人類基因組DNA提取

1、人類類基因組組DNA提取、限制性核酸內內切酶切割的原理、方法、瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳結結果分析及其應應用藥學藥學第二討論討論小組組人類基因組人類基因組DNADNA的提取的提取提取方法提取方法: :1從全血中提取2從口腔上皮脫落細胞，發(fā)根細胞中提取( (全血）原理：全血）原理：v細胞裂解液 ：裂解細胞膜，收集細胞核vSDS：破裂核膜v蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并從DNA上解離 下來v苯酚氯仿：抽提去除蛋白質v無水乙醇：沉淀DNAv75%乙醇：洗滌DNA沉淀真空干燥后，溶解于TE中即得到高分量的DNA（全血）操作方法：（全血）操作方法：細胞裂解與細胞裂解與RNaseRNase/ /蛋白酶蛋白酶K

2、 K 消化消化1. 取100 l抗凝全血置于1.5ml Eppendorf離心管中，再加入100 l裂解液和20 l RNaseA/蛋白酶K液，用移液器來回吹打混勻，室于55溫浴35分鐘，其間來回顛倒離心管幾次，直至溶液呈水溶狀。2. 加入10l 3M的NaAc(pH 4.8)，隨后加入1250 l結合緩沖液，充分振蕩混勻，12，000 rpm離心30秒。DNADNA與吸附柱結合與吸附柱結合3用移液器Tip轉移上清并加入到離心吸附柱（套好收集管）中，放置1分鐘，12，000 rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。注意：待轉移上清約1300l，離心吸附柱容量約650 l，故需每次轉移上清650

3、l到離心吸附柱中，離心，倒掉收集管中的廢液，重復實驗操作步驟3。DNADNA的純化的純化: : 4. 再加入600 l洗滌緩沖液（washing buffer）到離心吸附柱（套好收集管）中，12，000 rpm 離心30秒。5重復步驟4一次，12，000 rpm 離心3分鐘以充分除去洗滌緩沖液。 6小心取出離心吸附柱，棄收集管，將離心吸附柱套入一個干凈的1.5ml Eppendorf 離心管，并加入50 l洗脫緩沖液(elution buffer) 到離心吸附柱中(洗脫緩沖液一定要加在離心吸附柱的正中)，放置1分鐘，于12，000 rpm 離心30秒。7取出Eppendorf 離心管，其中便是

4、所提取基因組NA。口腔上皮脫落細胞）原理口腔上皮脫落細胞）原理 哺乳動物的一切有核細胞都可以用來制備DNA,除特殊要求外，白細胞，肝或脾組織是最常用的的材料。原始材料較少或較難獲得時（如羊水細胞），還必須經(jīng)過細胞培養(yǎng)來獲得足夠量的細胞，有時為了簡易，還可以無創(chuàng)傷的采集材料，如用口腔上皮脫落細胞，發(fā)根細胞。產前診斷所用的材料則為胎兒的羊水細胞或絨毛膜細胞； （口腔上皮脫落細胞）操作方法：（口腔上皮脫落細胞）操作方法：1、用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部，嘬咀，用分泌出的唾液反復漱口；將唾液吐到杯中。用生理鹽水洗滌，2000rpm離心10分鐘，倒掉上清液；重復1次。2、沉淀中加1ml 1細胞核裂解液

5、(STE)，打散細胞團、混勻，再加酶解混合液（含350l STE、150l 10% SDS和10l 20mg/ml蛋白酶K），搖勻，至出現(xiàn)粘稠透明狀。37溫箱過夜或5034小時。3、加等體積飽和酚（或1/3體積的飽和NaCl），輕搖混勻10分鐘，室溫2000rpm離心10分鐘，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一離心管（盡量避免吸取中間層），加等體積氯仿混勻5分鐘，室溫2000rpm離心5分鐘。5、重復步驟4一次。6、將上清移入另一離心管中，沿離心管壁向DNA溶液中加入2.5倍體積的無水乙醇，輕輕搖動離心管混和至體系完全均一，見白色絮狀DNA。用移液器吸頭挑出DNA沉淀，在新配制的70

