電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)用和電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)用

1、電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)用和電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)應(yīng)用概述概述 電鏡細胞化學(xué)技術(shù)電鏡細胞化學(xué)技術(shù) 電鏡細胞化學(xué)技術(shù)電鏡細胞化學(xué)技術(shù)是電鏡技術(shù)與細胞化學(xué)技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新技術(shù)，也稱超微結(jié)構(gòu)細胞化學(xué)。 目的：目的：將化學(xué)研究與形態(tài)觀察相統(tǒng)一，要求在細胞超微結(jié)構(gòu)水平上研究細胞內(nèi)各種生化物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、脂肪、碳水化合物等）的定位情況以及這些生化物質(zhì)在細胞內(nèi)的動態(tài)變化，用以闡明細胞、細胞器結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系。 電鏡細胞化學(xué)技術(shù)主要包括：電鏡細胞化學(xué)技術(shù)主要包括： 電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù) 電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù) 特異酶消化印證技術(shù) 電鏡放射自顯影技術(shù) 電鏡原位雜交技術(shù) 超微示蹤技術(shù)等第一節(jié)第一節(jié) 電鏡酶細胞

2、化學(xué)技術(shù)電鏡酶細胞化學(xué)技術(shù) 目的：目的： 在超微形態(tài)保存良好的組織上，在酶存在的部位在超微形態(tài)保存良好的組織上，在酶存在的部位顯示酶活性。側(cè)重于顯示細胞器的標志酶及其動態(tài)顯示酶活性。側(cè)重于顯示細胞器的標志酶及其動態(tài)變化。變化。 目前能在電鏡下定位的酶有三大類即目前能在電鏡下定位的酶有三大類即水解酶、氧化酶和轉(zhuǎn)移酶水解酶、氧化酶和轉(zhuǎn)移酶 電鏡酶細胞化學(xué)與光鏡酶組織化學(xué)的比較：電鏡酶細胞化學(xué)與光鏡酶組織化學(xué)的比較：光鏡酶組織化學(xué)光鏡酶組織化學(xué) 電鏡酶細胞化學(xué)電鏡酶細胞化學(xué)分辨率低分辨率低 分辨率高分辨率高難于鑒別細胞器和酶的精確位置難于鑒別細胞器和酶的精確位置 易于鑒別和定位易于鑒別和定位反應(yīng)產(chǎn)物

3、為有色沉淀反應(yīng)產(chǎn)物為有色沉淀 反應(yīng)產(chǎn)物必需有高電子密度反應(yīng)產(chǎn)物必需有高電子密度可顯示可顯示100100多種酶多種酶 可顯示可顯示4040余種酶余種酶電鏡酶細胞化學(xué)的基本原理電鏡酶細胞化學(xué)的基本原理酶細胞化學(xué)反應(yīng)酶細胞化學(xué)反應(yīng) 酶酶+底物底物 初級反應(yīng)產(chǎn)物初級反應(yīng)產(chǎn)物 最終反應(yīng)產(chǎn)物最終反應(yīng)產(chǎn)物 （可溶性） （不溶性）常用捕捉劑有：重金屬（鉛、鋇、銅）鹽、重氮鹽、常用捕捉劑有：重金屬（鉛、鋇、銅）鹽、重氮鹽、二氨基聯(lián)苯胺等。二氨基聯(lián)苯胺等。 。 電鏡酶細胞化學(xué)反應(yīng)的主要方法電鏡酶細胞化學(xué)反應(yīng)的主要方法 酶作用于底物，底物之一為生理底物，在反應(yīng)中被酶作用于底物，底物之一為生理底物，在反應(yīng)中被氧化，底

4、物之二為捕捉底物，在反應(yīng)中被還原，被還氧化，底物之二為捕捉底物，在反應(yīng)中被還原，被還原的捕捉底物與加入的重金屬捕捉劑形成金屬鹽沉淀。原的捕捉底物與加入的重金屬捕捉劑形成金屬鹽沉淀。 琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶 琥珀酸鹽琥珀酸鹽 鐵氰化物鐵氰化物 延胡索酸鹽延胡索酸鹽 亞鐵氰化物亞鐵氰化物 CuCu2+2+ 亞鐵氰化銅（高電子密度）亞鐵氰化銅（高電子密度）（2 2）非金屬有機化合物沉淀法）非金屬有機化合物沉淀法常用底物為常用底物為-醋酸萘酚、萘酚AS-葡萄糖苷酸、 -萘酚磷酸鈣等萘酚系列衍生物。用于顯示糖苷酶、磷酸酶、酯酶糖苷酶、磷酸酶、酯酶等。初級產(chǎn)物：萘酚萘酚萘酚+ +捕捉劑重氮鹽捕捉劑重氮鹽

