定量原理原理濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈濃度的對數(shù)值與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)（達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)（Ct值）值）就可分析樣品中起始模就可分析樣品中起始模

4、板板量。量。熒光定量熒光定量PCRPCR的化學(xué)原理的化學(xué)原理 化學(xué)化學(xué)方法分類方法分類非特異性非特異性SYBR Green I法法特異性特異性TaqMan探針法探針法SYBR Green ISYBR Green I法法原理：結(jié)合原理：結(jié)合雙鏈雙鏈DNADNA分子小溝分子小溝延伸結(jié)束，形成雙鏈延伸結(jié)束，形成雙鏈DNADNA，SYBR SYBR GreenGreen結(jié)合到雙螺旋小溝中，當(dāng)受結(jié)合到雙螺旋小溝中，當(dāng)受到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，到適合光源激發(fā)，發(fā)射出熒光，反映產(chǎn)物濃度反映產(chǎn)物濃度優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)使用方便，無需復(fù)雜的設(shè)計(jì)使用方便，無需復(fù)雜的設(shè)計(jì)成本較低成本較低缺點(diǎn)缺點(diǎn)與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特

5、與非特異性產(chǎn)物結(jié)合，無模板特異性異性試驗(yàn)方法較難優(yōu)化試驗(yàn)方法較難優(yōu)化靈敏度低靈敏度低GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAASYBR Green ISYBR Green I法法溶解曲線分析熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用(1)、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；(2)、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；(3)、SYBR Green染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設(shè)計(jì)的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStar Taq酶，或者操作時需要嚴(yán)格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò)增會嚴(yán)重干擾

6、結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時；(4)、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；(5)、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。(6)、對PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。TaqMan探針法水解型水解型報告基團(tuán)，淬滅基團(tuán)報告基團(tuán)，淬滅基團(tuán)FRETFRET（熒光諧振能量傳遞）（熒光諧振能量傳遞）識別特異性產(chǎn)物識別特異性產(chǎn)物優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)特異性高，可準(zhǔn)確定量特異性高，可準(zhǔn)確定量靈敏度高靈敏度高設(shè)計(jì)不同標(biāo)記的探針，可進(jìn)行設(shè)計(jì)不同標(biāo)記的探針，可進(jìn)行多重檢測多重檢測缺點(diǎn)缺點(diǎn)一個探針只適用于一個目標(biāo)一個探針只適用于一個目標(biāo)價格較高價格較高探針設(shè)計(jì)較繁瑣探針設(shè)計(jì)較繁瑣T

7、aqManTaqMan作用機(jī)理兩種化學(xué)的比較實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（絕對定量：精確的計(jì)算初始反應(yīng)的模板濃度（DNADNA，RNARNA）相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含量相對定量：計(jì)算初始反應(yīng)模板的相對含量定量PCR-絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)已知濃度的相應(yīng)DNADNA模板，按不同濃度稀釋模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時根據(jù)實(shí)時PCRPCR反應(yīng)得到相應(yīng)的反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)得到未知濃度樣

8、品的反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)C(t)值值定量PCR-相對定量相對定量的目的相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對定量的問題相對定量的問題樣品材料不均一造成的差別樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素影響）（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素影響）對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差誤差實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR兩種相對

9、兩種相對定定量量方法比較方法比較相對標(biāo)準(zhǔn)曲線相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法和法和2-c(t) 法法相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)處理與未處理樣品同時擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得基因，獲得C(t)C(t)值值用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)C(t)值經(jīng)內(nèi)參值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異樣本的表達(dá)差異適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大目標(biāo)基

10、因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大擴(kuò)增效率較低擴(kuò)增效率較低2-c(t) 法前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗(yàn)樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 CT=表達(dá)量的比值當(dāng)有多個樣品時（如時間點(diǎn)），各樣品均一化后都與同一時間點(diǎn)相比

