慢性粒細胞白血病發(fā)病機制

1、慢性粒細胞白血病發(fā)病機制干細胞的定義和性質(zhì) 如造血干細胞，干細胞特性是慢性粒細胞白血病干細胞的基本屬性。CML干細胞來源于獲得BCR-ABL突變的造血干細胞，能夠自我更新和保持惰性的CP。在這個階段，CML干細胞和分化的CML細胞功能、形態(tài)和表型幾乎沒有區(qū)別。 雖然自我更新的能力被認為是慢性粒細胞白血病干細胞的維持至關(guān)重要的，相關(guān)的機制和信號轉(zhuǎn)導途徑仍然不好定義。最近的研究表明，Wnt /-連環(huán)蛋白信號是維持正常和CML干細胞必不可少的。Hedgehog（Hh）信號已被證明為CML干細胞的擴增和維持是必要的；早幼粒細胞白血病蛋白（PML）在HSC維持中被證明起到關(guān)鍵作用。 CML患者干細胞和祖

2、細胞的表型與正常個體不同。例如，與正常祖細胞不同，血液循環(huán)大部分白血病的粒單核細胞集落形成單位（CFU-GMS）表達高水平的黏附受體CD44和低水平L-選擇素。白血病CD34 +細胞過度表達多藥耐藥表型的P糖蛋白。 許多抗凋亡蛋白是在CML中高表達，促進細胞耐藥。靜止期CD34+細胞表達過多Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1和XIAP。 造血干細胞的細胞的特點是細胞表面表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白，特別是ABCB1（P-糖蛋白）和BCG2(BCR-P)，能泵出特異性藥物。上面2種轉(zhuǎn)運蛋白均在CP CML患者的原始細胞被發(fā)現(xiàn)與正常細胞相比過表達。在CP CML患者原始細胞和正常細胞相比Oct-1的表達減

3、少，其是一種負責特定藥物吸收的轉(zhuǎn)運蛋白，包括伊馬替尼。ABCB1、ABCG2的表達增加和Oct-1表達下降的組合可能造成CML祖細胞對治療的反應差。 花生四烯酸5-脂氧合酶基因（Alox15/15-LO）是近年來發(fā)現(xiàn)的一個由BCR-ABL誘導的調(diào)節(jié)器，對伊馬替尼無反應，其對CML干細胞功能很重要。在缺乏 Alox15情況下，BCR-ABL不能誘導小鼠形成CML。此外，Alox15的缺失通過影響細胞分裂和細胞凋損傷LSC的功能，導致LSCs最終耗盡。在人類慢性粒細胞白血病細胞和CD34+細胞，Alox15的敲除或抑制15-LO均能顯著減少生存。Alox15的缺乏改變PTEN，PI3K/Akt和轉(zhuǎn)

4、錄因子ICSBP這些已知的癌癥發(fā)病介質(zhì)的表達。 最近的研究表明，F(xiàn)oxO因子是維持CML啟動細胞的關(guān)鍵; FOXO的活性被BCR-ABL1-AKT信號負調(diào)控，被TKI治療和Pten正調(diào)控。但是，通過該FOXO3A介導自我更新和CML起始細胞的維持機制，目前仍不清楚。最近有研究確定了BCL6原癌基因作為在CML-起始細胞自我更新信號的FOXO下游的關(guān)鍵效應物。 BCL6抑制 CML細胞中Arf和p53，并且其是白血病起始和集落形成必需的。 Notch信號是造血干細胞的自我更新和生存的關(guān)鍵。有研究對BCR-ABL和Notch信號的關(guān)系及Notch的表達模式及其下游靶基因Hes1在慢性期CML患者以

5、及和正常人的骨髓中（NBM）CD34+干細胞和祖細胞進行了評估。發(fā)現(xiàn)在原始的CD34 +Thy+亞型CML CD34 +細胞Notch1、Notch2和Hes1顯著升高，提示Notch信號在慢性粒細胞白血病原始細胞的活性。數(shù)據(jù)表明，伊馬替尼誘導的BCR-ABL的抑制導致了顯著Notch活性上調(diào)。同樣，Notch的抑制導致BCR-ABL過度活化。因此，確定了CML Notch和BCR-ABL之間的對立關(guān)系。 TKI治療CML干細胞能有效地抑制BCR-ABL激酶活性，這表明額外的激酶依賴的機制有助于LSC存活。人骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）的共培養(yǎng)顯著抑制TKI暴露下的CML干/祖細胞的細胞凋亡并

