慢病毒包裝濃縮純化滴度試驗步驟

1、一、包裝細胞293T細胞的培養(yǎng)一、293T細胞的凍存1 .隨著傳代的次數(shù)增加，293T細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降，出現(xiàn)突變等。所以要在細胞購進時就進行凍存。2 .在細胞對數(shù)生長期進行凍存，增加細胞復(fù)蘇成活率。3 .倒去細胞上清液，加入D-Hank's液洗去殘留的培養(yǎng)基。4 .加入0.25%的胰酶，消化10-20S后倒去。5 .鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻。6 .細胞計數(shù)。7 .將細胞離心，1000rpm,2min。8 .根據(jù)計數(shù)結(jié)果加入細胞凍存液（70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO）重懸細胞，密度為3X106個/ml。10.第二天將細胞放入液氮灌，

2、并記錄。二、293T細胞的傳代1 .當細胞生長至匯合率達到8090%需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。2 .消化細胞，方法同上。3 .細胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。密度為3X105個/ml。4 .分到10cm培養(yǎng)皿中，10ml/皿。三、293T細胞的復(fù)蘇1 .當細胞傳代次數(shù)過多（超過50代），細胞狀態(tài)變差時或細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對開始凍存的細胞進行復(fù)蘇。2 .打開水浴鍋，設(shè)置溫度為40Co3 .查看細胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮灌中取出凍存的細胞（需戴上棉手套，防止被凍傷），迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，在12min內(nèi)使細胞溶液完全溶解。4 .將1ml細

3、胞溶液加入9ml完全培養(yǎng)基中并混勻后轉(zhuǎn)入10cm培養(yǎng)皿。5 .放回37C、3%CO2和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 .第二天觀察細胞存活率。倒掉舊的培養(yǎng)基，加入10ml新鮮培養(yǎng)基。二、慢病毒的包裝、濃縮和滴度測定1. 所用病毒檢測引物為WPRE特異引物，序列如下5'-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3'(forwardprimer),5'-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3'(reverseprimer)and5'-FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-3'(probe),cat.no.,ca

4、t.no.2. TaqManUniversalPCRMasterMix(AppliedBiosystems4304437)3. TaqManDNATemplateReagentKit(AppliedBiosystems401970)cat.no.4316844)SunBioIVVictor,加研vIraPackagingCel4. TaqManRNasePcontrolreagent(AppliedBiosystems用于包裝的293T細胞的培養(yǎng)用于包裝的293T細胞(ATCCNo.CRL-11268)必需選擇處于生長旺盛期，細胞狀態(tài)較佳，存活率90%以上，細胞邊緣清晰，傳代次數(shù)較低。任何時候

5、細胞匯合率都不準達到100%。慢病毒的包裝1 .預(yù)先準備3個T150瓶的293T細胞，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS,1%Glutamax,1%青霉素-鏈霉素。2 .將細胞分到12分到12個T150瓶中，每瓶的細胞密度是8X106個。3 .第二天，鏡下檢查細胞。細胞融合度應(yīng)大致為30-40%,分布均勻。4 .轉(zhuǎn)染前1小時，取出細胞板，去除原有細胞培養(yǎng)基，加入20ml的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細胞送回培養(yǎng)箱。5 .取兩支無菌的50ml離心管，其中一支中加入252gpNLEGFP/CMV/WPREDU3載體質(zhì)粒，168pgpCD/NL-BH*DDD包裝質(zhì)粒和84pgpLTR-G質(zhì)粒，用Opti-

6、MEM培養(yǎng)基補齊到18ml。另一支中加入500口Trans-EZ溶液和17.5mlOpti-MEM培養(yǎng)基，用電動移液器輕輕混勻。將Trans-EZ稀釋液滴加到質(zhì)粒管中，邊加邊輕輕晃勻。關(guān)鍵步驟：推薦使用Qiagen質(zhì)粒大抽試劑盒或相當?shù)脑噭┖兴苽涞馁|(zhì)粒。6 .室溫孵育20分鐘，使DNA和Trans-EZ充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合體。7,取1支5ml的移液管，將得到的DNA-Trans-EZ復(fù)合體均勻滴加入到細胞培養(yǎng)板中，每板3ml。來回晃動培養(yǎng)板，混勻后放回到5%二氧化碳培養(yǎng)箱。每一皿細胞培養(yǎng)盤不要超過6盤。8 ,6小時后，移去細胞上清，更換為17ml的DMEM完全培養(yǎng)基。9 .轉(zhuǎn)染后一天觀察細胞

7、，所有的細胞應(yīng)當都是健康的并且密度接近60-80%。如果所轉(zhuǎn)染質(zhì)粒帶有GFP熒光，那么這時候可以看到大于95%的細胞都是帶有熒光的。10,將細胞送回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2天（36-48小時）。在這個過程中，細胞會逐漸融合形成多核體，大多數(shù)的細胞依然貼壁。11.收集所有的上清，分裝到50ml離心管中。12.4C,500g離心10分鐘，除去脫落的細胞和大的細胞碎片。13.總的上清約為204ml,用250-ml0.45科mPVDF濾裝置過濾。如果發(fā)現(xiàn)濾膜被堵住，表現(xiàn)為過濾速度變慢，更換新的濾器。1,取6個Ultra-clearSW28外燈繼續(xù)消毒30分鐘。慢病毒的濃縮與純化方法一超速離心沉淀法離心管，用7