5、 偶氮色素偶氮色素（3 3）鋨化法）鋨化法嗜鋨物質(zhì)生成法嗜鋨物質(zhì)生成法 在酶作用下，生成在酶作用下，生成“嗜鋨嗜鋨”性捕捉底物，經(jīng)鋨酸作用性捕捉底物，經(jīng)鋨酸作用后形成高電子密度的鋨黑后形成高電子密度的鋨黑電鏡酶細胞化學(xué)的常規(guī)操作流程電鏡酶細胞化學(xué)的常規(guī)操作流程 酶細胞化學(xué)技術(shù)包括三個基本過程：酶細胞化學(xué)技術(shù)包括三個基本過程：酶的固定，酶的固定，使酶固定在組織細胞所在部位，防止移位；使酶固定在組織細胞所在部位，防止移位；酶的特酶的特異性反應(yīng)；異性反應(yīng)；使反應(yīng)產(chǎn)物在顯微鏡下可見。第一過程使反應(yīng)產(chǎn)物在顯微鏡下可見。第一過程在樣品制備中完成，后兩個過程包含在孵育反應(yīng)中。在樣品制備中完成，后兩個過程包含

6、在孵育反應(yīng)中。 取材（取材（3 38mm8mm） 固定（酶固定固定（酶固定+ +結(jié)構(gòu)固定）結(jié)構(gòu)固定） 切組織片（切組織片（40-60um40-60um） 孵育（酶反應(yīng)孵育（酶反應(yīng)+ +捕捉反應(yīng)）捕捉反應(yīng)） 脫水、包埋脫水、包埋 超薄切片超薄切片 電鏡觀察電鏡觀察 1 1、固定：常規(guī)固定液選取、固定：常規(guī)固定液選取2.5%2.5%戊二醛和戊二醛和4%4%多聚甲醛多聚甲醛混合液作為固定液，根據(jù)不同酶的特性，也可以單混合液作為固定液，根據(jù)不同酶的特性，也可以單獨使用其中一種作為固定液。獨使用其中一種作為固定液。 選擇固定劑選擇固定劑 原則上優(yōu)先考慮保存酶活性，一般采用醛類固定劑。原則上優(yōu)先考慮保存酶

7、活性，一般采用醛類固定劑。甲醛對酶活性的保存優(yōu)于戊二醛，但對細胞超微結(jié)構(gòu)甲醛對酶活性的保存優(yōu)于戊二醛，但對細胞超微結(jié)構(gòu)的保存略差。戊二醛對細胞的超微結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于甲的保存略差。戊二醛對細胞的超微結(jié)構(gòu)的保存優(yōu)于甲醛，為發(fā)揮二者的長處，可采用甲醛戊二醛混合固定醛，為發(fā)揮二者的長處，可采用甲醛戊二醛混合固定液。液。固定的溫度與時間固定的溫度與時間 固定液的使用溫度一般是固定液的使用溫度一般是0-40-4。固定時間視目標酶。固定時間視目標酶對固定劑的敏感程度而定對固定劑的敏感程度而定緩沖液緩沖液 一般固定液需要用緩沖液配置，具體使用一般固定液需要用緩沖液配置，具體使用何種緩沖液要看具體酶的性質(zhì)而定。常

8、用的緩沖何種緩沖液要看具體酶的性質(zhì)而定。常用的緩沖液有醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、液有醋酸緩沖液、磷酸緩沖液、TrisTris緩沖液以及緩沖液以及二甲砷酸鈉緩沖液等。二甲砷酸鈉緩沖液等。 2 2、切片：一般采用組織切片機進行切片，厚度在、切片：一般采用組織切片機進行切片，厚度在40406060m m，也可以用冰凍切片機切片。，也可以用冰凍切片機切片。3 3、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進行漂洗、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進行漂洗3 3次，每次次，每次1010分鐘。分鐘。 4 4、孵育：孵育時必須在使用前配置新鮮孵育液。、孵育：孵育時必須在使用前配置新鮮孵育液。將切片放入孵育液內(nèi)，在震蕩式恒溫水浴箱中