6、且使其保存下來，維持其克隆形成能力和植入免疫缺陷小鼠的潛力。研究發(fā)現(xiàn)，N-鈣粘蛋白受體在充間質(zhì)干細胞介導的TKI治療CML祖細胞保護中起著重要的作用。N-鈣粘蛋白介導的對間充質(zhì)干細胞粘附和增加的細胞質(zhì)N-鈣粘蛋白-連環(huán)蛋白復合物的形成以及增強的-連環(huán)蛋白的核轉(zhuǎn)位和轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。增加的外源性Wnt信號介導的-連環(huán)蛋白信號通路在MSC介導的TKI治療CML祖細胞的保護中發(fā)揮了重要作用。 其他最近的研究表明，腫瘤抑制基因PTEN在CML干細胞被bcr-abl表達下調(diào)，PTEN缺失加速小鼠CML白血病發(fā)展，證明了PTEN在白血病中調(diào)節(jié)干細胞的關(guān)鍵作用。CD34 +原始CML細胞的系統(tǒng)基因分析顯示多個信

7、號通路的激活，伴隨DNA修復的減少，異常的黏附和歸巢，以及激活的蛋白酶體蛋白信號通路。BCR-ABL 融合基因 CML原始細胞黏附（接觸和錨定）缺陷使其擺脫了在正常情況下通過細胞因子信使從微環(huán)境細胞中接收的控制信號的控制。這些信號維持細胞的存活、死亡、細胞增殖和細胞分化的平衡?？赡懿灰蕾嚴野彼峒っ傅募毎羌艿鞍椎漠惓Ａ姿峄?，被認為是引起CML細胞的整合功能紊亂的關(guān)鍵因素。 正常的9號染色體中ABL基因位于q34和qter之間，22號染色體的BCR和SIS的基因位于q11和qter之間。圖右為t（9; 22）。9號染色體的ABL被換位到22號染色體的M-BCR序列，22號染色體的末端部分被轉(zhuǎn)換到

8、9號染色體長臂上。22q-就是Ph染色體。 BCR，斷裂點集群區(qū)域; C-SIS，細胞病毒猿猴肉瘤病毒轉(zhuǎn)化基因; IGL，免疫球蛋白輕鏈基因。 9號染色體上ABL基因和22號染色體上的BCR基因突變是為慢性粒細胞白血病的發(fā)病關(guān)鍵 V-ABL是正常細胞ABL基因的同源病毒癌基因。該基因（v-abl）可在體外培養(yǎng)中誘導細胞惡性轉(zhuǎn)化，并在易感小鼠體內(nèi)誘發(fā)白血病。 上圖顯示的是正常的ABL和BCR基因BCR-ABL融合基因。圖中上半部分垂直箭頭表明在ABL可能斷點位置。注意上游緊隨的ABL 8604 met基因位。BCR基因含有25個外顯子，包括第一（e1）和第二（e2）外顯子。三個斷點簇區(qū)域的位置顯

9、示為，m-BCR，M-BCR，-bcr。該圖的下部顯示BCR-ABL信使RNA融合轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)。-bcr斷點導致BCR-ABL轉(zhuǎn)錄帶有e19a2連接點。在每一個發(fā)生斷裂的基因處有相關(guān)的數(shù)字代表外顯子位置。 CML患者的細胞株的ABL的基因被重排并有擴增。細胞株和新鮮分離的慢性粒細胞白血病細胞均含有延長的8-kb的異常RNA轉(zhuǎn)錄單位，它由留在22號染色體的BCR基因的5部分與從9號染色體易位來的基因ABL的3部分融合產(chǎn)生的新的嵌合基因轉(zhuǎn)錄而來。這一融合mRNA翻譯成一種獨特的210 kDa酪氨酸磷酸蛋白激酶（p210BCR-ABL），與v-abl蛋白產(chǎn)物作用相似，它可以對細胞蛋白酪氨酸殘基產(chǎn)生磷酸

