細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞增

1、細(xì)胞計(jì)數(shù)與細(xì)胞增殖金潔一、培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)觀察v體外培養(yǎng)的細(xì)胞主要有兩種狀態(tài)。一 種是能貼附在培養(yǎng)支持物上的細(xì)胞，如 HeLa 細(xì)胞、NH3T3等，叫貼壁型細(xì)胞，體外培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)都屬于這種細(xì)胞。另一種細(xì)胞并不貼附在容器的壁上，而是懸浮在培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，如 HL60，叫做懸浮型細(xì)胞，這類細(xì)胞主要是血液原性或癌原性的細(xì)胞。貼壁貼壁( (粘附粘附) )型細(xì)胞型細(xì)胞 粘附粘附: :是大多數(shù)有機(jī)體是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞細(xì)胞在體內(nèi)在體內(nèi) 生存生存和和生長(zhǎng)發(fā)育生長(zhǎng)發(fā)育的的基本存在方式基本存在方式基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，基于粘附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織， 有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)

2、胞必須有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須 粘附粘附于一于一固相表面固相表面 才能才能生存生存和和生長(zhǎng)生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)時(shí)：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后, ,同樣需要粘附于某同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而一固相表面才能生存和生長(zhǎng)，因而屬于粘附型細(xì)胞屬于粘附型細(xì)胞。粘附粘附( (錨定或錨著錨定或錨著) )依賴型依賴型( (性性) )細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能細(xì)胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細(xì)胞生存的細(xì)胞 類型類型 細(xì)胞在體內(nèi)、外細(xì)胞在體內(nèi)、外的的粘附粘附方式：方式：存在差異存在差異 體內(nèi)體內(nèi)：粘附粘附是是全方位全方位 外形外形具有具有復(fù)雜的立體特征復(fù)雜的立體特

3、征 體外體外：多數(shù)情況，細(xì)胞只有：多數(shù)情況，細(xì)胞只有一個(gè)附著平面一個(gè)附著平面 外形外形一般一般與體內(nèi)時(shí)明顯不同與體內(nèi)時(shí)明顯不同 按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為按照培養(yǎng)細(xì)胞的主要形態(tài)，可分為幾大類型幾大類型 分類分類 根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要根據(jù)形態(tài)大致的不同，主要2類：類： 上皮樣上皮樣 成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 其它，不定型其它，不定型上皮樣細(xì)胞型上皮樣細(xì)胞型 名稱：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全等于，實(shí)際上不完全等于-來源：來源：來源于外胚層來源于外胚層，內(nèi)胚層細(xì)胞，內(nèi)胚層細(xì)胞 如：皮膚及其衍生物如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤上皮性腫

4、瘤形態(tài)：形態(tài)：類似類似體內(nèi)的體內(nèi)的上皮細(xì)胞上皮細(xì)胞 扁平扁平，不規(guī)則多角形不規(guī)則多角形，中有圓形核，中有圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)生長(zhǎng)特點(diǎn) 易相連易相連成片成片 相靠相靠緊密相連緊密相連成薄層成薄層鋪石鋪石狀狀 生長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)呈時(shí)呈膜狀膜狀移動(dòng)移動(dòng) 很少很少脫離細(xì)胞群而脫離細(xì)胞群而單個(gè)活動(dòng)單個(gè)活動(dòng) 成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞 名稱：名稱：凡在凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的的來源：來源：由由中胚層間充質(zhì)組織起源中胚層間充質(zhì)組織起源的組織的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞

5、似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)的形態(tài) 胞體梭形胞體梭形或不規(guī)則三角形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出胞質(zhì)向外伸出23個(gè)個(gè)長(zhǎng)短不等的突起長(zhǎng)短不等的突起 中有卵圓形核中有卵圓形核生長(zhǎng)特點(diǎn)生長(zhǎng)特點(diǎn) 排列成排列成放射狀放射狀，漩渦狀，漩渦狀 并不緊靠連成片并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而細(xì)胞接觸易斷開而 單獨(dú)行動(dòng)單獨(dú)行動(dòng) 游離的游離的單獨(dú)的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，成纖維樣細(xì)胞， 常有幾個(gè)常有幾個(gè)伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起伸長(zhǎng)的細(xì)胞突起 培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)不穩(wěn)定血清血清 Hela 高血清高血清 低血清低血清 成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞 pH Hela 太酸或太堿太酸或太堿 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)pH 成