9、孵將切片放入孵育液內(nèi)，在震蕩式恒溫水浴箱中孵育，孵育溫度一般為育，孵育溫度一般為3737。孵育時間因器官和酶。孵育時間因器官和酶的種類不同而有很大差異的種類不同而有很大差異( (具體時間見各種酶的具體時間見各種酶的孵育液的配方及孵育方法孵育液的配方及孵育方法) )。 孵育液的組成孵育液的組成 濃度充分的酶作用底物、捕捉劑、酶激活劑，對濃度充分的酶作用底物、捕捉劑、酶激活劑，對照試驗應(yīng)再加抑制劑。照試驗應(yīng)再加抑制劑。 孵育液配制的要求孵育液配制的要求 所用器皿應(yīng)十分清潔；所用器皿應(yīng)十分清潔； 用前新配制；用前新配制； 按處方順序依次加入試劑；按處方順序依次加入試劑； 調(diào)整調(diào)整PHPH至酶作用的最

10、適值。至酶作用的最適值。5 5、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進行漂洗、漂洗：用配置孵育液的緩沖液進行漂洗3 3次，每次次，每次1010分鐘，然后用分鐘，然后用0.1M0.1M二甲砷酸鈉緩沖液漂洗二甲砷酸鈉緩沖液漂洗3 3次，次，每次每次1010分鐘，所用緩沖液要保持在分鐘，所用緩沖液要保持在44左右。左右。6 6、后固定：用、后固定：用0.1M0.1M二甲砷酸鈉緩沖液配置的二甲砷酸鈉緩沖液配置的1%1%鋨酸固鋨酸固定定1 1小時。小時。7 7、脫水、浸透、包埋、切片同常規(guī)超薄切片制作。、脫水、浸透、包埋、切片同常規(guī)超薄切片制作。8 8、電鏡觀察：超薄切片經(jīng)烘干后直接進行電鏡觀、電鏡觀察：超薄切片

11、經(jīng)烘干后直接進行電鏡觀察。如果反差不好，可以進行鉛察。如果反差不好，可以進行鉛鈾雙重染色，鈾雙重染色，但必須有不染色的切片對照。但必須有不染色的切片對照。須注意須注意 固定切記固定切記“兼顧、協(xié)調(diào)兼顧、協(xié)調(diào)”原則，過強的固定造成酶的原則，過強的固定造成酶的活性損失，固定太弱又造成細胞結(jié)構(gòu)保存不良?；钚該p失，固定太弱又造成細胞結(jié)構(gòu)保存不良。 因鋨酸能使大多數(shù)酶活性喪失，故禁忌在酶細胞化學(xué)因鋨酸能使大多數(shù)酶活性喪失，故禁忌在酶細胞化學(xué)反應(yīng)前使用；反應(yīng)前使用； 通常用通常用0.5-2%0.5-2%戊二醛或戊二醛或4%4%多聚甲醛多聚甲醛44固定固定2 2小時小時左右（但葡萄糖左右（但葡萄糖-6-6-

12、磷酸酶、琥珀酸脫氫酶只能固定磷酸酶、琥珀酸脫氫酶只能固定幾分鐘）。也可用多聚甲醛幾分鐘）。也可用多聚甲醛-戌二醛固定。戌二醛固定。 可通過改變固定的時間、溫度、固定劑的種類和濃度可通過改變固定的時間、溫度、固定劑的種類和濃度調(diào)整固定的效果。調(diào)整固定的效果。 第二節(jié)第二節(jié) 電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)常規(guī)電鏡：形態(tài)結(jié)構(gòu)常規(guī)電鏡：形態(tài)結(jié)構(gòu)免疫學(xué)方法：免疫學(xué)方法： 組分組分免疫電鏡：形態(tài)結(jié)構(gòu)免疫電鏡：形態(tài)結(jié)構(gòu)+ +組分組分免疫電鏡延伸了免疫光鏡免疫電鏡延伸了免疫光鏡細菌，冰凍超薄切片，免疫標記腺苷酸環(huán)化酶，醋酸鈾染色 電鏡免疫細胞化學(xué)：簡稱免疫電鏡，是利用抗原電鏡免疫細胞化學(xué)：簡稱免疫電

