原代細(xì)胞培養(yǎng)2015

1、定義和分類重要性常規(guī)方法注意事項(xiàng)示例 原代培養(yǎng)原代培養(yǎng) （primaryprimary cultureculture）從動物機(jī)體取出的進(jìn)從動物機(jī)體取出的進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生行培養(yǎng)的細(xì)胞群。生長緩慢，繁殖一定的長緩慢，繁殖一定的代數(shù)后（一般代數(shù)后（一般1010代以代以內(nèi)）停止生長。內(nèi)）停止生長。 細(xì)胞系細(xì)胞系（cellcell lineline）從腫瘤組織從腫瘤組織培養(yǎng)建立的培養(yǎng)建立的細(xì)胞群或培細(xì)胞群或培養(yǎng)過程中發(fā)養(yǎng)過程中發(fā)生突變或轉(zhuǎn)生突變或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，化的細(xì)胞，在培養(yǎng)條件在培養(yǎng)條件下可無限繁下可無限繁殖殖 細(xì)胞株細(xì)胞株（cellcell strainstrain）從原代培養(yǎng)細(xì)從原代培養(yǎng)細(xì)胞群中

2、篩選出胞群中篩選出的具有特定性的具有特定性質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)質(zhì)或標(biāo)志的細(xì)胞群，能夠繁胞群，能夠繁殖殖5050代左右，代左右，在培養(yǎng)過程中在培養(yǎng)過程中其特征始終保其特征始終保持。持。 相關(guān)概念如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)如何界定原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)原代細(xì)胞vs細(xì)胞系原代細(xì)胞的重要性原代細(xì)胞的重要性-研究應(yīng)用原代細(xì)胞的重要性-臨床應(yīng)用細(xì)胞治療細(xì)胞治療原代細(xì)胞的重要性-干細(xì)胞應(yīng)用原代細(xì)胞的重要性原代細(xì)胞的重要性- -腫瘤免疫細(xì)胞治療腫瘤免疫細(xì)胞治療CarT免疫治療，主要應(yīng)用在B細(xì)胞淋巴瘤治療中原代細(xì)胞培養(yǎng)的分類從健康植株的特定部位或組織，如根、莖、葉、花、果從健康植株的特定部位或組織，如根、莖、葉、花、果實(shí)、

3、胚珠、花藥和花粉等，選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料，實(shí)、胚珠、花藥和花粉等，選擇用于組織培養(yǎng)的起始材料，稱之為外植體。稱之為外植體。用一定的化學(xué)藥劑，最常用的有次氯酸鈉，升汞和酒精用一定的化學(xué)藥劑，最常用的有次氯酸鈉，升汞和酒精等對外植體表面消毒，建立無菌培養(yǎng)體系。嚴(yán)格控制無菌等對外植體表面消毒，建立無菌培養(yǎng)體系。嚴(yán)格控制無菌條件，這是獲得培養(yǎng)成功的重要一步。條件，這是獲得培養(yǎng)成功的重要一步。外植體塊在培養(yǎng)基上形成疏松的愈傷組織，由愈傷組織外植體塊在培養(yǎng)基上形成疏松的愈傷組織，由愈傷組織分化出芽并可誘導(dǎo)形成根的小植株。分化出芽并可誘導(dǎo)形成根的小植株。 1 1）植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)）植物細(xì)胞和組織

4、培養(yǎng)技術(shù) 2 2）動物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)）動物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù) 動物細(xì)胞的生長與培養(yǎng)動物細(xì)胞的特點(diǎn)動物細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)化程度高進(jìn)化程度高結(jié)構(gòu)、形態(tài)、成分復(fù)雜結(jié)構(gòu)、形態(tài)、成分復(fù)雜細(xì)胞間連接形式多樣細(xì)胞間連接形式多樣生長相對緩慢生長相對緩慢功能全面功能全面體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型 （一）貼附型（一）貼附型成纖維細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型上皮型細(xì)胞上皮型細(xì)胞游走細(xì)胞型游走細(xì)胞型多形型細(xì)胞多形型細(xì)胞（二）懸浮型（二）懸浮型（三）半貼壁型（三）半貼壁型（一）貼附型：（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長貼附生長，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，屬于貼壁依賴性細(xì)胞貼附貼附: :是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本

5、存是大多數(shù)有機(jī)體細(xì)胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本存在方式在方式結(jié)果結(jié)果: : 基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組基于貼附特性，使細(xì)胞與細(xì)胞之間相互結(jié)合形成組織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生織，有機(jī)體的絕大多數(shù)細(xì)胞必須貼附于一固相表面才能生存和生長。存和生長。培養(yǎng)時：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后培養(yǎng)時：這些細(xì)胞被放到體外環(huán)境中以后, ,同樣需要貼附于同樣需要貼附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細(xì)胞某一固相表面才能生存和生長，因而屬于貼附型細(xì)胞貼附貼附( (錨定或錨著錨定或錨著) )依賴型依賴型( (性性) )細(xì)胞細(xì)胞：唯有貼附于固相表面：唯有貼附于固相表面才

6、能生存的細(xì)胞才能生存的細(xì)胞1 1、成纖維細(xì)胞型：、成纖維細(xì)胞型：名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細(xì)胞類似的來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：來源：由中胚層間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨真正的成纖維細(xì)胞：心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)，胞體梭形或不胞體梭形或不規(guī)則三角形規(guī)則三角形，胞質(zhì)向外伸出，胞質(zhì)向外伸出2 23 3個長短不等的突個長短不等的突起，中有卵圓形核起，中有卵圓形核生長特點(diǎn)：排列成放射狀，生長特點(diǎn)：排列成放射狀，漩渦狀漩渦狀，并不緊靠連，并不緊