10、化。 ABL的位點含有至少兩個等位基因，在正常細胞中，ABL原癌基因編碼一分子量145000的酪氨酸激酶，其僅僅被痕量翻譯，且在體外缺乏任何激酶活性。推測BCR-ABL基因表達的融合產(chǎn)物通過嵌合酪氨酸蛋白激酶的酶活性調(diào)節(jié)異常而導致惡性轉(zhuǎn)化。BCR-ABL融合基因構(gòu)建表明，BCR序列還可以激活微絲結(jié)合功能，酪氨酸激酶對肌動蛋白絲功能的修飾已經(jīng)被認為是白血病發(fā)生過程中的一個步驟。 22號染色體上的斷點區(qū)DNA延伸段很短，約5至6kb，延伸的DNA的被稱為斷裂簇區(qū)（M-BCR），這是個較長的斷裂點簇基因BCR。三個主要的斷點簇區(qū)在22號染色體上各有特征：主要（M-BCR），次要（m-BCR），以及微

11、（-bcr）。三種不同的斷點分別產(chǎn)生P210，P190，P230融合蛋白。絕大多數(shù)CML患者BCR-ABL融合基因編碼p210 kDa（p210BCR-ABL）的融合蛋白，其mRNA轉(zhuǎn)錄物有e14a2或e13a2融合連接方式。涉及易位時，“e”表示BCR的外顯子的和“a”表示ABL外顯子位點。 在大約50的Ph染色體陽性的急性淋巴細胞白血病病例中，其BCR-ABL轉(zhuǎn)錄為e1a2融合鏈接，它產(chǎn)生190 kDa的（p190BCR-ABL）BCR-ABL蛋白。幾乎所有的CML病例確診時編碼p210BCR-ABL，但也表達p190BCR-ABL轉(zhuǎn)錄。這些雙轉(zhuǎn)錄物的生物學和臨床意義尚不明確。 在未發(fā)現(xiàn)P

12、h染色體的病例中，BCR-ABL可能仍然位于染色體9（隱匿的Ph染色體）。BCR基因可以與富含Alu重復序列區(qū)域中復雜易位的11q13區(qū)帶里的不同基因位點再結(jié)合。ETV6 / ABL融合基因也已在BCR-ABL陰性CML中發(fā)現(xiàn)。BCR-ABL和信號轉(zhuǎn)導和信號轉(zhuǎn)導 現(xiàn)在已經(jīng)認為p210BCR-ABL酪氨酸磷酸化激酶活性是人類費城染色體陽性白血病發(fā)生的起因。與主要定位于細胞核中的ABL蛋白不同， p210BCR-ABL定位于細胞質(zhì)中，因而更容易與各種分子發(fā)生相互作用，尤其是信號轉(zhuǎn)導通路中的分子。作為癌蛋白，P210BCR-ACL可結(jié)合20多個細胞蛋白和（或）使其磷酸化。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）

13、的一個亞單位結(jié)合p210BCR-ABL;而BCR-ACL依賴性細胞株和原代CML細胞的增殖需要這種相互作用。 BCR-ABL作用于促絲裂素原活化蛋白激酶（MAPK）引發(fā)的信號通路和相互作用是多重和復雜的。 一種RAF編碼的絲氨酸 - 蘇氨酸激酶活性被p210BCR-ABL調(diào)節(jié)。RAF表達下調(diào)既抑制CML細胞的BCR-ABL依賴性生長，又抑制正常造血祖細胞的生長因子依賴性增殖。 BCR-ABL轉(zhuǎn)化細胞的效率受一種銜接蛋白的影響，這種蛋白可將酪氨酸激酶信號傳導至RAS。這一過程涉及生長因子受體結(jié)合蛋白2（GRB2）。p210BCR-ABL也激活RAS多重替代途徑。BCR-ABL可持續(xù)激活PI3K并

14、生成肌醇脂，且通過下調(diào)諸如PTEN和SHIP1等多聚磷酸肌醇抑癌基因而使PI3K失調(diào)。 在p190BCR-ABL轉(zhuǎn)基因小鼠的白血病組織中，Hef2也結(jié)合CRKL。Hef2基因編碼的蛋白可加速RAS編碼的蛋白和神經(jīng)纖維瘤蛋白的GTP水解，并參與整合素的信號通路。在造血細胞中，神經(jīng)纖維瘤蛋白通過RAS負向調(diào)控粒細胞- 單核細胞集落刺激因子（GM-CSF）的信號轉(zhuǎn)導。P62DOK，其酪氨酸處于持續(xù)磷酸化狀態(tài)，并與p120RAS GAP蛋白相聯(lián)結(jié)，在c-kit受體激活時發(fā)生快速酪氨酸磷酸化，也與ABL相關(guān)聯(lián)。 p210BCR-ABL介導的轉(zhuǎn)化也需要核因子（NF）-B的激活。p210BCR-ABL的表達