8、0%乙醇消毒后，放在超凈工作臺中打開紫2.每個Ultra-clearSW28離心管中加入約32ml的預(yù)先處理的病毒上清液。3,取一支10ml的移液管，吸取12ml20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部，緩慢將蔗糖溶液打出4ml。同樣地，將剩下8ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個離心管中。另取一支干凈的移液管，對剩下3管進行同樣處理。4,用PBS調(diào)整各管的重量，使對應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過0.1g。5,按次序?qū)⑺?個離心管放入BeckmanSW28超速離心轉(zhuǎn)頭中。7.小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出。倒掉上清，將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應(yīng)當有可見

9、的沉淀。8,每管中加入100ml不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。9,將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中，蓋上蓋子。10.在4c溶解2小時，每隔20分鐘輕輕震蕩。11.4C,500g離心1分鐘，使溶液集中于管底。12,用200科l移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個SW28離心管中。13.集中后的病毒懸液分裝成50科l每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80C。方法二PEG-8000濃縮法PEG（聚乙二醇）是高分子聚合物，具有高親水性，在溶液中會吸收大量水分，減少病毒之間的距離，使病毒與病毒能夠很容易的聚合在一起，病毒的相對濃度提高，達到沉淀濃縮的目

10、的。5XPEG8000+NaCl配制稱取NaCl8.766g;PEG800050g溶解在200mlMilli-Q純水中；121攝氏度30min濕熱滅絕30min;保存在4C。1,使用0.45濾頭過濾慢病毒上清液；3,每2030min混合一次，共進行3-5次；4. 4度放置過夜；5. 4度，4000g,離心20min;6. 吸棄上清，靜置管子12分鐘，吸走殘余液體；7,加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；8.集中后的病毒懸液分裝成50科每份，保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲存在-80C病毒滴度的測定稀釋計數(shù)法滴度單位：TU/ml,指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)。"TU

11、9;為"transducingunits”的縮寫，中文為轉(zhuǎn)導(dǎo)單位”，表示可以感染并進入到靶細胞中的病毒基因組數(shù)。第一天細胞準備將生長狀態(tài)良好的293T細胞消化計數(shù)后稀釋至1X105/ml,加入96孔板，100科l磯，為每個病毒準備10個孔。放入37C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加病毒在EP管中做10倍梯度稀釋，連續(xù)10個稀釋度。稀釋方法如下：每種病毒準備10個1.5mlEP管，每管加入90培養(yǎng)液，往第一個管中加入10“病毒原液，混勻后，吸取10dl加入第二個管混勻。依此類推，做十個稀釋度（1010-8）。吸取96孔板中原有的培養(yǎng)基，加入含稀釋好的病毒液。并做好標記。第三天追加培養(yǎng)

12、液在每個孔再加入100dl完全培養(yǎng)液，利于細胞的生長。第五天觀察結(jié)果并計算滴度在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，并數(shù)出最后兩個有熒光的熒光細胞克隆數(shù)。假設(shè)為X和Y,則滴度（TU/ml）=（X+Y*10）*1000/2/X孔的病毒液的含量（科）。定量PCR法病毒感染1天前，取6孔板接種HOS細胞。每孔細胞為5X104個。接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數(shù)板計數(shù)，確定感染時細胞的實際數(shù)目，記為N。棄去其他培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，更換為含有5g/mlpolybrene的新鮮培養(yǎng)基。將濃縮病毒用培養(yǎng)基稀釋200倍，也就是取11病毒加入到199（11的培養(yǎng)基中。在3個培養(yǎng)孔中分別加入0.51,5dl和50dl

13、的稀釋病毒。感染開始后20小時，除去培養(yǎng)上清，換為500"含DNaseI（TakaraMirusBio,終濃度為10U/ml）的新鮮培養(yǎng)基。在37C消化15分鐘，這一步是要除去殘余的質(zhì)粒DNA。然后換為2ml正常的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。用0.5ml0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37c放置1分鐘。用培養(yǎng)基吹洗下，離心收集細胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200dl洗脫液洗下DNA。用DNA定量試劑盒定量(Bio-Rad)?；蚪MDNA可以穩(wěn)定保存在-20C至少2個月。準備PCR所需的試劑和樣品。為病毒序列檢測引物配總管I:2xTaqMan

14、MasterMix25glxnForwardprimer(100pmolml-1)0.1glxnReverseprimer(100pmolml-1)0.1glxnProbe(100pmolml-1)0.1glxnH2O19.7glxnn=numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將1ml2xTaqManUniversalPCRMasterMix,4lforwardprimer,4lreverseprimer,4lprobe和788lH2O混和。震蕩后放在冰上。為人基因組序列檢測引物配總管n：2xTaqManMasterMix25glxn10xRNasePprimer/probe