7、靠連成片，細(xì)胞成片，細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動，游離細(xì)胞接觸易斷開而單獨(dú)行動，游離的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突的單獨(dú)的成纖維樣細(xì)胞，常有幾個伸長的細(xì)胞突起起2 2、上皮型細(xì)胞、上皮型細(xì)胞：名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全名稱：僅形態(tài)上似體內(nèi)，實(shí)際上不完全相同相同來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞來源：來源于外胚層、內(nèi)胚層細(xì)胞, , 如：如：皮膚及其衍生物皮膚及其衍生物, ,消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡, , 上皮性腫瘤上皮性腫瘤形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，形態(tài)：類似體內(nèi)的上皮細(xì)胞，扁平，不扁平，不規(guī)則多角形規(guī)則多角形，中有圓形核，中有圓形核 生長特點(diǎn)：易相連成片，相靠生長特

8、點(diǎn)：易相連成片，相靠緊密相緊密相連連成薄層成薄層鋪石狀生長時呈膜狀移動，鋪石狀生長時呈膜狀移動，很少脫離細(xì)胞群而單個活動很少脫離細(xì)胞群而單個活動3 3、游走細(xì)胞型：、游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。別。4 4、多型細(xì)胞型：、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。 （二）懸浮型：（二）懸浮型：見

9、于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，見于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。來源：自血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞來源：自血，脾或骨髓，血中白細(xì)胞癌腫細(xì)胞特點(diǎn)：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)特點(diǎn)：在懸浮中生長良好細(xì)胞圓形，單個或小細(xì)胞團(tuán)常用分離方法常用分離方法血液細(xì)胞血液細(xì)胞梯度密度離心法梯度密度離心法免疫磁珠法免疫磁珠法流式細(xì)胞分選法流式細(xì)胞分選法機(jī)體組織機(jī)體組織組織塊直接培養(yǎng)法（機(jī)械法）組織塊直接培養(yǎng)法（機(jī)械法）酶消化法酶消化法胰酶胰

10、酶膠原蛋白酶膠原蛋白酶I I、IVIV等等梯度密度離心用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。常用的試劑：淋巴細(xì)胞分離液、常用的試劑：淋巴細(xì)胞分離液、Ficoll-PaqueFicoll-Paque等等免疫磁珠法流式細(xì)胞分選法血液細(xì)胞分離步驟組織細(xì)胞分離步驟細(xì)胞的培養(yǎng)和凍存細(xì)胞生長曲線細(xì)胞培養(yǎng)密度冷凍保存要點(diǎn)（1 1）冷凍過程要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘）冷凍過程

11、要緩慢，有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1 -1 到到 -3-3速度降溫，一直到速度降溫，一直到-80-80以下，然后直接放入液氮中長期保存以下，然后直接放入液氮中長期保存（2 2）凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于）凍存細(xì)胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于9090，無微生物污染。，無微生物污染。（3 3）細(xì)胞濃度控制在：）細(xì)胞濃度控制在：1 110106 61 110107 7/ml/ml。（4 4）使用高濃度血清（）使用高濃度血清（30%30%）（5 5）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（）使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑（DMSODMSO、甘油）、甘油）細(xì)胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑（細(xì)胞冷凍

12、保存液主要成分：冷凍保護(hù)劑（5-10%5-10%，培養(yǎng)基（，培養(yǎng)基（60%60%），血清），血清（30%30%）。）。冷凍保存細(xì)胞的解凍與復(fù)蘇（1 1）快速解凍）快速解凍（2 2）解凍操作過程動作要輕）解凍操作過程動作要輕特別注意：特別注意：l解凍時務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子將細(xì)胞解凍時務(wù)必注意安全，預(yù)防冷凍管爆裂。要帶手套，用鑷子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，放入冷凍管從液氮中取出，放入3737水浴中。切不可直接用手，以免凍水浴中。切不可直接用手，以免凍傷傷l冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污

13、染污染無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用免疫細(xì)胞治療免疫細(xì)胞治療干細(xì)胞治療干細(xì)胞治療CHOCHO細(xì)胞體系細(xì)胞體系特殊細(xì)胞培養(yǎng)：神經(jīng)干細(xì)胞等特殊細(xì)胞培養(yǎng)：神經(jīng)干細(xì)胞等典型原代細(xì)胞分離示例小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞的分離示例小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離示例人臍帶內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離示例酶消化法酶消化法總結(jié)無菌操作無菌操作環(huán)境、器材、實(shí)驗(yàn)操作環(huán)境、器材、實(shí)驗(yàn)操作培養(yǎng)基培養(yǎng)基有血清培養(yǎng)基有血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基無血清培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基特殊培養(yǎng)基分離方法分離方法細(xì)胞鑒定細(xì)胞鑒定形態(tài)、存活率、功能形態(tài)、存活率、功能凍存復(fù)蘇凍存復(fù)蘇Yrgene Primary cell solutionCryopreserved at early passageCells are frozen at P1 through P5Early passage material ensures higher viability and optimal plating efficiencyPerformance testedMedia, kit supplements and reagents are tested for optimal reliabilityGrowth and morphology are assessed to ensure all componen