6、纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞 細(xì)胞密度細(xì)胞密度 3T3 低密度低密度 高密度高密度 成纖維細(xì)胞樣成纖維細(xì)胞樣 上皮樣細(xì)胞上皮樣細(xì)胞 生長(zhǎng)狀態(tài)改變生長(zhǎng)狀態(tài)改變 懸浮或貼附懸浮或貼附 懸浮懸浮 貼附貼附 圓形圓形 成纖維或上皮樣成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后轉(zhuǎn)化后 成纖維樣成纖維樣 可成上皮樣可成上皮樣 懸浮生長(zhǎng)型懸浮生長(zhǎng)型概念概念 培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)時(shí)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng) 或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)或以機(jī)械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長(zhǎng)來源來源自自血血，脾或骨髓，脾或骨髓， 尤以血中白細(xì)胞尤以血中白細(xì)胞 癌腫細(xì)胞也可能癌腫細(xì)胞也

7、可能特點(diǎn)特點(diǎn) 在在懸浮中生長(zhǎng)良好懸浮中生長(zhǎng)良好 細(xì)胞細(xì)胞圓形圓形，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)，單個(gè)或小細(xì)胞團(tuán)優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 生存空間大，生存空間大，提供數(shù)量大提供數(shù)量大 傳代方便傳代方便(不需消化不需消化) 易于收獲易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點(diǎn)缺點(diǎn) 觀察不方便觀察不方便 很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)很多細(xì)胞不能懸浮生長(zhǎng)(尤以正常細(xì)胞尤以正常細(xì)胞) 細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)觀察v貼壁細(xì)胞在生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，細(xì)胞內(nèi)顆粒少，看不到有空泡，細(xì)胞邊緣清楚，培養(yǎng)基內(nèi)看不到懸浮的細(xì)胞和碎片，培養(yǎng)液清澈透明，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)顆粒較多，透明差，空泡多時(shí)，表明生長(zhǎng)較差。當(dāng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基混濁時(shí)，應(yīng)想到細(xì)菌真菌污染的可能。懸浮細(xì)胞當(dāng)邊緣清楚，透

8、明發(fā)亮?xí)r，生長(zhǎng)較好；反之，則較差或已死亡。由于培養(yǎng)基內(nèi)有 pH 指示劑的存在，因此它的顏色往往可以間接地表明細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。呈橙黃色時(shí)，細(xì)胞一般生長(zhǎng)狀態(tài)較好；呈淡黃色時(shí)，則可能是培養(yǎng)時(shí)問過長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)不足，死亡細(xì)胞過多；如呈紫紅色，則可能是細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不好，或已死亡。 細(xì)胞污染細(xì)胞污染v細(xì)菌污染細(xì)菌污染v真菌污染真菌污染v細(xì)菌和真菌的清除細(xì)菌和真菌的清除v支原體污染支原體污染v支原體的清除支原體的清除細(xì)菌污染細(xì)菌污染 v細(xì)胞培養(yǎng)常見的污染v最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。 v培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。v污

9、染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡。 真菌污染真菌污染v真菌污染后，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，但最后由于營(yíng)養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。 ! 細(xì)菌和真菌的清除細(xì)菌和真菌的清除 使用抗生素v抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。（當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平）。v聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。v預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好，一般用雙抗生素。 v污染后清除用藥需采用大于常用量510倍藥物沖洗法，于加藥后作用2448小時(shí)，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效。959

10、5以上是以下四種支原體：以上是以下四種支原體：口腔支原體（口腔支原體（M.oraleM.orale）精氨酸支原體（精氨酸支原體（M.argininiM.arginini）豬鼻支原體（豬鼻支原體（M.hyorhinisM.hyorhinis）牛萊氏無膽甾原體（牛萊氏無膽甾原體（A.laidlawiiA.laidlawii）危害：危害：世界性問題，平均發(fā)生率達(dá)到世界性問題，平均發(fā)生率達(dá)到11%11%能改變細(xì)胞的能改變細(xì)胞的DNA,RNADNA,RNA及蛋白表達(dá)及蛋白表達(dá)不能通過可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)不能通過可視法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意污染對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)率影響較小，不易引起注意污