6、%乙醇洗二次，室溫干燥5分鐘，再將DNA溶于20-100l TE中。7、TE溶解的DNA，在4下可保存一年，如要求長期保存，則需加2倍體積無水乙醇置-70保存。 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶一、概概念核酸酶內切酶外切酶限制性核酸內切酶：限制性核酸內切酶：能識別雙鏈能識別雙鏈DNA分子內部分子內部的特異位點并裂解的特異位點并裂解磷酸二磷酸二酯鍵酯鍵二、分類類v 分類依據(jù)：酶的基因、蛋白質結構、依賴的輔助因子及與DNA結合和裂解的特異性特性I類II類III類內內切酶的蛋白結構結構單單一多功能的酶內切酶和甲基化酶分開共同亞亞基的雙雙功能酶限制和修飾飾活性3種種不同的亞亞基單一成分2種種不同的亞亞

7、基所需輔輔助因子ATM,Mg2+,SAMMg2+ATM,Mg2+,SAM寄主特異異性位點識識別別序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG 切割位點在距離識別位點至少1000pb處隨機切開一條單鏈位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3端24-26pb處酶催轉換轉換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異異性位點寄主特異性位點寄主特異異性位點識別為識別為甲基化的序列進進行切割能能能序列特異異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用作用不大三、作用機制 以環(huán)狀或線性的雙鏈DNA

8、為底物，在合適的反應條件下，識別特定的核苷酸序列，使兩條核苷酸糖鏈上特定位置的磷酸二酯鍵斷裂，兩裂口之間的堿基對的氫鍵也隨之斷開，產生具有3-羥基和5-磷酸基的DNA片段。四、切割方法識別和切割位點 4-6個堿基對且具有回文序列的DNA片段 大多數(shù)酶是錯位切割產生5或者3黏性末端例如：EcoR I 切割后產生5黏性末端5-GAATTC-3 5-G AATTC-33-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5黏性末端黏性末端平末端平末端有一些酶沿對稱軸切斷DNA，產生的末端稱為平端或鈍端例如:SmaI同工異源酶同工異源酶 來源不同的酶，但能識別和切割同一位點 如BamH I 和Bst I(GGAT

9、CC)同尾酶同尾酶 有些限制性內切酶識別序列不同，但是產生相 同的黏性末端。 如BamH I（GGATCC）和 Sau3A I(NGATCN)瓊脂糖凝膠電泳結果分析瓊脂糖凝膠電泳結果分析瓊脂糖凝膠電泳結果分析瓊脂糖凝膠電泳結果分析瓊脂糖凝膠電泳結果分析 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠:天然瓊脂是一種多聚糖，主要由瓊脂糖及瓊脂膠組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構成的中性物質，不帶電荷。瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強酸性多糖，由于這些集團帶有點荷，在電場作用下能產生較強的電滲現(xiàn)象。 什么是瓊脂糖凝膠電泳？ 瓊脂糖凝膠電泳主要是應用瓊脂糖凝膠作為支持物的電泳法，借助瓊脂凝膠分子篩作用，核算片段因其分子量或者分

10、子形狀不同，電泳速度有差異而分離。這種技術是基因操作的一種方法。瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳原理v瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結構，物質分子通過時會受到阻力，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力,同時也由此造成了經(jīng)過一定時間的泳動后按大小形成的一條“條帶”。其中線狀的DNA可以通過。瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳原理: 核酸分子是兩性解離分子，在高于其等電點的電泳緩沖液中，其堿基不解離，而磷酸基團全部解離，核酸分子因而帶負電荷，電泳時向正極遷移使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質，發(fā)揮分子篩功能，使得大小和構象不同的核酸分子的