13、鏡，是利用抗原抗體特異結(jié)合的原理，在組織細胞原位顯示抗原抗體特異結(jié)合的原理，在組織細胞原位顯示抗原或抗體大分子的方法?；蚩贵w大分子的方法。標記抗體標記抗體 雖然抗原抗體結(jié)合是特異的，但卻是不可見的，在電鏡下也難以檢測到。所以就有人提出了在抗體上結(jié)合標記物，這里要求抗體與標記物結(jié)合后，仍保持相應(yīng)的生物活性，仍能與組織細胞相應(yīng)抗原發(fā)生特異反應(yīng)。這種抗體與標記物連接就稱為抗體標記。這種抗體與標記物連接就稱為抗體標記。 標記抗體的方法：標記抗體的方法：1 1、酶標記法，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、酶標記法，如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、 葡葡萄糖氧化酶等。萄糖氧化酶等。2 2、鐵蛋白標記法、鐵蛋白標

14、記法 3 3、重金屬標記法，如膠體金、重金屬標記法，如膠體金4、同位素標記法5、熒光標記法 根據(jù)標記方法的不同， 電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)分為免疫酶標技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和免疫鐵蛋白技術(shù)。過氧化物酶標記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)過氧化物酶標記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù) 原理： 利用偶聯(lián)劑將酶與抗體結(jié)合，形成酶標抗體，在抗原與酶標抗體反應(yīng)后，再利用酶與底物作用生成電子密度高的沉淀物，從而可以在電鏡下檢出抗原反應(yīng)部位。 用以標記抗體的酶要具備以下條件：用以標記抗體的酶要具備以下條件：1.1.與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）與抗體（或抗原）結(jié)合后，仍能保持酶和抗體（或抗原）的生物活性。的生物活性。

15、2.2.酶的純度高、特異性強、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價。酶的純度高、特異性強、穩(wěn)定、可溶性好、敏感、廉價。3.3.在體液或組織中不存在該酶的底物。在體液或組織中不存在該酶的底物。酶標技術(shù)中最常用的標記酶是辣根過氧化物酶（酶標技術(shù)中最常用的標記酶是辣根過氧化物酶（HRPHRP）標記抗體法標記抗體法1.1.制備過氧化物酶標記的抗體制備過氧化物酶標記的抗體 抗體與過氧化物酶偶聯(lián)的過程，方法有兩種：抗體與過氧化物酶偶聯(lián)的過程，方法有兩種：戊二醛法：以戊二醛為偶聯(lián)劑，形成戊二醛法：以戊二醛為偶聯(lián)劑，形成HRP-HRP-戊二醛戊二醛- -抗體復(fù)合物?？贵w復(fù)合物。過碘酸鹽法：過碘酸鹽法：HRPHRP中的中

16、的18%18%的糖基與酶活性無關(guān)，借助碘的糖基與酶活性無關(guān)，借助碘化作用將之氧化為醛，再通過醛基與抗體分子的氨基化作用將之氧化為醛，再通過醛基與抗體分子的氨基結(jié)合。結(jié)合。2.2.免疫染色免疫染色直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應(yīng)抗原反直接法：用酶標抗體直接與標本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，爾后進行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在應(yīng)結(jié)合，爾后進行酶與底物反應(yīng)，終產(chǎn)物沉淀在抗原抗體反應(yīng)部位?？乖贵w反應(yīng)部位。間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標記的間接法：依次使用兩種不同抗體，先使用未標記的特異性抗體即第一抗體，后者與標本中的抗原反應(yīng)。特異性抗體即第一抗體，后者與標本中的抗原反應(yīng)。然后使用過氧化物酶標記