11、染來源：來源：操作環(huán)境不良操作環(huán)境不良操作人員的疏失操作人員的疏失實(shí)驗(yàn)器具不潔等實(shí)驗(yàn)器具不潔等已受污染的細(xì)胞已受污染的細(xì)胞已受污染的培養(yǎng)基、血清已受污染的培養(yǎng)基、血清支原體污染支原體污染熒光染色法熒光染色法電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡電鏡檢查：掃描電鏡、透射電鏡支原體培養(yǎng)支原體培養(yǎng)聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法法支原體污染檢測(cè)支原體污染檢測(cè)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液常常仍清亮但變黃細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液常常仍清亮但變黃,細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，部分細(xì)胞發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，部分細(xì)胞發(fā)生脫落等等，細(xì)胞間隙可見鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。生脫落等等，細(xì)胞間隙可見鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)。支原體污染表現(xiàn)支原體污染表現(xiàn)熒光染色法(33258)顯示染色體，細(xì)胞周

12、圍亮點(diǎn)為支原體掃描電鏡法顯示支原體，附于細(xì)胞表面眾多的圓形顆粒為支原體 支原體的清除支原體的清除 支原體清除劑支原體清除劑MRA （Mycoplasma Removal Agent）處理法）處理法每每4天換一次液，連續(xù)處理天換一次液，連續(xù)處理15天天清洗純化法清洗純化法v細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選細(xì)胞清洗細(xì)胞清洗反復(fù)離心洗滌反復(fù)離心洗滌 v原理：由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生，所以通原理：由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生，所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至極限過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)

13、量降低至極限. v如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。v對(duì)支原體最有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小的抑制作用。必要時(shí)更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過除菌的方法對(duì)支原體是沒有作用的。 藥物輔助高溫處理法藥物輔助高溫處理法先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41培養(yǎng)培養(yǎng)18小時(shí)，可殺小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。支原體特異性血清法支原體特異性血清法 用用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原的兔支原體

14、免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。個(gè)月后仍為陰性。 二、培養(yǎng)細(xì)胞的計(jì)數(shù)及活細(xì)胞的鑒定v在細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)中，往往要進(jìn)行活細(xì)胞的鑒定和細(xì)胞的計(jì)數(shù)、調(diào)整細(xì)胞的密度，是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)必不可少的一種基本技能。1細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)v將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。v將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。v靜置3分鐘。v鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：v 細(xì)胞數(shù)/ml（4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4）10000v注意

15、：鏡下偶見由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。2細(xì)胞活力細(xì)胞活力將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘。吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。另外，活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)的注意事項(xiàng)細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)的注意事項(xiàng)消化單層細(xì)胞時(shí)，務(wù)求細(xì)胞分散良好，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。否則會(huì)影響細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充

16、分混勻細(xì)胞懸液。在連續(xù)取樣計(jì)數(shù)時(shí)尤應(yīng)注意這一點(diǎn)。否則，前后計(jì)數(shù)結(jié)果會(huì)有很大誤差。鏡下計(jì)數(shù)時(shí)，遇見2個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)。如細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說明消化不充分。細(xì)胞數(shù)少于200個(gè)/10mm2或多于500個(gè)/10mm2時(shí)，說明稀釋不當(dāng)，需重新制備細(xì)胞懸液。在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液時(shí)，加液量不要溢出蓋片，也不要過少或帶氣泡。在計(jì)數(shù)過程中，對(duì)大方格的邊緣壓線細(xì)胞應(yīng)按數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。染色標(biāo)本在計(jì)數(shù)細(xì)胞時(shí)必須在15分鐘內(nèi)檢查計(jì)數(shù)完畢。因?yàn)榕_(tái)盼藍(lán)染液可以將死細(xì)胞迅速地染上藍(lán)色，再延長(zhǎng)時(shí)間則活細(xì)胞也將逐漸著色。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（MTT法）法）v(

17、一)原理vMTT分析法以活細(xì)胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑藍(lán)）為基礎(chǔ)。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C的作用下tetrazolium四唑環(huán)開裂，生成藍(lán)色的結(jié)晶，結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的結(jié)晶可以用DMSO來溶解，利用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。v(二)操作（實(shí)用于貼壁細(xì)胞）v1.接種細(xì)胞：用含10胎小牛血清