15、mix2.5gxnH2O17.5gxnn=numberofreactions.例如：總反應(yīng)數(shù)為40,將1ml2xTaqManUniversalPCRMasterMix,100l10xRNasePprimer/probemix和700lH2O混和。震蕩后放在冰上。在預(yù)冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管I中各取45科1加入到A-D各行的孔中，從總管II中各取45口加入到E-G各行的孔中。分別取5口質(zhì)粒標準品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復(fù)1、次。另留1個孔加入51的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。分別取5n基因組標準品和待測樣品基因組DNA

16、加入到E-G行中，每個樣品重復(fù)1次。另留1個孔加入51的水做為無模板對照(no-templatecontrol)。所使用定量PCR儀為ABIPRISM7000定量系統(tǒng)。循環(huán)條件設(shè)定為：50C2分鐘,95C10分鐘，然后是95C15秒，60C1分鐘的40個循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數(shù)用基因組數(shù)加以標定，得到每基因組整合的病毒拷貝數(shù)。滴度（integrationunitsperml,IUml-1）的計算公式如下：IUml-1=（CNXDX1000）/V其中：C=平均每基因組整合的病毒拷貝數(shù)5、N=感染時細胞的數(shù)目（約為1X10）D=病毒載體的稀釋倍數(shù)V=加入的稀釋病毒的

17、體積數(shù)慢病毒的儲存與稀釋慢病毒的儲存1 .病毒的運輸采用干冰保溫，收到病毒液后若幾天內(nèi)用于實驗，可于4c保存（于一周內(nèi)用完）。2 .若病毒量較大，需長期保存。則根據(jù)每次實驗用量分裝后放于-80C冰箱。一般病毒可以放于-80C約12個月以上，但若超過6個月后使用，請重新檢測病毒滴度。3 .避免反復(fù)凍融，否則會降低病毒滴度。每次凍融會降低病毒滴度10%。慢病毒的稀釋需要稀釋病毒時，將病毒取出后置于冰上融解，用細胞培養(yǎng)用D-Hank's、PBS或培養(yǎng)基稀釋到所需濃度后混勻分裝后4c保存，并盡快用于實驗（于一周內(nèi)用完）。慢病毒在細胞水平的使用什么是MOI?"MOI為"mul

18、tiplicityofinfection的縮寫，中文為感染復(fù)數(shù)”或復(fù)感染指數(shù)”，含義為感染時病毒和細胞數(shù)量的比值，即平均每個細胞感染的病毒活性單位數(shù)（TUnumber/cell）。在實驗中將某種細胞感染達到80%時的MOI定義為這種細胞的MOI。MOI與整合事件以及目的基因的表達相關(guān)。一定范圍內(nèi)，表達水平和MOI呈正相關(guān)。MOI取決于多種因素，如細胞狀態(tài)，目的基因的大小與性質(zhì)，細胞的感染效率等。所以，實驗前需查閱相關(guān)文獻，確定慢病毒對目的細胞的親嗜性、MOI以及在體（invivo）注射所需病毒量。若無文獻支持，可以通過預(yù)實驗得到合適的MOI。實際上，即使有文獻支持，但由于所用細胞代數(shù)、細胞狀態(tài)

19、以及目的基因的差異，實際的MOI和文獻報道也會不同，所以要安排預(yù)實驗以確定所需MOI以及病毒對細胞生長的影響。目的細胞感染預(yù)實驗及實驗體系的放大實驗?zāi)康模捍_定細胞感染所需的MOI,以及是否需要添加感染增強劑Polybrene實驗材料：96孔板，1.5mlEP管，長勢良好的目的細胞一瓶，已知滴度的慢病毒溶液，Polybrene110mg/ml）,目的細胞培養(yǎng)基等。第一天：細胞準備將長勢良好的目的細胞接種到96板，消化好細胞（懸浮細胞不需要消化，直接離心收集細胞后加新鮮培養(yǎng)基重懸即可）后把濃度調(diào)為3X1045X104個/ml,按90口/孔加入。接種細胞數(shù)量因細胞的生長速度而略有不同，一般是保證第二天進行病毒感染時細胞匯合率介于3050%之間。第二天：病毒感染感染實驗分兩組，一組直接添加病毒液，一組同時添加Polybrene。病毒稀釋方法同病毒滴度測定時方法，10倍倍比稀釋，共三個稀釋度，MOI值依次為100,10和1（細胞經(jīng)過一天的生長數(shù)量約為1X104個/孔，對應(yīng)的病毒數(shù)量為1X106TU、1X105TU和1X104TU）。每個MOI值加兩個孔，取出一組加入感染增強劑，比例為1:2000,終濃度為5（ig/mlo第二天：換液感染實驗同一天，8-12小時后，棄去上清液，更換為新鮮培養(yǎng)基，100dl/孔。第五天：觀察熒光表達情況在倒置熒光顯微鏡下觀察熒