11、一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因設(shè)計(jì)一步法或兩步法設(shè)計(jì)一步法或兩步法RT-PCRRT-PCR反應(yīng)反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得及處理數(shù)據(jù)獲得及處理目標(biāo)基因目標(biāo)基因C(t)值值內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)基因C(t)值值計(jì)算計(jì)算2-c(t) 作圖作圖適用范圍當(dāng)擴(kuò)增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率當(dāng)擴(kuò)增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率比較比較一致一致不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測實(shí)時熒光定量實(shí)時熒光定量PCRPCR誤差分析誤差分析及及操作規(guī)范操作規(guī)范1、誤差分析（1）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差 熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差； 2 -CT法由于也是一種近似的算法，所以

12、不可避免的也會引起誤差； Taqman探針法誤差相對較小； 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差 測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時，分光光度計(jì)的誤差，從光密度值到質(zhì)量再到摩爾量，誤差本身就很大； 定量PCR儀的誤差，耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差 樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤差。2、操作規(guī)范 熒光定量PCR是一項(xiàng)對操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時又是花費(fèi)很高的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達(dá)到這個目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。（1

13、）、樣品的處理及選取 處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。（2）、核酸提取 加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計(jì)檢測核算質(zhì)量，RNA OD260/280左右，DNA OD260/280左右，最好再做電泳檢測；同一樣品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反

14、轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得cDNA要用看家基因檢測。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。（7）、重復(fù)操作 讓重復(fù)操作最大的修正偏差。最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時就重復(fù)，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因?yàn)槲覀兪前裄NA提取、

15、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測三步做了重復(fù)，這樣得出的平均值要比只在上機(jī)檢測時對同一cDNA樣品做三個重復(fù)要有意義的多。 同一個cDNA樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除加樣時的誤差，排槍加樣時，誤差很小，加樣時的誤差可以通過設(shè)幾個重復(fù)檢測出來。同一cDNA樣品的三個重復(fù)模板濃度越低，染料法的誤差越大。如圖一系列梯度稀釋的模板，理論上它們在擴(kuò)增曲線上的CT值之差，應(yīng)該相等，但是后邊幾個濃度低的樣品CT值明顯提前了，由熔解曲線可知對于濃度低的樣品，引物二聚體引起的誤差非常嚴(yán)重。實(shí)驗(yàn)中污染的防控1、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染源的分析（1）、PCR產(chǎn)物引起的污染 在檢測過程中，熒光定量PCR產(chǎn)物都是封閉在PC

16、R管中的，不存在開管檢測，所以有污染的話，最有可能是因?yàn)殡娪緳z測熒光定量PCR產(chǎn)物時引起的污染，只要將電泳室與PCR加樣室隔離開，就能有效的避免PCR產(chǎn)物的污染。（2）、標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 常用的標(biāo)準(zhǔn)品有含有目的基因的質(zhì)粒、純化后的PCR產(chǎn)物等，由于標(biāo)準(zhǔn)品的濃度是一系列從高到低梯度稀釋的，所以在稀釋過程中，有可能引起污染。（3）、高濃度的樣品引起的污染 高濃度的陽性樣品在加樣過程中可能會形成氣溶膠，造成污染。2、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中污染的防控（1）、對于PCR產(chǎn)物引起的污染 最簡單有效地辦法就是將電泳室與加樣室徹底隔離開，做到每個房間都有專屬的移液器，做到移液器專用；或者采用dU代替dT配合UNG酶，是解決PCR產(chǎn)物污染的有效辦法，但是成本較高。（2）、對于標(biāo)準(zhǔn)品引起的污染 目前只能是以預(yù)防，加標(biāo)準(zhǔn)品時最好采用專用移液器，不要和加樣的移液器交叉使用，加標(biāo)準(zhǔn)品時最好在通風(fēng)廚中進(jìn)行，和加樣的操作臺隔離開。（3）、對于樣品間的檢查污染 樣品間的交叉污染往往是因?yàn)楦邼舛鹊臉悠吩诩訕邮倚纬闪藲馊苣z，因?yàn)闃悠返腸DNA鏈較長，經(jīng)常開紫外燈，把長鏈c