15、通過核轉(zhuǎn)移引起NF-B依賴性轉(zhuǎn)錄的激活。 表達p210BCR-ABL的細胞株也具有JAKS激酶、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子（STATs）（通常是STAT5）的持續(xù)活化。由BCR-ABL急性轉(zhuǎn)化的原代小鼠髓細胞中STAT5也被激活；p210BCR-ABL使IL-3的亞基、GM-CSF受體和JAK2磷酸化，并與其免疫共沉淀。ABL和BCR都是GTP結(jié)合蛋白家族Rho228,229和生長因子結(jié)合蛋白GRB2的多功能調(diào)節(jié)蛋白，GRB2將酪氨酸激酶與RAS聯(lián)系起來，并與BCR-ABL和核苷酸交換因子Sos形成復合物，導致RAS激活。加速期、急變期的發(fā)病機制 雖然酪氨酸激酶抑制劑治療顯著延長了慢性期向加速期和

16、原始細胞危象的發(fā)展，但這種轉(zhuǎn)變的風險仍然存在，因為經(jīng)BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑處理的CML干細胞未發(fā)生凋亡。 CML加速期的開始被認為出現(xiàn)在一個攜帶有BCR-ABL融合基因的粒 - 單核祖細胞。由慢性期CML轉(zhuǎn)變?yōu)榧铀倨诓⑦M而轉(zhuǎn)變?yōu)樵技毎Ｏ螅蛑苯佑陕云谵D(zhuǎn)變?yōu)樵技毎Ｏ蟊徽J為至少經(jīng)過以下7個分子過程：（1）成熟停滯，（2）基因組監(jiān)視失敗，（3）不能進行充足的DNA修復，（4）突變子表型出現(xiàn)，（5）端?？s短，（6）腫瘤抑制因子功能缺失，（7）未知因素。 由慢性期轉(zhuǎn)變?yōu)榧铀倨谶^程的顯著特點是BCR-ABL表達的增加。而在mRNA BCR-ABL轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基礎上，出現(xiàn)其他細胞遺傳學異常，

17、這種情況大約出現(xiàn)在50%-65%持續(xù)Ph染色體陽性的患者中。在原始細胞有淋巴細胞表型的CML急淋變中，約有50%的患者出現(xiàn)P16 / ARF基因突變，約有20%的患者發(fā)生Rb基因的突變。在原始細胞具有粒細胞表型的CML急粒變中，大約25的病例含有p53突變的細胞。通過敲除p53功能的轉(zhuǎn)基因小鼠實驗證實，p53功能的缺失具有促進人慢性期CML克隆轉(zhuǎn)化的作用。作為p53基因家族的一員，p51 / p63在CML慢性期并沒有突變，但在急變期，約有8的患者出現(xiàn)P51/P63的突變。 大約65的病人，除了有Ph染色體，還有其他細胞遺傳學的異常。雙Ph染色體，8號染色體三體和等臂染色體17p是最常見的繼發(fā)

18、性改變。異常的mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)物p210BCR-ABL見于轉(zhuǎn)化為急性白血病病人的骨髓和血細胞中。 極少數(shù)的病例在轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)BCR-ABL融合基因的缺失，mRNA的缺失以及具有酪氨酸激酶活性的P210表達的缺失，這些發(fā)現(xiàn)提示異常的蛋白激酶并不總在維持急性期階段狀態(tài)中發(fā)揮獨特的作用。相反，患者對于伊馬替尼的高反應率，盡管只是臨時的，提示突變的BCR-ABL產(chǎn)物通常在疾病的這一階段發(fā)揮重要的作用。 很多在急性轉(zhuǎn)化患者細胞內(nèi)檢測出的分子改變可能有助于CML克隆惡性行為能力的增加，包括N-RAS基因活化， p53基因重排，降鈣素基因的高甲基化，以及ABL1基因的甲基化。一項研究報道了17%的原始細胞危象患者有p53基因突變。還有報道視網(wǎng)膜母細胞瘤1基因產(chǎn)物在CML細胞的表達缺失和有巨核細胞表型的急變相關(guān)。P16抑癌基因純合子缺失與CML的淋系轉(zhuǎn)化有關(guān)。11p13染色體的WT基因編碼一個含鋅指模塊的轉(zhuǎn)錄因子，它只在轉(zhuǎn)化為急變期的CML病人中出現(xiàn)。CML急變期中還出現(xiàn)EVI-1基因的過度表達。BCL-2，c-Myc和其它