11、遷移率出現(xiàn)較大差異，從而達到分離的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。 瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離結果與瓊脂糖凝膠電泳對核酸的分離結果與核酸的分子量、分子構型和凝膠濃度核酸的分子量、分子構型和凝膠濃度密切相關。密切相關。 實驗證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對數(shù)成反比。通過比較標準物與未知片段的移動距離便可測出未知片段的大小。 但當DNA分子超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難講它們分開。1 1) )核酸的分子量核酸的分子量質粒DNA有三種形式v1、共價閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在v 2、開環(huán)DNA:質粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，

12、因此可以自由旋轉從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子 v 3、線性DNA:因質粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.2 2）核酸構型）核酸構型 不同構型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差別較大。在分子量相當?shù)那闆r下，不同構型的質粒DNA的移動速度次序為：共價閉環(huán)DNA直線DNA開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。這三種構型的相對遷移速率主要取決于凝膠濃度，同時也受到電流強度、緩沖液離子強度等的影響。 超螺旋DNA： 盡管質粒通常以開環(huán)的形式進行描述，然而在細菌細胞內DNA鏈即是盤繞在組蛋白周圍形成一種致密的結構。這就是所謂超螺旋結構，由于其結構致密，它在凝膠中的泳動速度最快。 線性DNA： 當DNA損傷在DNA雙

13、鏈相對應的兩條鏈上同時產生切口時，就會出現(xiàn)線性質粒DNA，這種DNA的泳動速率介于超螺旋與切口質粒DNA之間。開環(huán)DNA： 在質粒DNA復制過程中，拓撲異構酶I會在DNA雙螺旋中的一條鏈中引入一個切口，解開質粒的超螺旋。在質粒分離過程中由于物理剪切和酶的切割作用同樣也會在超螺旋質粒中引入切口從而產生松散的開環(huán)結構。這種形式的質粒遷移速率最慢，其“松散”的分子形式阻礙了它在瓊脂糖凝膠中的運動。 一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率不同。要有效地分離大小不同的DNA片段，需選用適當?shù)沫傊悄z濃度。3 3）瓊脂糖的濃度）瓊脂糖的濃度瓊脂糖凝膠電泳的應用。瓊脂糖凝膠電泳的應用。v

14、蛋白質和核酸，由于pH的不同帶有不同電荷，且在電場中受力大小不同，導致發(fā)生泳動的速度不同，最終可將其分離開來。v電泳緩沖液的pH在69之間，離子強度0.020.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達107bp的DNA片段。v電泳的緩沖液中充滿了離子，因此可以導電。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以

15、同樣的速率向正極方向移動瓊瓊脂糖凝膠電膠電泳注意點選擇合適的電泳方法v瓊脂糖凝膠電泳：一般的核酸檢測v聚丙烯酰胺凝膠電泳：高分辨率v脈沖凝膠電泳：DNA鏈巨大凝膠濃度 濃度通常在0.52%之間，低濃度的用于大片段核酸的電泳，高濃度的用于小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意：高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。 緩沖液: 常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。 注意：電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規(guī)則的D

16、NA帶遷移的現(xiàn)象。 電壓和溫度: 電泳時電壓不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30，對于巨大的DNA電泳，溫度應該低于15。 注意：如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象 DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計比較準確。需要注意的是Marker的電泳同樣要符合DNA電泳的操作標準。核酸染色劑劑 實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB） 溴化乙錠（EB）：是一種吖啶類染料，它在

17、紫外燈照射下能發(fā)射熒光，當DNA樣品在瓊脂糖凝膠中電泳時，瓊脂糖凝膠中的EB就插入DNA分子中形成熒光絡合物，使DNA發(fā)射的熒光增強幾十倍，電泳后就可直接紫外燈照射檢測瓊脂糖中的DNAv優(yōu)點：染色效果好，操作方便v缺點：穩(wěn)定性差，具有毒性。v注意：觀察凝膠時應根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，會出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。DNA樣樣品的純純度和狀態(tài)狀態(tài)v樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可以產生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。 乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。v變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。 用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性DNADNA的上樣的上樣 正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。 注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。瓊脂糖凝膠電泳操