17、第二抗體，最后酶與底物然后使用過氧化物酶標記第二抗體，最后酶與底物反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。反應(yīng)，生產(chǎn)沉淀。標記抗體法標記抗體法 PAPPAP法法 ABCABC法法膠體金標記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)膠體金標記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)一、膠體金的概述一、膠體金的概述1、膠體金的概念、膠體金的概念 從物理化學(xué)角度來說，膠體金是指直徑從物理化學(xué)角度來說，膠體金是指直徑1-100nm的金顆粒所形成的分散系，即金以或大或小的的金顆粒所形成的分散系，即金以或大或小的微粒分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系。通常所說的微粒分散在另一種物質(zhì)中所形成的體系。通常所說的膠體金是指以微小粒子分散在水中形成的金水溶膠。膠體金是指以微小粒子分

18、散在水中形成的金水溶膠。 2、膠體金的特性 顏色：膠體金的顏色與金粒子的直徑有關(guān)，5-60nm時為紅色，95nm是為藍色，用于免疫細胞化學(xué)的膠體金呈紅葡萄酒色。 影響膠體金穩(wěn)定的因素： a.電解質(zhì) 少量有促進穩(wěn)定的作用，過量則破壞 b.膠體金的濃度 濃度越高容易導(dǎo)致膠體金凝集 c.溫度 長時間加熱可使穩(wěn)定性有所下降二、膠體金標記和染色二、膠體金標記和染色 1.膠體金標記 在一定條件下，膠體金與蛋白質(zhì)混合后可以牢固結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，這個過程稱為標記。其實就是蛋白質(zhì)吸附在膠體金表面的過程。它們的結(jié)合主要是物理作用，所以很少引起蛋白質(zhì)活性的變化。 膠體金吸附蛋白質(zhì)與膠體金吸附蛋白質(zhì)與PHPH值有

19、關(guān)，在接近蛋白質(zhì)等電值有關(guān)，在接近蛋白質(zhì)等電點或略偏堿的情況下，兩者形成老固的復(fù)合物。點或略偏堿的情況下，兩者形成老固的復(fù)合物。2.電鏡免疫金染色 用于電鏡的免疫金法可以采用包埋前染色和包埋后染色，可根據(jù)抗原的性質(zhì)加以選擇。 染色方法也有直接法和間接法。雙標記菌毛上兩種抗原，膠體金5nm, 20nm鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)鐵蛋白標記電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù) 鐵蛋白標記抗體是由Singer（1959）首創(chuàng)的一種免疫細胞化學(xué)技術(shù)。這技術(shù)曾廣泛應(yīng)用于病毒和細胞表面抗原的檢測。鐵蛋白作為電鏡觀察的標記物，具有顆粒大、分辨率高、散射力強的特點，可用于細胞膜表面抗原的準確定位。所以，雖然40年后的今天已

20、發(fā)展了多種免疫電鏡細胞化學(xué)技術(shù)，但鐵蛋白標記法仍然是一種基本技術(shù)。 基本原理：基本原理： 鐵蛋白是一種直徑鐵蛋白是一種直徑101012nm12nm的球形的蛋白質(zhì)（分子的球形的蛋白質(zhì)（分子量量450kD450kD）, ,它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約它含有致密的鐵膠粒核心（直徑約7.5nm7.5nm），），該核心含該核心含2000200050005000個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成個鐵原子，分布于四個區(qū)域，形成四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電四個圓形致密區(qū)，具有很高的電子密度，因此可用于電鏡觀察?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的偶聯(lián)劑形成抗體鏡觀察?？贵w與鐵蛋白通過低分子量的偶聯(lián)劑形

21、成抗體- -鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同鐵蛋白復(fù)合物，此復(fù)合物既保留抗體的免疫活性，同時因為鐵蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡時因為鐵蛋白含有高電子密度的鐵膠粒核心，便于電鏡觀察。觀察。 電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)的標本處理原則電鏡免疫細胞化學(xué)技術(shù)的標本處理原則一、取材與固定一、取材與固定 取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織取材原則與常規(guī)電鏡取材相同，力求保持組織新鮮，進行浸漬或灌注固定。新鮮，進行浸漬或灌注固定。 標本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要標本固定要求是既要保持組織成分的抗原性，又要保存細胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時固定隊抗原保存細胞的超微結(jié)構(gòu)。低濃度的甲醛短時固定隊抗原性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)保存又受影響。一般采用性保存好，但是超微結(jié)構(gòu)