18、得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔100010000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul. 2.:培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)2-3天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。 3.顯色：分別培養(yǎng)不同時(shí)間，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.繼續(xù)孵育4小時(shí)，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。 4.比色：選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。v(三)結(jié)果v以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線或

19、計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率、細(xì)胞相對(duì)增殖率等。v【注意事項(xiàng)】v1.選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。邊緣孔用無菌PBS填充。2.避免血清干擾：一般選小于10的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在顯色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。3.設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，最后比色以空白調(diào)零。每組設(shè)定3復(fù)孔。4.MTT粉末和溶液保存時(shí)都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4C避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長(zhǎng)期保存，避免反復(fù)凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。 5.酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀使用前應(yīng)打開電源預(yù)熱半小時(shí)。v6.選擇不

20、同的波長(zhǎng)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)靈敏度不同。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇相應(yīng)的波長(zhǎng)。v7.懸浮細(xì)胞先用平板離心機(jī)離心96孔板，2000r，5分鐘?；蛴胏ck-8。CCK-8方法vCCK-8是一種基于WST-8的檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的方法。WST-8是一種類似于MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細(xì)胞增殖越多越快，則顏色越深；細(xì)胞毒性越大，細(xì)胞越少，則顏色越淺。對(duì)于同樣的細(xì)胞，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。通常96孔板每孔加入10%培養(yǎng)基體積的CCK-8，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5-4個(gè)小時(shí)，時(shí)間的長(zhǎng)短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情

21、況而定，初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在0.5、1、2和4小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm。 應(yīng)用舉例v1. MTT實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)v6孔板接種HCCLM3細(xì)胞，1*106每孔，后取1*107病毒每孔加入（LASS2與GFP對(duì)照），感染90分鐘后，再加入1ml的培養(yǎng)液，24h后，細(xì)胞用胰酶消化成細(xì)胞懸液，細(xì)胞調(diào)密度至1000每孔接種96孔平底板，每孔100 ul（邊緣孔用無菌PBS填充）。 5%CO2，37孵育24h后，每孔加入20ulMTT（噻唑蘭）溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150ul二甲基亞砜，37孵育15min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490

22、nm處測(cè)量各孔的吸光值。細(xì)胞分為3組：LASS2組，GFP組和不加病毒對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜）。連續(xù)檢測(cè)6天，OD值繪生長(zhǎng)曲線。v結(jié)果：LASS2腺病毒感染HCCLM3細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。采用Students t-test進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異有顯著性（p0.05）。培養(yǎng)液pH 值變化太快vCO2 張力不對(duì)，培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊，NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足，培養(yǎng)液中鹽濃度不正確，細(xì)菌、酵母或真菌污染v（1）按培養(yǎng)液中NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi)CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對(duì)應(yīng)CO2 濃度為5 到10。v（

23、2）改用不依賴CO2 培養(yǎng)液。v松開瓶蓋1/4 圈。v加HEPES 緩沖液至10 到25mM 終濃度。v丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但pH值不變v用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來，冰凍保存培養(yǎng)液v用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌。v將培養(yǎng)液加熱到37，搖動(dòng)使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時(shí)pH 發(fā)生變化v細(xì)菌或真菌污染v丟棄培養(yǎng)物，或用抗生素除菌。培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁v胰蛋白酶消化過度，支原體污染，培養(yǎng)液中無貼壁因子v縮短胰蛋白酶消化時(shí)間或降低胰蛋白酶濃度。v分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢v由于更換不同培養(yǎng)液或血清，培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長(zhǎng)必需成分，如谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染，試劑保存不當(dāng)。接種細(xì)胞起始濃度太低，細(xì)胞已老化，支原體污染。v比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。v增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度。v讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。v換入新鮮配制培養(yǎng)液。v補(bǔ)加谷氨酰胺或生長(zhǎng)因子。v用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻血清需保存在-5 到-20。培養(yǎng)液需在28避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在2-8保存，并在2 周內(nèi)用完。v增加接種細(xì)胞起始濃度，換用新的保種細(xì)胞。v分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。清潔支